霍亂毒素b和腸毒素b的肽片段作為疫苗佐劑的製作方法

2023-05-19 11:26:46 1

專利名稱：霍亂毒素b和腸毒素b的肽片段作為疫苗佐劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種物質。
具體而言，涉及一種醫藥中十分有用的能展示一種或多種性質的物質。
例如此物質能作為毒素引起的腹瀉的免疫調製劑和/或佐劑和/或者抑制劑。
具體而言，本發明涉及免疫調製物質在調節免疫應答，例如和自身免疫疾病相關應答的中的應用。
再具體而言，本發明涉及此物質作為佐劑和一種相關或無關抗原時一起的應用。
更具體而言，本發明涉及這種物質在抑制毒素引起的腹瀉中的應用。
本發明還涉及對能和此物質相互作用的試劑篩選的分析。
背景技術：
大腸桿菌(大腸桿菌)熱不穩定腸毒素(Etx)和它的同源物來源於霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的霍亂毒素(Ctx)都是和宿主細胞表面糖脂受體結合的蛋白毒素。每種毒素由六個非共價結合的多肽鏈組成，一個A亞基(27kDa)和五個B亞基(11.6kDa)，B亞基能和哺乳動物細胞表面GM-1神經節苷脂受體結合(Nashar et al 1996Proc Natl Acad Sci 93:226-230)。A亞基為毒性基團，有腺苷二磷酸(ADP)ADP-核糖基轉移酶活性，而B亞基(EtxB和CtxB)為無毒寡聚體，能結合和交聯細胞表面普遍存在的神經節糖苷脂GM-1，促使A亞基進入細胞。
同A亞基的弱免疫原性相比，EtxB和CtxB都有很強的免疫原性和各自的全毒素，當和無關抗原結合時，Etx和Ctx(包含A亞基和B亞基)是強有效的佐劑(Ruedl et al 1996 Vaccine 14:792-798；Nashar et al 1993 Vaccine 11:235；Nashar and Hirst 1995Vaccine 13:803；Elson and Ealding 1984 J Immunol133:2892；Lycke and Holmgren 1986 Immunology 59:301)。因為它們的免疫原性，EtxB和CtxB已被用作其它抗原決定簇和抗原的載體(Nashar et al 1993 ibid)，還被用作霍亂和大腸桿菌介導的腹瀉疾病的疫苗組分(Jetborn et al 1992 Vaccine 10:130)。
為了開發抗霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩定腸毒素的疫苗，一些關於EtxB和CtxB亞基的優勢免疫表位的研究已經進行。下面的公開內容顯示了這個領域已經進行的工作。
英國專利申請2415419A公開了一個霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩定腸毒素的合成疫苗，它包含一個載體和一段相當於CtxB序列的合成肽段的偶聯物。
WO85/02611公開了一個相當於EtxB特定序列的合成肽，被認為是一個有效的偶聯物或是產生抗B亞基抗體的活化組分，可以保護宿主動物不受腸毒素的侵染。
WO89/10967公開了一個胺基酸序列，代表CtxB的50-64位胺基酸，在疫苗形成中能和一個異種有機體，如鞭狀體(Flagellum)和沙門氏菌屬(salmonella)的表位結合，提供保護，從而不受異種有機體的侵染，或是有機體抗原引起的條件變化或紊亂。
WO90/03437涉及一個CtxB亞基與異種抗原的活性序列融合形成的雜種蛋白，異種抗原被認為在接種疫苗時有意義，尤其利於異種抗原在腸環境中的穩定。
WO94/06465涉及一個胺基酸序列，通過或不通過一連接物而連接到一個合適的載體上，這樣，連接了載體的胺基酸序列便能產生一個調理或保護性的免疫應答。
WO95/29701公開了一個霍亂弧菌(Vibrio cholera)的疫苗，它是一個包含霍亂毒素B亞基(CTB)或是它的一個合成肽段的偶聯物，例如CTP3，它包含連接到一個惰性載體上的B鏈的50-64位上的胺基酸。
WO96/26282公開了一個表達系統，它表達源於重組菌株博德特氏菌屬(Bordetella)的基因產品，這個基因產品可以是霍亂毒素分子。
WO96/34893公開了一個EtxB和CtxB的雜合分子，它能作為有效的疫苗阻止或治癒個體的腸毒素引起的疾病。
WO98/21344公開了一個插入了一個抗原肽的EtxB亞基，在宿主動物中，這個嵌合的抗原-EtxB分子能引起這個抗原肽的抗體反應。
這些研究涉及的是以下運用(ⅰ)包含CtxB/EtxB部分序列的肽段或(ⅱ)包含偶聯於第二實體(譬如一個抗原)的CtxB/EtxB序列的肽，第二實體能引起或放大對於該肽的免疫應答。因此這些文獻涉及優勢免疫表位CtxB/EtxB或其一部分在引起對這些亞基的免疫應答中的作用，增強由霍亂或大腸桿菌引起的腹瀉疾病的免疫性。WO91/07979公開了一個包含部分CtxB和一個目標抗原的表位的嵌合蛋白，其目的是作為疫苗在受試者中引起對這個抗原的免疫應答。在這一點上，CtxB的部分被用作佐劑而不是免疫調製劑。因此，上述文獻中沒有涉及到CtxB/EtxB或其一部分作為調節免疫應答的免疫調製劑的運用。
我們已指出在免疫紊亂時EtxB亞基能作為免疫調製劑。例如，我們已經在WO97/02045中公開了EtxB亞基能結合在哺乳類細胞表面的GM-1神經節苷脂受體上，這種結合對不同淋巴細胞有不同效果，包括CD8+T細胞的衰竭(depletion)和B細胞的激活。而EtxB蛋白突變體(G33D)(缺乏GM-1結合活性)則無上述效果。由於缺乏GM-1受體的結合能力的突變體(例如EtxB(G33D))不能作為佐劑或免疫調製劑，因而，這些實驗結果表明所有CtxB和EtxB相關的功能都在於CtxB和EtxB亞基和GM-1受體的結合能力，。這樣，到此為止可以說明CtxB和EtxB的免疫調製作用和其它作用都是通過和GM-1的結合介導的。直到現在，仍然沒有關於保留了GM-1受體結合能力卻沒有免疫調製作用的CtxB/EtxB突變體的報導。然而我們卻驚奇的發現，並不是所有的CtxB和EtxB的作用都通過GM-1的結合來介導。
發明概述根據本發明，我們發現CtxB和EtxB的免疫調製作用和其它一些功能並不是通過GM-1結合介導。本發明的各方面將在權利要求書和以下描述與討論中述及。
在本發明的一個方面，本發明提供了一種物質，該物質包括如下一或多種一段包含有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的序列，或其變體，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模擬物；此物質能以相同或相似於CtxB或EtxB的方式起作用；但這種物質沒有GM-1的結合活性。
在本發明的一個優選的方面，本發明提供了一種物質，該物質包括如下一或多種包括SEQ ID No.2所示序列的胺基酸序列，或其變體，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模擬物；該物質能以EtxB和/或CtxB環相同或相似的方式起作用；但該物質不和GM-1結合。
在本發明高度優選的一個方面，本發明提供了一種物質，該物質包括如下一或多種包含有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的序列，或其變體，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模擬物；此物質能以相同或相似於CtxB和/或EtxB上的β4-α2環的方式起作用；但這種物質沒有GM-1的結合活性。
本發明中的物質可以是一段胺基酸序列或其化學衍生物。這個物質可以是一段合成肽或合成肽的變體，譬如retroinverso D肽。這種物質甚至可以是一個有機化合物或其它化學物質。以下的實例為SEQ ID No.2的模擬物。
本發明中的物質以相同或相似於CtxB或EtxB的方式作用。
「相同或相似」是一個定性而不是定量的含義。從這一點來講，它可以有增強的結合力。
一種物質是否以相同或相似於CtxB或EtxB的方式作用的測定可以由本領域的技術人員很容易的確定。例如，這個測定可以是測量或決定它對細胞種群的影響，如淋巴細胞種群。這種影響可以包括但不僅僅局限於CD8+T細胞凋亡的誘導，CD4+T細胞激活的增強和B細胞的多克隆激活。另外，這種測定也可以建立在細胞表面標誌物的決定和測量的基礎上，這些標誌物能顯示胞內一定事件的激活(例如測定CD25表達的增加)。
本發明中的物質沒有GM-1的結合活性。
GM-1結合活性的缺乏由本領域的測定可以由本領域的技術人員很容易的確定。例如，可以將GM-1結合在一個固相支持物上，讓這種物質流過已被結合的GM-1，這種物質的洗脫液顯示其不能和GM-1結合。在一個更優選的方面，該測定如WO97/02405中所述。
應當指出這種結合能力並不必依賴於全長CtxB或EtxB亞基的原初結合事件。帶有全長CtxB或EtxB亞基時，原初結合活性是GM-1的結合活性。從這一點來講，這種物質可以執行單一的結合事件。然而，這種物質可以擁有一種或多種結合能力。
優選地，這種物質是基本上分離的和/或基本上純的。
這裡，「分離的」和「純的」是指分子，無論是核酸或胺基酸序列，它們被從其自然環境中分離，或至少從它們原本結合的成分中隔離或分離出來。一種蛋白可以和載體或稀釋劑混合，但不影響這種物質所需的特性且還可以被看作是基本上分離的。
此發明基於這樣一個驚人的發現一些能和GM-1受體結合的突變體缺乏免疫調節作用。這些突變體促進了CtxB或EtxB亞基作用機制，尤其是它們的免疫調節作用的闡明。
本發明的其它方面如下所述本發明的物質應用於醫藥。
本發明的物質用作免疫調節劑。
本發麵的物質用作佐劑。
本發明的物質用作毒素引起的腹瀉的抑制劑。
本發明的物質，其中該物質還包括一個抗原或抗原決定簇。
一種藥物組合物，包括本發明的物質，視需要而定還可以混合有一或多種藥學上可以接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
本發明的物質在製備用於治療和/或預防和/或調節免疫紊亂和/或毒素介導的紊亂相關的疾病和/或紊亂的藥物中的應用。
一種用於確定一種或多種能夠和本發明的物質相互作用和/或影響本發明的物質的試劑的測定方法；其中所述測定包括將本發明的物質和待測試劑相接觸；以及然後確定是否該試劑能夠影響該物質。
一種用來本發明的測定方法所鑑定的試劑。
一種治療方法，包括向需要治療和/或預防和/或調節免疫紊亂和/或毒素介導紊亂相關的疾病和/或紊亂的受試者施用本發明的物質。
這些方面將在以下各段的標題中有所呈現。但是，每一段落講授的內容並不局限於標題。
免疫調節劑這裡的「免疫調節劑」指一種物質能通過誘導調節免疫應答，例如，對細胞如淋巴細胞的不同影響——優選地誘導CD8+細胞凋亡和/或CD4+細胞激活的增強和/或B細胞的多克隆激活。
「對白細胞的不同影響」可以包括但不僅僅局限在CD8+T細胞的耗盡(例如通過凋亡)，CD4+T細胞激活的增強和/或B細胞的相關激活。
優選地，免疫調節劑能對Th1和/或Th2相關的免疫應答病理反應進行負調。
優選地，免疫調節劑也能對黏膜表面抗體的產生進行正調。
佐劑這裡，佐劑是指能非特異性增強對抗原的免疫應答的物質。
它也包括能影響一個實體，譬如抗原和/或抗原決定簇免疫應答程度的任一物質，通過改變抗原的抗原性，或是改變特定的反應力或宿主相關機制非特異性效應物，誘導宿主細胞中的免疫應答和/或是引導其到特定的方向。更為優選的一面，佐劑能用作黏膜佐劑。
優選地，佐劑能延長哺乳動物的抗原呈遞或是提供一個持續的免疫記憶。
抗原這裡，「抗原」指一個實體，當它被引入免疫活性宿主中，能刺激產生特定的抗體或是能和此實體結合的抗體。這個抗原可以是純的物質，該物質的混合物或可溶性或顆粒狀物質(包括細胞或細胞碎片)。從這一點來說，這個詞包括任一適合的抗原決定簇，自身抗原(auto-antigen)，自身抗原(self-antigen)，交差反應抗原，同種抗原，異種抗原，耐受原，變應原，半抗原和免疫原，或為其一部分，也可以為其組合物，這些詞通篇可以相互換用。
「變應原」包括任一能刺激變應反應及I型超敏反應的抗原。
一般的變應原來源於但不僅僅局限於豚草，黑麥，偃麥草，野燕麥，梯牧草，狗牙根(Bermuda)，旱地早熟禾，mugwortalder，樺樹，歐洲榛，山毛櫸，柏樹，櫟，橄欖，麴黴類，枝孢類，鏈格孢類，擔孢子，子囊菌麥，黑麥，oatcat，狗，馬，兔，豚鼠，倉鼠，鸚鵡，鴿子，鴨子，雞，屋塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus)，粉塵蟎(D.farinae),Euroglyphus maynei，蟑螂，蒼蠅，蝗蟲，蠓，海鮮，豆科植物，花生，堅果，穀類，日用農產品，蛋，水果，西紅柿，蘑菇，酒精飲料，咖啡，巧克力，青黴素，磺胺藥物和其它抗生素，柳氮磺胺吡啶，氨甲醯苯，蜜蜂，黃蜂，螞蟻和蚊子，血清，疫苗，造影劑，藥物(包括抗氣喘藥物和抗生素)。抗原決定簇「抗原決定簇」在這裡指抗原上能被抗體或T細胞受體識別的位點。優選地，它是來自蛋白抗原的小肽或其一部分。該術語也包括糖肽和糖類表位。它還包括被修飾了的胺基酸序列或能刺激識別整個有機體反應的碳水化合物。
如果這個抗原決定簇是一個能引起傳染病的感染原(譬如細菌和病毒)的抗原決定簇，那將更為有利。
例如，如果這個感染原是EBV，那抗原決定簇將是gp340或gp350或一個潛伏蛋白的抗原決定簇(譬如EBNAs 1,23A,3B,3C和-LP,LMP-1,-2A和2B或是EBER)。如果感染劑是流感病毒，那抗原決定簇可以是一個外殼蛋白的(例如血細胞凝集素和神經氨酸酶)抗原決定簇，或是內部蛋白(如核蛋白)的抗原決定簇。如果感染劑是挑選自致腸病的，產腸毒素的，侵襲腸黏膜的，腸出血的，腸聚集性大腸桿菌中的，那抗原決定簇可以是細菌毒素或是粘連因子的抗原決定簇。
如果抗原決定簇來源於自身抗原，也是有利的。
試劑試劑可以是胺基酸序列或其化學衍生物。這種物質可以是有機化合物或其它化學物質。這種試劑可以是有義或反義核苷酸序列，也可以是抗體。在一個優選的方面，這種試劑可以是能與這種物質結合的細胞受體。
毒素引起的腹瀉的抑制劑術語「毒素引起的腹瀉的抑制劑」包括任一能影響Etx/Ctx全毒素活性的物質，它可避免Etx/Ctx的病理效果，譬如腹瀉。
發明詳述本發明展示以下的驚人發現(ⅰ)本發明的物質能作為毒素引起的腹瀉的免疫調節劑和/或佐劑和/或抑制劑，它能影響腸毒素介導的腹瀉。
(ⅱ)本發明的物質能以相同或相似於CtxB/EtxB的方式作用。本發明涉及的物質的活性由「所謂的」CtxB和EtxB上的β4-α2環來介導，這個環很靈活，含有45-65個胺基酸序列。
(ⅲ)EtxB分子在β4-α2環上的三個不同的位點發生突變(51,56和57位)，它保持GM-1結合活性，但是缺少其它活性，譬如毒性，對CD25的正調能力，和對CD8+T細胞凋亡的誘導。另外，包含突變B亞基的Ctx全毒素也能誘發生電氯化物的分泌，這是介導腹瀉的最初分泌事件。這些結果是出人意料的，因為通常認為易變的環只在連接二級結構的兩個部分時起作用，本身很少具有重要的功能。
(ⅳ)這種物質的結合能力並不必依賴於全長的CtxB和EtxB的初始結合事件。帶有全長的CtxB和EtxB時，初始結合活性是GM-1的結合活性。
CtxB/EtxB毒素這裡，「Ctx」是指霍亂毒素，「CtxB」指霍亂毒素的B亞基。在其它文章裡，它們可能被分別稱作CT,Ct,CTB或CtB。
這裡，「Etx」是指大腸桿菌熱不穩定腸毒素，「EtxB」指Etx的B亞基。在其它文章裡，它們可能被分別稱作LT,Lt,LTB或LtB。
β4-α2環一方面，本發明涉及一種包含EVPGSQH(SEQ ID No2)序列的物質，它的作用方式與EtxB或CtxB相同或相似，或其變體，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模擬物，但缺乏GM-1結合能力。
不拘於原有理論的基礎上，我們認為五個EtxB/CtxB亞基對GM-1的結合力為一種很強的相互親和力，這使得EtxB/CtxB有相對較弱的第二結合力。這種結合是由EtxB/CtxB上的β4-α2環來介導的。EtxB/CtxB上的β4-α2環的結構可參見(Sixma etal.J.Mol.Biol(1993)230；890-918)上的Etx分子結構，如

圖1所示。
總之，Etx或Ctx的每一個B亞基都包含一個N-末端螺旋(α1)，兩個三鏈反向平行摺疊(摺疊Ⅰ，包括鏈β2,β3,β4；摺疊Ⅱ，包括鏈β1,β5,β6)和一個長的α-螺旋(α2)。這兩個β摺疊組成一個β桶。根據摺疊的兩個末端，B亞基中連接二級結構這些部分的環被分為兩類。亞基的一個末端，「窄」(或「A」)端，環比較短，包括β1-β2,β3-β4和α2-β5連接及C-末端；亞基的另一端較寬，環較長，連接二級結構元件α1-β1,β2-β3,β4-α2。連接β4-α2的長環(以下稱β4-α2環)，包括51位穀氨酸(Glu 51)到59位的天冬氨酸(Asp59)，一直延伸到β摺疊平面下。這個環非常靈活，但據(Sixma et al(Nature(1992)355；561-564)，當此環和乳糖結合後，靈活性會明顯降低。本發明展示EtxB/CtxB的β4-α2環，有第二結合活性，所以當它被從EtxB/CtxB分子的其它部分(例如肽)分離出來即缺乏第一結合活性時，它會展示第二結合活性。有選擇性地突變β4-α2環，或環上一肽段，可以來開發增強第二結合力。通過增強第二結合力，和GM-1的相互作用可以進一步排除。
這裡，「EtxB/CtxB的β4-α2環」是負責毒素如霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩定腸毒素B亞基第二結合活性的實體。當β4-α2環被從EtxB/CtxB分子的其它部分(例如肽段)分離出來即缺乏第一結合活性時，它會展示第二結合活性並在下文中稱為活性或結合活性。
優選地，本發明的物質包含一個分離的EtxB/CtxB β4-α2環。
優選地，這種物質包含一個分離的EtxB/CtxB β4-α2環的模擬物。
優選地，這種物質包含有高度親和結合活性的分離的EtxB/CtxBβ4-α2環的模擬物。
優選地，這種物質包含一段5-40個胺基酸的肽。
優選地，該肽所含胺基酸少於25個。
如果該肽是融合蛋白，優選地，該肽含有25個以上胺基酸。
優選地，這種物質包含序列VEVPGSQHIDSQ(SEQ ID No3)。
優選地，這種物質包含序列GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI(SEQ IDNo4)。
優選地，這種物質包含大腸桿菌表達的豬的EtxB45-65殘基衍生物序列GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI(SEQ ID No5)。
優選地，這種物質包含大腸桿菌表達的人的EtxB45-65殘基衍生物序列。
胺基酸序列本發明提供一種包含本發明的胺基酸序列的物質，這段胺基酸序列能作為由毒素引起的腹瀉的免疫調節劑和/或佐劑和/或抑制劑，這種物質能影響腸毒素介導的腹瀉疾病。這種物質也能用於對能與這種物質相互作用的和/或影響該物質一種或多種試劑的測定。
這裡，「胺基酸序列」指肽，多肽序列，蛋白序列或其部分。
影響術語「影響」包括物質活性的調節，例如處理，阻抑，遏制，提高，恢復，升高，修飾。
術語「修飾」包括但不僅僅局限於物質活性的消失，沉默，突變，去除，增強，增高，刺激，拮抗，減少或阻滯。
變體/同源物/衍生物發明優選的胺基酸序列為SEQ ID No2,SEQ ID No3,SEQ ID No4,SEQ ID No5或源於本發明物質的序列，也包含了從其他來源而得的同源物如相關的病毒/細菌蛋白，細胞同源物和合成肽，以及其變體和衍生物。
因而，本發明涵蓋了這裡所述胺基酸序列的變體，同源物或衍生物，也包含了編碼這些胺基酸序列的核苷酸序列的變體，同源物或衍生物。
在本發明的上下文中，指在胺基酸水平上和如序列表所示的SEQID No 2的至少7個胺基酸有至少75％,85％或90％，優選至少95或98％一致性的胺基酸序列。尤其是，特別要考慮到對於與EtxB/CtxB相同或相似活性有重要作用的區域(如51,56,57位的胺基酸)，而不是臨近非重要區域的序列同源性。儘管同源性可以被認為是相似性(例如胺基酸殘基具有相似的化學性質/功能)，但本發明中，序列相同尤指表達的同源性。同源性比較可用肉眼或使用已有的序列比較軟體。這些商業化的計算機軟體可以比較兩個或更多的序列間的同源百分比。
同源百分比也可以通過連續序列進行計算，如一個序列與其他序列對比，其胺基酸序列直接同其他序列中相應的胺基酸進行比較，每次比較一個胺基酸殘基，這稱為「無缺口對比「，很明顯，這種方法僅適用於相對較少的殘基數。
儘管這種方法相對簡單和一致，但它沒有考慮到，如在相同配對的序列中，一個插入或缺失便會導致隨後的胺基酸殘基置於對比之外，因此當採用總體序列對比時，會導致同源性百分比的降低。相應地，大部分的序列比較方法考慮到了可能的插入和缺失，設計了最適的對比，而對整體同源性得分沒有過分的減分。這通過在序列對比中插入「缺口」(gap)，來增大局部同源性而完成。
然而這些更為複雜的方法對對比過程中的每一個缺口設計了「缺口補償」(gap penalty)，因而對於相同數目的相同胺基酸，儘可能使用少量缺口的序列對比反應兩個比較序列之間的相關性-要比具有更多缺口的對比比率高。「遠交缺口值」顯著用作缺口的存在和缺口中每個隨後胺基酸的較小補償時所要的相對較高的值。這是很常用的缺口得分系統。高的缺口補償當然會產生具有少數缺口的合適對比。大多數的對比允許缺口補償被修飾。然而，使用這些軟體時，最好使用預設值。例如使用GCG Wisconsin Bestfit程序包(見下)，胺基酸序列的預設缺口補償是每一缺口為12，每一延伸為4。
考慮到缺口補償，最大同源性的計算首先需要合適的對比的產生。攜帶如此對比的電腦程式有GCG Wisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin,U.S.A；Devereux et al,1984，核酸研究12:387)其它可以用來進行序列對比的軟體包括但不限於BLAST軟體包(參見Ausubel等.,1999 ibid-chapter 18)),FASTA(Atschulet al,1990,J.Mol.Bio.,403-410)和GENEWORKS對比工具，BLAST和FASTA都可以在線或不在線檢索。(見Ausubel et al.,1999ibid,pages 7-58到7-60)。然而，優選使用GCG Bestfit程序。
儘管最終同源性可以以相同性來測量，對比過程本身顯然不建立於全部或全無的配對比較上，事實上，在化學相似性和進化距離的基礎上，規模化的相似值矩陣常用於每一配對比較的排列值。此矩陣的實例如常常使用的BLOSUM62矩陣——BLAST程序的預設矩陣。GCGWisconsin程序使用公共預設值，如果可能，還可使用用戶符號對比表。(見用戶手冊詳述)。優選運用GCG程序包的公共預設值，或其他軟體中的預設矩陣，如BLOSUM62。
一旦軟體生產出合適的對比，便可能計算同源性百分比，尤其是序列相同百分比。軟體將此作為序列比較的一部分去完成，得出一數值結果。
與本發明物質，SEQ ID No 2,SEQ ID No 3,SEQ ID No 4和SEQID No5相關的「變體」或「衍生物」包含了保留活性的實體序列的任何替代，變體，修飾，取代，或一個或(多個)胺基酸的缺失，增加，優選至少要具有相同和/或相似與CtxB和EtxB的活性。
本發明中SEQ ID No 2,SEQ ID No 4或SEQ ID No 5可以被修飾。顯然，修飾用於加強物質的活性。胺基酸可以被替代，如從1,2或3到10或20的替代使修飾的序列保持活性。
本發明中的物質也可以發生胺基酸殘基的缺失，插入或替代，產生沉默的變化和功能相同的物質。可以在保留物質的第二結合活性的前提下，具有相似極性，電荷，溶解性，疏水性和/或親水性的胺基酸殘基進行替代。例如帶負電荷的胺基酸包括穀氨酸和天冬氨酸；帶正電荷的胺基酸有賴氨酸和精氨酸；還有具有相同疏水性非極性基團的胺基酸亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
保守替代可以根據下表進行。第二列中同一方塊中的胺基酸可以互相替代，優選第三列中的同一方塊中的胺基酸進行替代。
核苷酸序列一方面，本發明提供編碼本發明物質的核苷酸序列，本發明的物質，可以作為模板或靶向物用於分析(例如酵母雙雜分析)鑑定影響此物質的一種或多種試劑和/或其衍生物。
這裡，術語「核苷酸序列」指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多聚核苷酸序列，變體，同源物，片段和其衍生物(例如其一部分)。核苷酸序列可以是基因組或重組的單鏈或雙鏈DNA和RNA，或為有意鏈或為無意鏈或其結合，優選地，核苷酸序列通過重組DNA技術進行製備(如重組DNA)。
優選地，「核苷酸序列」意指DNA。
編碼核苷酸序列的物質可以同於其天然發生的形式。優選地，編碼此物質的序列為非天然的核苷酸序列，或為其變體，同源物，片段或衍生物。因而，優選實施方案中，本發明不包括天然環境下，由其天然啟動子控制的相應與本發明的核苷酸編碼序列。我們將此優選方案稱為「非天然核苷酸序列」。
這裡，「天然發生」指具有自然界發現的一種胺基酸序列的物質。
這裡，「生物學活性」指具有天然物質的調節或生物化學功能的物質。
變體/同源物/衍生物與本發明的SEQ ID No1核苷酸序列相關的「變體」，「同源物」，「衍生物」，包括了編碼具有活性的物質的合成核苷酸序列的一個或多個核苷酸的替代，變異，修飾，替換，丟失或增加，具有活性的物質至少具有與序列表中的SEQ ID No 2,SEQ ID No 3,SEQ ID No 4及SEQ ID No 5相同的活性。
如上所述，與序列表所列序列有同源性的序列，至少有70％同源性，優選80％的同源性，或者更優選有90％的同源性。更優選具有95％的同源性，進一步優選具有98％的同源性。核苷酸同源性比較可以如上進行。如上所述的序列比較程序即GCG Wisconsin Bestfit程序。預設值矩陣對於每一個相同的核苷酸的匹配值為10，對每一非匹配胺基酸值為9。對每一個核苷酸而言，預設缺口產生補償為50，預設缺口延伸補償為3。
本發明也包括能夠選擇性與這裡的序列雜交的核苷酸序列，或任何其變體，片段或衍生物，或上述的組合。核苷酸序列優選至少15個核苷酸，更優選地，至少20,30,40或50個核苷酸。
這裡「缺失」指核苷酸序列或胺基酸序列中一個或多個核苷酸或胺基酸殘基的變化，尤其是缺失。
這裡，「插入」或「增加」指核苷酸序列或胺基酸序列中，與天然的物質相比，一個或多個核苷酸或胺基酸殘基的增加。
這裡，「替代」指一個或多個核苷酸或胺基酸為不同的核苷酸或胺基酸代替。
雜交這裡，術語「雜交」包括「一條核苷酸鏈與另一條鏈鹼基互補配對的過程」，以及以多聚酶鏈式反應(PCR)技術進行的擴增過程。
本發明的核苷酸序列可以選擇性地同這裡公開的核苷酸序列或其互補序列雜交。一般至少與這裡公開的核苷酸有75％，優選至少85％或90％，更優選地有95％或98％的同源性。包括至少20個，優選25或30個，更優選至少40,60或100或更多的連續核苷酸。本發明優選的核苷酸序列包含與SEQ ID No1核苷酸同源的區域，優選至少與SEQ ID No1有80％或90％，更優選有95％同源性的區域。
「選擇性雜交」指本發明的模板核苷酸序列在顯著高於本底情況下與探針雜交時，核苷酸序列作為探針。本底的產生是由於其他的核苷酸序列例如cDNA或基因組DNA文庫被檢測到。在這一事件中，本底包含有探針同文庫中非特異性DNA相互作用產生的信號，這一信號要比靶DNA的特異性反應低10倍，優選地，低100倍。反應的強度可以檢測，如；通過放射性標記如32P。
如Berger和kimmol所講，雜交條件基於核苷酸結合複合體的解鏈溫度(Tm)(1987,Guide to Molecular CloningTechniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,SanDiego CA)，象如下所述，被稱為「嚴緊性」。
最大嚴緊性大約發生在Tm-5℃(低於探針的Tm值5℃)；高嚴緊性大約低於Tm5℃到10℃；中等嚴緊性大約低於Tm10℃到20℃；低嚴緊性大約低於Tm20℃到25℃。如本領域技術人員所周知的那樣，最大嚴緊性雜交用於鑑定或檢測相同核苷酸序列，而中等嚴緊性雜交(或低嚴緊性)用於鑑定或檢測相似或相關核苷酸序列。
優選地，本發明包括了在嚴緊情況下(如65℃,0.1×SSC{1×SSC=0.15NaCl,0.015 M檸檬酸鈉pH7.0｝)與本發明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。無論本發明的核苷酸序列為雙鏈，雙螺旋的雙鏈，還是兩者的複合物，均包含於本發明中。核苷酸序列為單鏈時，可以認為核苷酸序列的互補序列也被包含於本發明中。
表達載體本發明的核苷酸序列可以被參入到一個重組複製載體中。載體可以用於複製和/或表達相適宿主細胞中的或源於其的核苷酸序列。使用包含啟動子/增強子和其他表達調節信號來控制表達。啟動子可以為原核啟動子或在真核細胞中起功能的啟動子。也可以使用組織特異性或刺激特異性啟動子。源於上述兩種或更多不同的啟動子的嵌合啟動子也可以使用。
依賴於所用序列和/或載體，宿主重組細胞產生的物質可以被分泌出或包含於胞內。物質編碼序列可以被設計為含有直接將物質編碼序列分泌穿過真核或原核細胞細胞膜的信號序列。
融合蛋白為了便於提取和純化，本發明的物質也可以以融合蛋白的形式生產，融合蛋白的配對體(partners)可以為穀胱甘肽S-轉移酶(GST),6×組氨酸，GAL4(DNA結合和/或轉錄激活區域)和β-半乳糖苷酶。可以在融合蛋白配對體(partners)和所感興趣的蛋白之間加入一個蛋白水解位點以便於融合蛋白序列的去除。優選地，融合蛋白不應阻礙包含本發明胺基酸序列的物質的活性。
本發明的一個實施方案中，融合蛋白包含了和本發明物質融合的抗原或抗原決定簇。在該實施方案中，融合蛋白是包括能夠做為廣泛刺激免疫系統的佐劑的物質的非自然產生的融合蛋白。抗原或抗原決定簇粘附於該物質的氨基或羧基末端。
本發明的另一實施方案中，本發明的物質可以被連接到一個編碼融合蛋白的異源序列上，例如為了篩選影響物質活性的試劑的肽庫，極有用的是編碼一個可以表達被工業化抗體識別的異源表位的嵌合物質。
另一實施方案中，使用結合融合蛋白可以分析鑑定如靶受體等試劑，或是能夠調節CD25轉錄活性的試劑。
抗體本發明的一個實施方案中，本發明的物質可以是抗體。該抗體可以作為本發明的模擬物。
抗體可以通過標準的技術，如利用本發明物質進行免疫或運用噬菌體展示文庫而生產。
「抗體」，除非具體指某一相反的意思，包括但不僅僅局限於多克隆抗體，單克隆抗體，嵌和物，單鏈，Fab片段和由Fab表達文庫產生的片段。這些片段包括與靶物質具有結合活性的完整抗體的片段，Fv,F(ab』)和F(ab』)2，以及單鏈的抗體(scFv)，構成抗體的抗原結合位點的融合蛋白和其他的合成蛋白。此外，抗體和其片段可以為人源化的抗體，例如物質A-239400中所述。中和抗體，如抑制物質多肽生物學活性的抗體，尤其適用於診斷和治療。
在一個實施方案中，本發明也為本發明的物質如多肽和其片段提供了單克隆抗體或多克隆抗體。因而，本發明為物質的單克隆抗體或多克隆抗體如本發明的多肽，提供了一個生產途徑。
多克隆抗體如果要製備多克隆抗體，選擇哺乳動物(如小鼠，兔子，山羊，馬等)，以從可鑑定的試劑和/或本發明的物質而得到的具有表位的免疫源性多肽進行免疫，依據所用宿主的種屬性，加入不同的佐劑提高免疫反應。這些佐劑包括但並不局限於，弗式佐劑，礦質膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂和pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔血藍蛋白，二硝基苯酚，BCG(卡介苗)和白喉毒素(小棒狀桿菌)。如果純化的多肽物質運用於免疫損傷的個體，刺激其系統防禦，上述物質將是極有潛力的人類佐劑。
免疫血清收集後以已知的程序進行處理，如果含多克隆抗體的血清中，除了含有源於某一可鑑定的試劑和/或本發明物質的表位外，還包含其他抗原的抗體，可以經過免疫親和層析對其進行純化。生產和純化多克隆抗體抗血清的技術在本領域是眾所周知的。為了製備這類抗體，本發明還提供了作為動物及人免疫原的其他多肽半抗原化的本發明多肽及其片段。
單克隆抗體直接結合於源於可被鑑定的試劑和/或本發明物質的表位的單克隆抗體也可以以本領域技術人員熟知的技術生產。通過雜交瘤製備單克隆抗體的方法已廣為人知，永久抗體生產細胞系可以通過細胞融合，也可以通過其他技術如B淋巴細胞同致癌DNA或EB-病毒的直接轉化來產生，所產生的一系列結合orbit表位的單克隆抗體可以被篩選用於不同的性質測定如同種型和表位親和性。
物質和/或本發明試劑的單克隆抗體的製備可以通過培養連續細胞系中抗體分子的生產技術而獲得。這包括但不僅僅包括Koehler,Milstein(1975 Nature 256:495-497)所述的雜交瘤技術，人類B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，〔1983〕Immunol Today 4:72,Cote et al(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)和EBV-雜交瘤技術(Cote et al(1985)Monoclonal AntibodiesTherapy,Alan R Liss Inc,pp77-96)，此外，也可運用「嵌合抗體」生產技術，鼠抗體基因與人抗體基因的剪接獲得具有適宜抗原特異性和生物學活性的技術(Morrison et al(1984)Nature 312:604-608；Takeda et al(1985)Nature 314:452-454)。單鏈抗體生產的技術(美國專利號4,946,779)適用於生產物質特異性單鏈抗體。
直接結合源於可鑑定試劑和/或本發明物質的表位的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，尤其在診斷中被加以運用。那些中和抗體則在被動免疫治療中有運用。單克隆抗體尤其適用於抗獨特型抗體的種植(raising)。抗獨特型抗體是一種具有設計被保護的物質和/或試劑「內部影象」(「internal image」)的免疫球蛋白。種植抗獨特型抗體的技術在本領域中已廣為人知，這些抗獨特型抗體因而很有意義。
抗體也可以通過淋巴細胞群的體內誘導或篩選重組免疫球蛋白文庫或如Orlandi et al(1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837)和Winter G和Milstein et al(1991,Nature 349:293-299)所展示的具有高度特異性結合試劑的一組實驗獲得。
包含物質特異性結合位點的抗體片段也可以產生。例如這種片段包括但不局限於經胃蛋白酶水解抗體分子而得的(Fab』)2片段，Fab片段可以通過減少(Fab』)2的二硫鍵而獲得。Fab表達文庫利於使具有所需特異性的多克隆Fab片段的鑑定簡單，易行(Huse WD et al(1989)Science 256:1275-1281)。
免疫調製物質分析免疫反應的免疫調製可以通過轉錄情況進行測定，如通過測定相連接的報導基因的信號分析CD25細胞表面標記物的轉錄活性。
報導基因優選的報導基因可以提供方便的可測信號，可被用於本發明的分析方法中，(例如光譜學)。例如一個報導基因可編碼一種可催化改變光吸收特性的酶。
報導基因的實例包括但不僅僅局限於β-半乳糖苷酶，轉化酶，綠色螢光蛋白，螢光素酶，氯黴素，乙醯轉移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，外切葡聚糖酶和葡糖澱粉酶。放射性標記或者螢光標記的核苷酸可以參入到新生的轉錄本中，在結合到寡核苷酸探針時被鑑定出來。
在一優選的實施方案中，報導基因分子的產生由報導基因產物的酶活性如β-半乳糖苷酶來測定。
毒素誘導腹瀉的抑制劑的分析本發明的物質或其衍生物或同源物和/或表達本發明的物質或其衍生物或同源物的細胞系可用於能夠影響物質活性的試劑的篩選(如抗體，肽，有機分子或非有機分子)。例如任何可以抑制物質活性的試劑可以作為毒素誘導的腹瀉的抑制劑來篩選，從而鑑定可以影響霍亂和/或腸毒素介導的腹瀉疾病。
在一個實施方案中，本發明的篩選可以鑑定本發明物質的拮抗劑，如能夠作為毒素誘導的腹瀉抑制劑的抗體，肽，或小有機分子試劑分析噬菌體展示可以用於試劑的鑑定，例如通過可與相結合的細胞表面受體。這種受體的陽性鑑定利於運用組合文庫鑑定具有同本發明物質相同或相似功能的模擬物。
噬菌體展示是一個運用重組細菌噬菌體的分子篩選的程序，本技術包括了將可以同目的物質(或其衍生物或同源物)或編碼相同序列的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)反應的適宜配基(本例中為候選試劑)的編碼基因轉化到細菌噬菌體中。轉化的細菌噬菌體(優選粘附於一固相支持物)表達合適的配體(例如候選試劑)，並且展示於其噬菌體外殼。具有識別候選試劑的目的物質分子的實體(如細胞)被分離和擴增。獲得的候選試劑進行特徵鑑定。噬菌體展示相對於標準的配基親和力篩選技術有優勢。噬菌體表面以三維構相，更接近於其自然構相的形式展示候選試劑，這便使得篩選的目的更具有特異性和更高的結合親和力。
模擬分析在一實施方案中，本發明的篩選可以鑑定本發明物質的模擬物，如抗體或其他具有免疫調製和/或佐劑效果的化合物。
這類模擬物可以單獨或與其他治療法共同用於本發明的疾病的治療。
篩選本發明的物質可以在任何一類藥物篩選技術中用於鑑定免疫調製劑，佐劑，類似物或/和毒素引起的腹瀉抑制劑。運用於篩選的物質可以是溶液狀的，固著於固相的支持物，承載於細胞表面，或位於細胞內。物質活性的喪失或物質與待測試劑間結合複合體的形成可以被檢測。
另一個用於高通量篩選的技術具有同物質的適宜結合力，依據於在WO84/03564中詳述的方法。
本發明的分析方法將適於待測化合物的小量或大量篩選及定量分析。
藥物組合物本發明還提供一種藥物組合物，包括施用治療有效量的本發明的物質和藥學上可以接受的載體，稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。
藥物組合物包括應用於人或動物的人用藥或獸用藥，一般還包括一種或幾種藥學上可以接受的載體，稀釋劑或賦形劑。藥學上可以接受的載體，稀釋劑或賦形劑廣為藥學領域人員所熟知，並被記載在諸如Remington’s Pharmceutical Sciences,Mack PublishingCo.(A.R.Gennaro 1985年版)中。藥學上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑的選擇依賴於欲給藥方式和標準的藥學實踐。藥物組合物還可能包含(或額外包含)載體，賦形劑或任何合適的粘合劑，潤滑劑，懸浮劑，包埋劑，增溶劑。
防腐劑，穩定劑，染料甚至加味劑都可被應用於藥物組合物中。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉，山梨酸和對羥基苯甲酸酯。抗氧化劑和懸浮劑也可被用於藥物組合物之中。
根據不同的給藥系統，可能有不同的組成/配方要求。例如，本發明的藥物組合物可製成小泵或因黏膜途徑而製成噴鼻，或製成氣霧劑而吸入，或製成可攝入的溶液，或因腸胃外吸收而製成可注射試劑，例如靜脈，肌肉或皮下注射。或者，藥物組合物也可設計成兩種給藥方式。
當藥劑經由胃腸黏膜給藥時，它應該在轉運至胃腸道的過程中保持穩定。例如，它必須抗蛋白水解，酸性pH穩定和抵抗膽汁的降解。
配伍合適的話，此藥物組合物可被以下列方式施用吸入，栓藥或陰道藥栓，一般是洗液，溶液，霜劑，油膏或撒布粉，皮膚貼劑，以加入澱粉或乳糖等賦形劑製成的藥片的形式口服，加入或不加賦形劑製成的膠囊，陰道栓劑，添加增色劑或加味劑的酏劑或懸浮液；也可腸胃外注射，例如，靜脈、肌肉或皮下注射。對於腸胃外給藥，藥物組合物最好製成無菌水溶液的形式，該水溶液還可能含有其他物質，如足量的鹽和單糖以維持溶液和血液等滲。對於口服或舌下給藥，組合物可據常規方法製成片劑或錠劑給藥。
疫苗在本發明實施方案之一中，此物質作為佐劑摻入到用來對抗自身免疫疾病、人T細胞白血病、器官移植排斥和過敏性或傳染性疾病的疫苗組合物中。
在本發明的另外的實施方案中，疫苗組合物還可能額外的包含抗原或抗原決定簇。適合的抗原或抗原決定簇公開在WO99/34817。
優選地，疫苗組合物包含有抗原或抗原決定簇。
優選地，抗原為自身抗原或其同源物。
優選地，本發明的一種或多種物質被用於治療性或預防性疫苗的製備。
「預防性疫苗」是指被用於正常個體來阻止疾病發展的疫苗。
「治療性疫苗」是指被用於已感染個體來祛除或減少感染，或者被用來取消疾病的免疫病理學過程的疫苗。
包含一種或多種物質作為活性成分的疫苗的準備方法是廣為此領域技術人員所知的。代表性地，這種疫苗被用於注射，那它應該是液體溶液或懸浮液；而在用於注射的液體溶液或懸浮液之前的固體形式也應該準備。疫苗也可以製備成乳化或被脂質體包被的蛋白的形式。活性組分常常與藥學上接受的且和活性成分相容的賦形劑混合。例如，適合的賦形劑有水，鹽溶液，葡萄糖，甘油，乙醇等等，或其組合。
另外，如果願意，疫苗還可包含微量的潤溼劑或乳化劑和pH緩衝劑等輔助物質。
疫苗化合物還可能包含用來增強疫苗效果的佐劑。有效的佐劑有如下幾種，但不限於這幾種氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁鉀，硫酸鈹，二氧化矽，高嶺土，碳，油包水乳化劑，水包油乳化劑，胞壁醯二肽，細菌內毒素，脂類X，瘡皰丙酸桿菌(Propionbacterium acnes)，百日咳桿菌，多核糖核苷酸，藻酸鈉，羊毛脂，溶血磷脂酸，維生素A，皂苷，脂質體，左旋咪唑，DEAE-葡聚糖，嵌段共聚體或其他合成佐劑。這些佐劑可從多種商業途徑得到。例如，Merck Adjuvant65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)或Freund’s IncompleteAdjuant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)典型的，一般使用Amphigen(水包油)，Alhydrogel(氫氧化鋁)，或兩者的混合物。只有氫氧化鋁被允許用於人類。
給藥一般地，適合個體的實際劑量由醫生決定，並隨年齡、體重、具體病人而變化。下列劑量是平均個例的典型用量。當然，個別例子中也可能出現高或低於上述劑量。
本發明化合物可被用於直接注射。此組合物可經由腸胃外，黏膜，肌肉，靜脈，皮下或經皮給藥。典型地，每種蛋白質的給藥量為每公斤體重0.01-30毫克，優選為0.1-10毫克，每公斤體重0.1-1毫克最為優選。
「給藥」包括經過病毒和非病毒途徑。病毒遞送機制包含但不限於以下幾種載體腺病毒載體，腺相關病毒載體，皰疹病毒載體，反轉錄病毒載體，慢病毒載體和杆狀病毒載體。非病毒遞送機制包括脂介導的轉染，脂質體，免疫脂質體，脂轉染試劑，表面陽離子親水脂分子及其組合。這些遞送機制路徑包括但不限於從黏膜，鼻，口，腸胃外，胃腸，局部或舌下遞送。
「給藥」包括但不限於利用噴鼻或氣霧劑吸入的經黏膜的途徑；通過靜脈、肌肉或皮下的注射形式的腸胃外途徑。
「共給藥」是指為獲得必要的免疫系統調整而額外加入抗原和/或抗原決定簇，它們和本發明的任一種物質在同一時間，同一位點施用於個體。然而，雖然此物質可與抗原在同一時間，同一位點共給藥，但此物質和抗原在不同時間，不同位點給藥也會有一定優點。此物質和抗原甚至可被在同一媒介物內遞送。此物質和抗原可以耦連和/或非耦連和/或基因水平上耦連和/或非耦連。
抗原決定簇和肽或同源物或模擬物可以以單一劑量或多劑量單獨給藥或共給藥。
本發明中的疫苗組合物可通過不同的途徑給藥，如注射(包括腸胃外給藥，皮下和肌肉注射)，經鼻，黏膜，器官，陰道內，尿道或眼部給藥。
包含本發明中物質的疫苗一般通過胃腸外給藥，例如通過皮下或肌肉注射。適合另外給藥方式的配方包括栓劑和在某些個例中應用的口服劑等。對栓劑而言，傳統的粘合劑和載體包括聚亞烷基二醇或甘油三酯；這些栓劑大都製成活性組分佔0.5％-10％，一般在1％-2％的混合物。對口服劑而言，正常應用的賦形劑包括藥用級的甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等等。這些複合物的形式可以為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋或粉劑。這些製劑含10％到95％的活性成分，優選25％至70％。當疫苗組合物製成凍乾粉時，在給藥前凍乾粉應重建成諸如懸浮液的形式。優選在緩衝液中的重建過程。
有關疾病本發明中涉及的物質常被用於治療或阻止自身免疫病，人T細胞白血病，器官移植排斥，異源或異種移植，移植物抗宿主病(GVHD)，過敏或傳染性疾病。傳染性疾病是指在感染過程中，感染性因子象其他免疫病理學機制疾病一樣結合到結腸，尤其是黏膜的疾病。
本發明涉及傳染性疾病包含但不限於HSV-1,HSV-2,EBV,VZV,CMV,HHV-6,HHV-7和HHV-8，肝炎A,B,C,D和E，奈瑟球菌腦膜炎，流感嗜血桿菌B和肺炎鏈球菌，嗜肺軍團菌和結核分枝桿菌，奈瑟球菌淋病，HIV-1,HIV-2和沙眼衣原體，大腸桿菌，輪狀病毒，腸炎沙門氏菌，傷寒桿菌，幽門螺桿菌，螺桿菌，空腸彎曲菌和霍亂弧菌，金黃葡萄球菌，膿鏈球菌，齒斑葡聚糖鏈球菌，瘧疾，錐蟲病，Taxoplasma gondii,Leishmaniadonovani和盤絲蟲病。
本發明涉及的過敏性失調的例子包含但不限於下列疾病哮喘，過敏性咳嗽，過敏性鼻炎和結膜炎，特異性溼疹及皮炎，蕁麻疹，昆蟲叮咬過敏症，飲食及藥物過敏。
自身免疫疾病的例子包含但不限於以下幾種，如類風溼性關節炎，多發性硬化及糖尿病。
試劑盒本發明進一步提供了包含本發明物質的診斷用試劑盒。這些試劑盒被應用於阻止和/或治療和/或調整本發明的疾病。
在本發明的實施方案之一中，試劑盒還包含有抗原和/或抗原決定簇和/或單獨的佐劑，以供治療和預防的共給藥。
另外地，試劑盒還可能以本發明涉及的抗體的形式提供本發明的模擬物，它可結合到固體支持物和/或同合適的試劑，對照，說明等一起包裝到試劑盒中。
小結簡言之，本發明涉及一種物質，它包含下列一種或幾種一種胺基酸序列，其中包含公開在SEQ ID NO.2中的序列，或它的變體，同源物，片段，衍生物，模擬物，這些物質能夠以與EtxB和CtxB相同的方式起作用；但同時這些物質不具有GM-1結合活性。
本發明還涉及一種測定方法，此方法用於測定一或多種試劑是否可以和本發明的物質相互作用或影響本發明的物質，其中所述測定包括所述物質與待測試劑相接觸，然後確定這些試劑是否影響所述物質。
本發明涉及另外一些方面被列舉如下1．一種肽，包含EVPGSQH序列，或它的同源物或模擬物。
2．1中的肽段，包含EVPGSQHIDSQ序列。
3．2中的肽，包含GATFQEVPGSQHIDSQKKAI或GETFQEVPGSQHIDSQKKAI序列。
4．一種預防或治療性組合物，包含上述1-3中的肽或他們的同源物或模擬物。
5．一種4中所述的預防或治療性組合物，還包含抗原或抗原決定簇。
6．一種4或5中所述的預防或治療性組合物，同時應用治療性或預防性試劑作為佐劑和免疫調節劑。
7．一種4或5中所述的預防或治療性組合物，同時應用治療性或預防性試劑來向上調節黏膜表面的抗體的產量。
8．一種4或5中所述的預防或治療性組合物，同時應用治療性或預防性試劑來延長抗原呈遞並維持哺乳動物受試體的免疫記憶。
9．一種4或5中所述的預防或治療性組合物，同時應用治療性或預防性試劑來下調與Th1和Th2相連的免疫反應的病理學成分。
10．一種4到9中所述的預防或治療性組合物，被用於治療或阻止自身免疫疾病，人T細胞白血病，器官移植，GVHD或傳染性疾病。
11．一種預防或治療性組合物，包含能特異性結合到EtxB或CtxB的β4-α2環上的試劑組分。
12．一種11中所述的預防或治療性組合物，其中的試劑組分為抗體。
13．一種11或12中預防或治療性組合物，被用於治療腹瀉。
14．一種被用於疾病治療的疫苗組合物，包含1-3種所述的肽段或它的同源物或模擬物。
15．一種14中所述的疫苗組合物，還包含抗原決定簇。
16．一種14或15中所述的疫苗組合物，用於治療或阻止傳染性疾病，自身免疫疾病，人T細胞白血病，器官移植，GVHD等。
17．一種試劑盒，包含任何4-13所述的治療或預防性組合物。
本發明將被通過下列實施例具體描述，並參考附圖。
圖1顯示了EtxB/CtxB的B亞單位立體帶形圖。(引自Sixma等，J.Mol.Biol.(1993)230:890-918，圖標引者所加)。
圖2顯示了與CD8+T細胞凋亡有關的CtxB的環狀殘基。
圖3顯示了CD8+T細胞凋亡缺陷B亞基突變體仍保留有結合細胞表面受體的能力。
圖4顯示了10ugB亞單位經鼻免疫時，小鼠血清的EtxB和CtxB(H57S)的整體免疫球蛋白水平。
圖5顯示了EtxB和CtxB的His-57決定佐劑活性必須的區域。
圖6顯示了E51-158B亞基肽段具有誘導CD8+T細胞免疫調節的能力。
實施例實施例1Glu-51-Ile-58環上殘基觸發白細胞免疫調節作用的鑑定NIH雄性小鼠處死，取腸繫膜淋巴結組織放入Hanks平衡鹽溶液(HBSS中無鈣離子和鎂離子，並加入20mM Hepes)。通過尼龍篩輕輕擠壓從纖維組織中分散出淋巴細胞，HBSS洗三次，將淋巴結細胞用Eagle改良培養基(Gibco)懸浮，此培養基含20mM Hepes,4mM L-穀氨醯胺，100IU/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素，5×10-5M2-巰基乙醇，細胞濃度控制在2*106細胞/ml。然後加入或不加入3.45μM(40μg/ml)的野生型EtxB或CtxB，或各種B亞單位突變體，如EtxB(G33D),CtxB(E51A),CtxB(V52A),CtxB(P53A),CtxB(G54A),CtxB(S55A),CtxB(Q56A),CtxB(H57A)或CtxB(I58A)37℃溫育96小時。然後，用0.4ml HBSS/20mM Hepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗並懸浮細胞，按1/400加入藻紅素(PE)耦連的抗-CD8和FITC-耦連的抗-CD4，冰浴30分鐘。抗體孵育後，細胞懸液用ISOTON洗一次，並用ISOTON 0.4ml重懸。每組樣品挑10,000例做FACS分析，結果用WinMDI軟體處理。圖2左上示FITC-耦連的抗-CD4；右下示藻紅素耦連的抗-CD8。每圖表示出百分數。
結果1如圖2所示，野生型EtxB或CtxB使CD8+T細胞減少；而在PBS(對照)或EtxB突變體(EtxB(G33D)不能結合到細胞表面的神經節苷脂上)存在的情況下則不發生此現象。CtxB(E51A)和CtxB(H57A)也不能觸發CD8+T細胞減少；另外，CtxB(V52A)和CtxB(I58A)引起觸發CD8+T細胞減少的部分缺陷。這些結果顯示E51和H57在觸發對淋巴細胞的調節作用上起重要作用，而V52和I58則起著輔助作用。
實施例2B亞單位缺陷突變體在CD8+T細胞凋亡中保持結合細胞表面受體的能力
NIH雄性小鼠處死，取腸繫膜淋巴結組織放入Hanks平衡鹽溶液(HBSS中無鈣離子和鎂離子，並加入20mM Hepes)。通過尼龍篩輕輕擠壓從纖維組織中分散出淋巴細胞，HBSS洗三次，淋巴細胞重懸於300ml預冷並脫氣的MACS緩衝液(PBS,5mM EDTA,0.5％BSA,pH7.2)中。向細胞中加入50ml抗CD4和抗B220MACS抗體，通過磁性MACS負性選擇純化出CD8+T細胞。將CD8+T細胞用Eagle改良培養基(Gibco)懸浮，此培養基含20mM Hepes,4mM L-穀氨醯胺，100IU/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素，5×10-5M2-巰基乙醇，細胞濃度控制在2×106細胞/ml。然後加入或不加入3.45μM(40μg/ml)的野生型EtxB或CtxB，或各種B亞單位突變體，如EtxB(G33D),CtxB(E51A),CtxB(V52A),CtxB(P53A),CtxB(G54A),CtxB(S55A),CtxB(Q56A),CtxB(H57A),EtxB(H57S)或CtxB(I58A)37℃冰育20分鐘。然後，用冰上預冷的0.4ml HBSS/20mM Hepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗並懸浮細胞，按1/500加入抗EtxB單克隆抗體118-8和EtxB,EtxB(G33D),EtxB(H57S)孵育；按1/800加入抗CtxB單克隆抗體LT-39和CtxB及其突變體孵育。30分鐘後，用0.4mlHBSS/20mM Hepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗並懸浮細胞，並加入FITC標記的抗鼠IgG抗體，二抗孵育30分鐘。細胞懸液用ISOTON(Becton-Dickinson)洗一次，並用ISOTON 0.4ml重懸。FACS分析顯示的FITC螢光強度代表EtxB,CtxB及其突變體結合CD8+T細胞的能力。每組樣品的10,000例顯示CD8+T細胞在不存在B亞單位的螢光對結合在B亞單位的螢光強度。
結果2如圖2所示，所有B亞單位，除無結合能力突變體EtxB(G33D)外結合CD8+T細胞能力相同。結合了CtxB(H57A)和EtxB(H57S)的可探測螢光強度稍高於野生型B亞單位說明這兩種突變體有著更高的細胞表面親和力。本結果和CtxB(H57A)、EtxB(H57S)與GM-1包埋的微量滴定板有更高的親和性，胞質團表面共振測定其與GM-1有更高的Kd值的結果一致。(數據未顯示)實施例3EtxB的His-57殘基為誘導強烈的抗EtxB反應所必須取8組NIH雌小鼠經鼻免疫10ugEtxB或EtxB(H57S)20μl，在一周內分三次免疫。第三次免疫後的14天處死經心穿刺取血。用1μg/mlEtxB包被的微量滴定板經GM-1-ELISA的方法分析抗EtxB IgG的水平。終點滴定法確定。(等於吸收值高於本底0.1的稀釋)結果3如圖4所示經鼻免疫接種EtxB出現高抗EtxB IgG抗體滴定血清(滴度為5757+/-785)；而免疫接種EtxB(H57S)則誘導出顯著(p=0.001)低的反應(滴度為1205+/-222)。
實施例4EtxB和CtxB的His-57殘基為B亞單位作為黏膜佐劑所必須取8組NIH雌小鼠經鼻免疫10ug卵清蛋白或在混有EtxB,CtxB,EtxB(H57S)或CtxB(H57A)的情況下免疫10μg卵清蛋白，20μl,在一周內分三次免疫。另外，兩組僅經鼻免疫EtxB或CtxB，作為陰性對照。第三次免疫後的14天處死經心穿刺取血。用5μg/ml卵清蛋白包被的微量滴定板經ELISA的方法分析抗卵清蛋白IgG的水平。終點滴定法確定。(等於吸收值高於本底0.1的稀釋)結果4如圖5所示，和僅用卵清蛋白免疫小鼠相比，野生型EtxB和CtxB作為黏膜佐劑，大大地增加了抗卵清蛋白反應(比較泳道4,5和泳道1)。相反，當卵清蛋白混有EtxB(H57S)(泳道6)或CtxB(H57A)(泳道7)時，抗卵清蛋白反應強度小於野生型B亞單位觸發的反應。數據顯示CtxB(H57A)無佐劑活性。本結果更證明B亞單位E51一I58環的重要性和H57殘基在介導分子的免疫調節功能上的重要作用。
實施例5和EtxB和CtxBE51-I58環相對應的一段合成肽段EVPGSQHI具有免疫調節功能。
為研究和EtxB和CtxBE51-I58環相對應的一段合成肽段是否引起CD8+T細胞減少，按實施實例1中的方法分離腸繫膜淋巴細胞，加不同濃度(0.1μM-20μM)合成肽段EVPGSQHI或隨機選擇的對照肽段IRNETTTTKGDYC溫育。37℃,96小時後用0.4ml HBSS/20mMHepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗並懸浮細胞，然後經FACS分析得出CD4+和CD8+細胞的相對比例，具體方法見例1。經合成肽段EVPGSQHI(實心圓點紅色曲線)或隨機選擇的對照肽段(實心墨色正方形曲線)處理後CD8+細胞的百分比對不同濃度做圖(圖6)。
結果5圖6中所示結果說明合成肽段EVPGSQHI引起CD8+T細胞減少，而對照處理則無。這說明和EtxB和CtxBE51-I58環相對應的一段合成肽段EVPGSQHI對淋巴細胞產生免疫調節功能。
本說明書提到的所有出版物在此引入作為參考文獻。在不違背本發明範圍和精神的前提下由本領域技術人員所做的多種修改和變化顯而易見是合適的。儘管本發明在描述時結合具體的實施方案，也不應據此認為本發明僅局限於上述具體的實施方案。實際上，對分子生物學或相關領域熟練人員來說，本發明的上述實施方案是顯見的。多種多樣的修改將被包含在隨後的權利要求書內。
序列表SEQ ID No 1GAA GTA CCA GGT AGT CAA CAT ATA GATSEQ ID No 2EVPGSQHSEQ ID No 3VEVPGSQHIDSQSEQ ID No 4GATFQVEVPGSQHIDSQKKAISEQ ID No 5GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI
權利要求
1．一種包括下列一種或幾種的物質一段包含SEQ ID No.2所示序列的胺基酸序列，或它的變體，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模擬物；這種物質能以EtxB和/或CtxB相同或相似的方式起作用；但這種物質不具有GM-1結合活性。
2．權利要求1中定義的一種物質用於藥物。
3．權利要求1中定義的一種物質用於免疫調節劑。
4．權利要求1中定義的一種物質用做佐劑。
5．權利要求1中定義的一種物質用於毒素導致的腹瀉的抑制劑。
6．上述任一項權利要求所定義的物質，其中該物質還含抗原或抗原決定簇。
7．一種藥物組合物，包括權利要求1-6任一項中所述的物質，視需要而定，還可與一或多個藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形物混合。
8．權利要求1-7任一項所定義的物質在製備用於治療和/或預防和/或調節免疫紊亂和/或毒素誘導的腹瀉相關的疾病和/或紊亂的藥物中的應用。
9．一種測定方法，用於確定能夠和權利要求1-7任一項的物質相互作用和/或能夠影響權利要求1-7任一項所述物質的一或多種試劑；其中所述測定包括將所述物質和待測試劑相接觸，然後確定是否該試劑能影響所述物質。
10．權利要求9中所述的測定方法所確定的物質。
11．一種治療方法，包括向需要治療和/或預防和/或調節免疫紊亂和/或毒素介導的紊亂相關的疫病和/或紊亂的受試者施用權利要求1-7任一項所定義的物質。
全文摘要
本發明涉及一種物質，此物質包含包括SEQ IDNo2所示序列所含的一個或多個胺基酸序列，或其變體，或其同源物、或其片段、衍生物或模擬物，其作用形式與EtxB和/或CtxB相同或相似，但不表現GM－1結合活性。
文檔編號G01N33/50GK1317013SQ9981066
公開日2001年10月10日 申請日期1999年9月7日 優先權日1998年9月7日
發明者N·A·威廉斯, T·R·希爾斯特 申請人:布里斯托大學