15價肺炎球菌多糖蛋白質綴合物疫苗組合物的製作方法

2023-05-19 09:51:56 1

專利名稱：15價肺炎球菌多糖蛋白質綴合物疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明提供了具有15種不同多糖蛋白質綴合物的多價免疫原性組合物。每種綴合物由與載體蛋白質優選CRM197綴合的莢膜多糖組成，所述莢膜多糖由肺炎鏈球菌{Streptococcus pneumoniae)的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)製備。優選配製為在基於鋁的佐劑上的疫苗的免疫原性組合物提供了針對特別是在嬰兒和幼兒中的肺炎球菌疾病的廣泛覆蓋。發明背景 肺炎鏈球菌是全世界的嚴重疾病的顯著原因。在1997年，疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention) (CDC)估計在美國姆年存在 3，000 個肺炎球菌性腦膜炎病例、50，000個肺炎球菌性菌血症病例、7，000, 000個肺炎球菌性中耳炎病例和500，000個肺炎球菌性肺炎病例。參見Centers for Disease Control andPrevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997，46 (RR-8) : 1-13。此外，這些疾病的併發症可以是顯著的，某些研究報導伴隨肺炎球菌性腦膜炎的高達8%死亡率和25%神經病學後遺症。參見 Arditi 等人，1998，Pediatrics 102:1087-97。已得到許可多年的多價肺炎球菌多糖疫苗已證明在預防成人特別是老年人和處於高危中的那些人中的肺炎球菌疾病中是有價值的。然而，嬰兒和幼兒對未綴合的肺炎球菌多糖響應弱。肺炎球菌綴合物疫苗，即含有當時在幼兒和嬰兒中引起侵入性肺炎球菌疾病的7種最頻繁分離的血清型(4、68、抑、14、18(、19 和23 )的Prevnar ，首先在美國在2000年2月得到許可。在Prevnar 在美國普遍使用後，由於Prevnar 中存在的血清型，已存在兒童中侵入性肺炎球菌疾病的顯著減少。參見Centers for Disease Control andPrevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005，54(36) :893_7。然而，在全世界的特定地區中存在由Prevna/的血清型覆蓋中的限制和在美國特定新出現血清型的某些證據(例如19A 及其他)。參見 O』Brien 等人,2004, Am J Epidemiol 159:634-44 ;Whitney 等人，2003,N Engl J Med 348:1737-46 ;Kyaw 等人，2006，N Engl J Med 354:1455-63 ;Hicks 等人，2007，J Infect Dis 196:1346-54 ;Traore 等人，2009，Clin Infect Dis 48: S181-S189。美國專利申請公開號US 2006/0228380 Al描述了包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7 、抑、14、18(、194、19 和23 的13價肺炎球菌多糖蛋白質綴合物疫苗。中國專利申請公開號 CN 101590224 A 描述了包括血清型 1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和 23F的14價肺炎球菌多糖蛋白質綴合物疫苗。其他PCVs已覆蓋PCV-15中含有的血清型中的7、10、11或13種，但已觀察到對於某些血清型的免疫幹擾(例如在GSK的PCV-Il中對於血清型3的更低保護)和在Pfizer的PCV-13中對於血清型6B的更低應答率。參見2008年10月25-28日在48th AnnualICAAC/ISDA 46th Annual Meeting, Washington DC 呈現的 Prymula 等人，2006, Lancet367:740-48 和 Kieninger 等人,Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valentPneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7—valent Pneumococcal ConjugateVaccine biven as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers。發明概述
本發明提供了包含下述的免疫原性組合物(I)由與載體蛋白質綴合的來自15種不同血清型的肺炎鏈球菌的莢膜多糖組成的多價多糖蛋白質綴合物混合物，和(2)藥學可接受的載體。更具體而言，本發明提供了包含下述的15價肺炎球菌綴合物疫苗(PCV-15)組合物由與載體蛋白質綴合的來自肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的莢膜多糖組成的多價多糖蛋白質綴合物混合物；和藥學可接受的載體。在ー個特定實施方案中，免疫原性組合物含有來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的莢膜多糖，並且載體蛋白質是CRM197。在特定實施方案中，組合物進ー步包含佐劑。在特定實施方案中，佐劑是基於鋁的 佐劑，例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁。在本發明的ー個特定實施方案中，佐劑是磷酸鋁。本發明還提供了誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多糖的免疫應答的方法，其包括給人施用免疫有效量的上述免疫原性組合物。本發明進一歩提供了作為單個0. 5 mL劑量施用的免疫原性組合物，所述劑量配製為含有2 μ g每種多糖，除了 4 Ug的6B外；約32 μ g CRM197載體蛋白質；0. 125 mg元素鋁(0. 5 mg磷酸鋁)佐劑；150 mM氯化鈉和20 mM L-組氨酸緩衝液。附圖
簡述
圖I :關於PCV-15相對於Prevnar 在嬰兒恆河猴(Prevnar血清型，TO-2和TO-3)中的GMCs比較。誤差條(Error bar)指示2個標準誤。圖2 :在用PCV-15免疫接種的嬰兒恆河猴中針對非Prevnar 血清型的血清型特異性GMCs。誤差條指示2個標準誤。圖3 =NZffR-I :在用PCV-15不連同(OxA)或連同APA(Bl)(劑量2後)免疫接種的兔中的幾何平均滴度比較。誤差條指示對幾何平均值倍數差異的95% CI(PCV-15不連同APA / PCV-15 連同 APA)。發明詳述
本發明提供了包含15種不同多糖蛋白質綴合物連同藥學可接受的載體、基本上由15種不同多糖蛋白質綴合物連同藥學可接受的載體組成、或可替代地由15種不同多糖蛋白質綴合物連同藥學可接受的載體組成的多價免疫原性組合物，其中綴合物各自含有與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中莢膜多糖由肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7卩、9￥、14、18(、19ム、19 、22 、23 和33 製備。在特定實施方案中，載體蛋白質是CRM197。免疫原性組合物可以進一歩包含佐劑，例如基於鋁的佐劑，例如磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。本發明還提供了誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的免疫應答的方法，其包括給人施用免疫有效量的上述多價免疫原性組合物。如下文實施例中舉例說明的，在嬰兒恆河猴中的臨床前研究證實針對PCV-15中的所有15種血清型的強抗體應答，這可與關於Prevna/中的7種常見血清型的應答相當。包括含有血清型22F和33F的新多糖蛋白質綴合物添加的15價肺炎球菌綴合物疫苗提供強抗體應答的申請人的發現證實，未由現有肺炎球菌疫苗覆蓋的肺炎球菌血清型的擴展覆蓋的可行性。當與本發明的免疫原性組合物一起使用吋，術語「包含」指任何其他組分的包括(遭受用於抗原混合物的語言「由……組成」的限制)，例如佐劑和賦形劑。當與多價多糖蛋白質綴合物混合物一起使用吋，術語「由……組成」指具有那些15種特定肺炎鏈球菌多糖蛋白質綴合物且不具有來自不同血清型的其他肺炎鏈球菌多糖蛋白質綴合物的混合物。肺炎鏈球菌莢膜多糖-蛋白質綴合物
來自肺炎鏈球菌的莢膜多糖可以通過本領域技術人員已知的標準技術進行製備。例如，多糖可以從細菌中分離，並且可以通過已知方法(參見例如，歐洲專利號EP497524和EP497525)且優選通過微流化使大小調節至一定程度。多糖可以調節大小，以便減少多糖樣品中的粘度和/或改善用於綴合產物的過濾性。在本發明中，莢膜多糖由肺炎鏈球菌的血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F 製備。
在一個實施方案中，每種肺炎球菌多糖血清型在基於大豆的培養基中生長。隨後通過包括離心、沉澱和超濾的標準步驟純化個別多糖。參見例如，美國專利申請公開號2008/0286838 和美國專利號 5，847，112。載體蛋白質優選是無毒和無反應原性且以足夠量和純度可獲得的蛋白質。載體蛋白質可以與肺炎鏈球菌多糖綴合或連接，以增強多糖的免疫原性。載體蛋白質應可順應標準綴合程序。在本發明的ー個特定實施方案中，CRM197用作載體蛋白質。在一個實施方案中，每種莢膜多糖與相同載體蛋白質綴合(每種莢膜多糖分子與單ー載體蛋白質綴合)。在另ー個實施方案中，莢膜多糖與兩種或更多種載體蛋白質綴合(每種莢膜多糖分子與単一載體蛋白質綴合)。在此類實施方案中，相同血清型的每種莢膜多糖一般與相同載體蛋白質
全ヌヌム
ロ οCRM197是白喉毒素的無毒變體(即類毒素)。在一個實施方案中，它從在基於酪蛋白胺基酸和酵母提取物的培養基中生長的白喉桿菌{Corynebacterium diphtheria)菌株07(β 197)培養物中分離。在另ー個實施方案中，CRM197依照美國專利號5，614，382中所述的方法重組製備。一般地，CRM197通過超濾、硫酸銨沉澱和離子交換層析的組合進行純化。在某些實施方案中，CRM197 使用 Pfenex Expression Technology (Pfenex Inc. , San Diego,CA)在突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)中進行製備。其他合適的載體蛋白質包括另外的滅活細菌毒素例如DT (白喉類毒素)、TT (破傷風毒素)或TT的片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如如國際專利申請公開號WO 2004/083251中描述的)、大腸桿菌(￡ cWi)LT、大腸桿菌ST、和來自銅綠假單胞菌iPseudomonas aeruginosa)的外毒素A。還可以使用細菌外膜蛋白質例如外膜複合物c (OMPC)，孔蛋白，轉鐵蛋白結合蛋白，肺炎球菌表面蛋白質A(PspA ;參見國際申請專利公開號WO 02/091998)，肺炎球菌粘附素蛋白質(PsaA)，來自A組或B組鏈球菌的C5a肽酶，或流感嗜血桿菌^HaemophiIus influenzae)蛋白D,肺炎球菌溶血素(Kuo等人，1995,Infect Immun 63 ;2706_13)包括以某些形式解毒的ply，例如dPLY_GMBS (參見國際專利申請公開號 WO 04/081515)或 dPLY-甲醛，PhtX 包括 PhtA、PhtB、PhtD、PhtE，和 Pht 蛋白質的融合物例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(參見國際專利申請公開號WO 01/98334和TO 03/54007)。其他蛋白質例如卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素純蛋白衍生物(PPD)、PorB (來自腦膜炎奈瑟菌{N. meningitidis)) > PD(流感嗜血桿菌蛋白D ;參見例如，歐洲專利號EP O 594 610 B)或其免疫功能等價物、合成肽(參見歐洲專利號EP0378881和EP0427347)、熱休克蛋白(參見國際專利申請公開號WO93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白質(參見國際專利申請公開號WO 98/58668和歐洲專利號EP0471177)、細胞因子、淋巴因子、生長因子或激素(參見國際專利申請公開號WO 91/01146)、包含來自多種病原體衍生抗原的多重人⑶4+ T細胞表位的人工蛋白質(參見 Falugi 等人，2001, Eur J Tmmunol 31:3816-3824),例如 N19 蛋白質(參見 Baraldoi等人,2004, Infect Immun 72:4884-7)、鐵攝取蛋白質(參見國際專利申請公開號WO01/72337)、艱難梭菌{C. difficile)的毒素A或B (參見國際專利公開號WO 00/61761)、和鞭毛蛋白(參見Ben-Yedidia等人，1998, Immunol Lett 64:9)也可以用作載體蛋白質。可以使用其他DT 突變體，例如 CRMl76、CRM228、CRM 45 (Uchida 等人，1973，J BiolChem 218:3838-3844) ；CRM 9,CRM 45、CRM102、CRM 103 和 CRM107 和由 Nicholls 和 Youle在 Genetically Engineered Toxins, Ed :Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992 中描述的其他突變；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突變和公開於美國專利號4，709，017或美國專利號4，950，740中的其他突變；至少ー個或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突變和公開於美國專利號5，917，017或美國專利號 6，455，673中的其他突變；或公開於美國專利號5，843，711中的片段。純化的多糖化學地激活以使得糖類能夠與載體蛋白質反應。一旦激活，每種莢膜多糖就與載體蛋白質分開綴合，以形成糖綴合物。多糖綴合物可以通過已知偶聯技術進行製備。在一個實施方案中，多糖的化學激活和與載體蛋白質的後續綴合通過美國專利號4，365，170,4, 673，574和4，902，506中所述的方法達到。簡言之，通過應用將末端羥基氧化為醛的任何氧化劑例如高碘酸鹽(包括高碘酸鈉、高碘酸鉀或高碘酸)的反應，那種化學法使得肺炎球菌多糖能夠激活。反應導致糖的鄰位羥基的隨機氧化切割，伴隨反應醛基的形成。與蛋白質載體(例如CRM197)的偶聯可以是通過經由蛋白質的賴氨醯基的直接胺化的還原胺化。例如，綴合通過激活多糖和載體蛋白質的混合物與還原劑例如氰基硼氫化鈉反應執行。未反應的醛隨後利用強還原劑例如硼氫化鈉的添加進行加帽。在另ー個實施方案中，綴合方法可以依賴用I-氰基-4-ニ甲氨基吡啶鎗四氟硼酸酷(CDAP)的糖類激活，以形成氰酸酷。激活糖類因此可以直接或經由間隔物(接頭)基團與載體蛋白質上的氨基偶聯。例如，間隔物可以是胱胺或半胱胺，以給出巰基化多糖，其可以經由硫醚鍵與載體偶聯，所述硫醚鍵在與馬來醯亞胺激活的載體蛋白質(例如使用GMBS)或滷代こ醯化載體蛋白質(例如使用碘こ醯胺[例如こ基碘こ醯胺HCl]或溴こ酸N-琥珀醯亞胺酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反應後獲得。優選地，氰酸酯(任選通過CDAP化學製備)與己烷ニ胺或己ニ酸ニ醯肼(ADH)偶聯，並且氨基衍生的糖類與載體蛋白質綴合，其使用碳ニ亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由在蛋白質載體上的羧基進行。此類綴合物在國際專利申請公開號WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094 ;和Chu等人，1983，Infect. Immunity 40:245-256 中描述。其他合適技術使用碳ニ亞胺、醯肼、活性酷、norborane、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S—NHS、EDC、TSTU。許多在國際專利申請公開號WO 98/42721中描述。綴合可以涉及羰基接頭，其可以通過糖類的游離羥基與⑶I的反應形成(參見Bethell等人，1979，J. Biol. Chem. 254:2572-4 ;Hearn 等人，1981，J. Chromatogr. 218:509-18)，隨後為與蛋白質的反應以形成氨基甲酸酯鍵。這可以涉及異頭末端至伯羥基的還原，伯羥基的任選保護/脫保護，伯羥基與CDI的反應以形成CDI氨基甲酸酯中間體，且偶聯CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白質上的氨基。在一個實施方案中，在配製前，每種肺炎球菌莢膜多糖抗原由肺炎鏈球菌個別純化，激活以形成反應醛，且隨後使用還原胺化與載體蛋白質CRM197共價綴合。在英膜多糖與載體蛋白質綴合後，通過多種技術中的一種或多種純化多糖蛋白質綴合物(就多糖蛋白質綴合物的量而言富集)。這些技術的例子是本領域技術人員眾所周知的，並且包括濃縮/滲濾操作、超濾、沉澱/洗脫、柱層析和深層過濾。參見例如，美國專利號 6，146，902。
藥物/疫苗組合物
本發明進一歩提供了組合物，包括藥物、免疫原性和疫苗組合物，其包含15種不同多糖蛋白質綴合物連同藥學可接受的載體和佐劑、基本上由15種不同多糖蛋白質綴合物連同藥學可接受的載體和佐劑組成、或可替代地由15種不同多糖蛋白質綴合物連同藥學可接受的載體和佐劑組成，其中綴合物各自含有與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中莢膜多糖由肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F製備。這些肺炎球菌綴合物通過分開過程製備且整體(bulk)配製成單ー劑量製劑。如本文定義的，「佐劑」是用於增強本發明的免疫原性組合物的免疫原性的物質。免疫佐劑可以增強針對抗原的免疫應答，所述抗原當単獨施用時是弱免疫原性的，例如未誘導抗體滴度或細胞介導的免疫應答或誘導弱抗體滴度或細胞介導的免疫應答，増加對於抗原的抗體滴度，和/或降低在個體中有效達到免疫應答的抗原劑量。因此，通常給予佐劑以加強免疫應答且其是本領域技術人員眾所周知的。增強組合物的有效性的合適佐劑包括但不限於
(1)鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；
(2)水包油乳液佐劑(含或不含其他特異性免疫刺激劑例如胞壁醯肽(下文定義的)或細菌細胞壁組分)，例如(a)MF59(國際專利申請公開號WO 90/14837)，含有5%Squalene,O. 5% Tween 80和O. 5% Span 85 (任選含有不同量的MTP-PE)，使用微射流機(microfluidizer)例如型號IlOY微射流機(Microfluidics,Newton,MA)配製成亞微米顆粒，(b)SAF，含有 10% Squalene,O. 4% Tween 80、5%普朗尼克嵌段聚合物 L121、和 thr-MDP，微射流成亞微米乳化液或渦旋以生成較大顆粒大小的乳液(c)Ribi 佐劑系統(RAS)，(Corixa,Hamilton,MT),含有 2% Squalene>O. 2% Tween 80和一種或多種細菌細胞壁組分，其來自美國專利號4，912，094中描述的3-0-脫醯化(deaylated)單磷醯脂質A (MPL )、海藻糖ニ黴菌酸(TDM)、和細胞壁支架(CWS)，優選MPL+CWS(Detox );和(d)Montanide ISA ；
(3)可以使用阜苷佐劑，例如Quil A 或 STIMULON QS-21 (Antigenics, Framingham,MA)(參見例如，美國專利號5，057，540)或由其生成的粒子，例如ISCOM(通過膽固醇、皂苷、磷脂和兩親蛋白質的組合形成的免疫刺激複合物)和Iscomatrix (具有與ISCOM基本上相同的結構但不含蛋白質)；
(4)細菌脂多糖、合成脂質A類似物例如氨基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或類似物，其可從Corixa獲得，且在美國專利號6，113,918中描述；一種此類AGP是2-[(R) -3-十四醯氧基十四醯氨基]こ基2-脫氧-4-0-膦醯基-3-0-[ (R) -3-十四醯氧基十四醯]-2-[(R)-3-十四醯氧基十四醯氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，其也稱為529 (以前稱為RC529)，其配製為水形式或穩定乳液；
(5)合成多核苷酸例如含有ー個或多個CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6, 207, 646);和
(6)細胞因子，例如白細胞介素(例如IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、幹擾素(例如Y幹擾素)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；和
(7)補體，例如補體成分C3d的三聚體。在另ー個實施方案中，佐劑是上述佐劑中的2、3種或更多種的混合物，例如 SBAS2 (還含有3-脫醯化單磷醯脂質A和QS21的水包油乳液)。胞壁醯肽包括但不限於N-こ醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-こ醯-normuramyl-L-丙氨酸-2- (Γ -2』 ニ棕櫚醯_sn_甘油-3-輕基磷醯氧基)-こ胺(MTP-PE)等。在特定實施方案中，佐劑是鋁鹽。鋁鹽佐劑可以是明礬沉澱的疫苗或明礬吸附的疫苗。鋁鹽佐劑是本領域眾所周知的，並且例如在Harlow，E.和D. Lane (1988 ；Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)和 Nicklas,ff. (1992 ；Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)中描述。招鹽包括但不限於水化氧化鋁、水合氧化鋁、三水合氧化鋁(ATH)、鋁的水合物、鋁的三水合物、鋁膠、Superfos、Amphogel、氫氧化招(III)、輕基磷酸招硫酸鹽(磷酸招佐劑(APA))、無定形氧化鋁、三水合氧化鋁或三羥基鋁。APA是羥基磷酸鋁的水混懸液。APA通過將氯化鋁和磷酸鈉以I: I體積比摻和以沉澱羥基磷酸鋁進行製造。在摻和過程後，用高剪切混合器使材料尺寸減小，以達到在2-8μm範圍的靶聚集物粒子大小。隨後將產物針對生理鹽水滲濾且蒸汽滅菌。在特定實施方案中，商購可得的Al (0H)3(例如Denmark/Accurate Chemical andScientific Co.，Westbury,NY 的 Alhydrogel 或 Superfos)用於以 50 - 200 g 蛋白質/mg氫氧化鋁的比吸附蛋白質。在另ー個實施方案中，蛋白質的吸附依賴於蛋白質的Pi(等電點pH)和介質的pH。具有更低pi的蛋白質比具有更高pi的蛋白質更強地吸附至帶正電的鋁離子。鋁鹽可以建立Ag貯庫，其經過2-3周的時期緩慢釋放，涉及巨噬細胞的非特異性激活和補體激活，和/或刺激先天性免疫機制(可能通過尿酸的刺激)。參見例如,Lambrecht等人,2009, Curr Opin Tmmunol 21:23。單價整體水性綴合物一般摻和在一起，且對於除了 6B外的所有血清型都稀釋至目標8 yg/mL，所述6B將稀釋至目標16 μ g/mL。一旦稀釋，該批次將過濾滅菌，且無菌加入等體積的磷酸招佐劑至250 μ g/mL的祀最終招濃度。佐劑化的(adjuvanted)、配製的批次將填充到一次性使用的O. 5 mL/劑量小瓶內。在特定實施方案中，佐劑是含CpG核苷酸序列，例如含CpG寡核苷酸，特別是含CpG寡脫氧核苷酸(CpG 0DN)。在另ー個實施方案中，佐劑是ODN 1826，其可以從ColeyPharmaceutical Group 犾得。
「含CpG核苷酸」、「含CpG寡核苷酸」、「CpG寡核苷酸」和類似術語指長度6_50個核苷酸的核苷酸分子，其含有未甲基化的CpG部分。參見例如，Wang等人，2003，Vaccine21:4297。在另ー個實施方案中，預期任何其他領域公認的術語定義。含CpG寡核苷酸包括使用任何合成核苷間鍵、修飾鹼基和/或修飾糖的修飾寡核苷酸。關於使用CpG寡核苷酸的方法是本領域眾所周知的，並且例如在Sur等人，1999，J Immunol. 162:6284-93 ；Verthelyi,2006,Methods Mol Med. 127:139-58 ;和 Yasuda 等人，2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110 中描述。施用/劑暈
藉助於經由全身或黏膜途徑施用疫苗，本發明的組合物和製劑可以用於保護或治療對肺炎球菌感染敏感的人。在一個實施方案中，本發明提供了誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的免疫應答的方法，其包括給人施用免疫有效量的本發明的免疫原性組合物。在另一個實施方案中，本發明提供了針對肺炎球菌感染給人接種疫苗的方法，其包括給人施用 免疫有效量的本發明的免疫原性組合物的步驟。「有效量」的本發明的組合物指引發抗體所需的劑量，所述抗體顯著減少在後續攻擊過程中肺炎鏈球菌感染的可能性或嚴重性。本發明的方法可以用於預防和/或減少由肺炎鏈球菌引起的原發性臨床症候群，包括侵入性感染(腦膜炎、肺炎和菌血症)和非侵入性感染(急性中耳炎和鼻竇炎)。本發明的組合物的施用可以包括下述中的ー種或多種經由肌內、腹膜內、皮內或皮下途徑注射；或經由黏膜施用於ロ /消化、呼吸或泌尿生殖道。在一個實施方案中，鼻內施用用於肺炎或中耳炎的治療(因為肺炎球菌的鼻咽運輸(carriage)可以更有效被預防，從而減弱在其最早階段時的感染)。在每個疫苗劑量中的綴合物量選擇為誘導免疫保護應答而無顯著不良反應的量。此類量可以取決於肺炎球菌血清型而改變。一般地，每個劑量將包含O. I - 100 yg每種多糖，特別是O. I - 10 yg，且更特別是I - 5 μ g0例如，每個劑量可以包含100、150、200、250、300、400、500 或 750 ng，或 I、I. 5、2、3、4、5、6、7、7· 5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90 或 100 μ g。關於特定疫苗的組分的最佳量可以通過涉及受試者中合適免疫應答的觀察的標準研究進行確定。例如，在另ー個實施方案中，用於人疫苗接種的劑量通過從動物研究外推到人數據進行測定。在另ー個實施方案中，劑量憑經驗測定。在一個實施方案中，鋁鹽的劑量是10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700 μ g，或1、1. 2、1. 5、2、3、5 mg或更多。在另外ー個實施方案中，上述鋁鹽的
劑量是姆μ g重組蛋白質。在本發明的ー個特定實施方案中，PCV-15疫苗是與CRM197個別綴合的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎球菌莢膜多糖的無菌液體製劑。每個O. 5 mL劑量配製為含有Jyg每種多糖，除了 4 μ g的6B外；約32 μ g CRM197載體蛋白質(例如 32 yg±5yg、±3yg、±2y g、或 ± I μ g) ；0. 125 mg元素鋁(O. 5mg磷酸招)佐劑；以及氯化鈉和L-組氨酸緩衝液。氯化鈉濃度是約150 mM(例如150 mM土 25 mM、土 20 mM、土 15 mM、土 10 mM、或 ± 5 mM)和約 20 mM(例如 20 mM ± 5 mM、土 2. 5 mM、土 2 mM、土 I mM、或 ± O. 5 mM) L-組氨酸緩衝液。
根據本發明的任何方法和在一個實施方案中，受試者是人。在特定實施方案中，人患者是嬰兒(小於I歲大)、剛學步的小孩(約12 - 24個月)、或幼兒(約2 - 5歲)。在其他實施方案中，人患者是老年患者(> 65歲)。本發明的組合物還適合於對於較大的兒童、青少年和成人(例如年齡18 - 45歲或18 - 65歲)使用。在本發明的方法的一個實施方案中，本發明的組合物作為單次接種施用。在另ー個實施方案中，疫苗施用足夠間隔開的兩次、三次或四次或更多次。例如，組合物可以以I、2、3、4、5或6個月間隔或其任何組合施用。免疫接種時間表可以遵循對於肺炎球菌疫苗設計的那種。例如，針對由肺炎鏈球菌引起的侵入性疾病的用於嬰兒和剛學步的小孩的常規時間表是2、4、6和12-15月齡。因此，在一個優選實施方案中，組合物作為4劑量系列在2、4、6和12-15月齡時施用。本發明的組合物還可以包括來自肺炎鏈球菌的ー種或多種蛋白質。適合於包括的肺炎鏈球菌蛋白質的例子包括在國際專利申請公開號WO 02/083855和WO 02/053761中鑑 定的那些。製劑
本發明的組合物可以通過本領域技術人員已知的ー種或多種方法施用於受試者，例如腸胃外、經黏膜、經皮、肌內、靜脈內、皮內、鼻內、皮下、腹膜內，且相應配製。在一個實施方案中，本發明的組合物經由液體製備物的表皮注射，肌內注射，靜脈內、動脈內、皮下注射，或呼吸道黏膜內注射進行施用。用於注射的液體製劑包括溶液等。本發明的組合物可以配製為單劑量小瓶、多劑量小瓶或預裝注射器。在另ー個實施方案中，本發明的組合物經ロ施用，並且因而以適合於經ロ施用的形式即作為固體或液體製備物進行配製。固體經ロ製劑包括片劑、膠囊、丸剤、顆粒劑、丸劑(pellet)等。液體經ロ製劑包括溶液、懸液、分散體、乳液、油等。用於液體製劑的藥學可接受的載體是水或非水溶液、懸液、乳液或油。非水溶劑的例子是丙ニ醇、聚こニ醇和可注射有機酯例如油酸こ酷。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩衝介質。油的例子包括動物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄欖油、向日葵油、魚肝油、另外的海洋油、或來自乳或蛋的脂肪。藥物組合物可以是等滲、低滲或高滲的。然而，在將它施用時，通常優選用於輸注或注射的藥物組合物是基本上等滲的。因此，為了貯存，藥物組合物可以優選是等滲或高滲的。如果藥物組合物為了貯存是高滲的，那麼它可以在施用前稀釋以變成等滲溶液。等滲試劑可以是離子等滲試劑例如鹽或非離子等滲試劑例如糖。離子等滲試劑的例子包括但不限於NaCl、CaCl2, KCl和MgCl2。非離子等滲試劑的例子包括但不限於甘露醇、山梨糖醇和甘油。還優選至少ー種藥學可接受的添加劑是緩衝劑。為了某些目的，例如，當藥物組合物意欲用於輸注或注射時，通常希望組合物包含緩衝液，其能夠將溶液緩衝至在4 - 10範圍中的pH，例如5 - 9，例如6 - 8。緩衝液可以例如選自TRIS、こ酸鹽、穀氨酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘氨酸鹽、組氨酸、甘氨酸、琥珀酸鹽和三こ醇胺緩衝液。緩衝劑可以另外例如選自用於腸胃外使用的USP相容的緩衝液，特別是當藥物製劑用於腸胃外使用吋。例如，緩衝液可以選自一元酸例如こ酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳酸；ニ元酸例如烏頭酸、己ニ酸、抗壞血酸、碳酸、穀氨酸、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸，多元酸例如檸檬酸和磷酸；和鹼例如銨、ニこ醇胺、甘氨酸、三こ醇胺和TRIS。腸胃外媒介物(用於皮下、靜脈內、動脈內或肌內注射)包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格和不揮發性油。靜脈內媒介物包括液體和營養補充劑、電解質補充劑例如基於林格氏右旋糖的那些等。例子是無菌液體例如水和油，添加或不添加表面活性劑和其他藥學可接受的佐劑。一般而言，水、鹽水、水性右旋糖和相關糖溶液，ニ醇例如丙ニ醇或聚こニ醇，和聚山梨糖醇-80是優選液體載體，特別是用於可注射溶液。油的例子是動物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄欖油、向日葵油、魚肝油、另外的海洋油、或來自乳或蛋的脂質。本發明的製劑還可以含有表面活性剤。優選表面活性劑包括但不限於:聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為Tweens)，特別是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80 ；在DOWFAX 商品名稱下銷售的，環氧こ烷(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO)的共 聚物，例如線性Ε0/Ρ0嵌段共聚物；辛苯昔醇，其可以在重複こ氧基(氧基-1，2-こニ基(ethanediyl)基團數目中不同，其中辛苯昔醇_9 (Triton X-100,或叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇)是特別有利的；(辛基苯氧基)聚こ氧基こ醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂例如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；壬基酚こ氧基化物例如Tergitol NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧こ烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，例如三甘醇單月桂基醚(Brij30);和脫水山梨糖醇酯(通常稱為SPANs)，例如脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和脫水山梨糖醇單月桂酸酷。用於包括在乳液中的優選表面活性劑是Tween 80(聚氧こ烯脫水山梨糖醇單月桂酸酷)。可以使用表面活性劑的混合物,例如Tween 80/Span 85混合物。聚氧こ烯脫水山梨糖醇酯例如聚氧こ烯脫水山梨糖醇單月桂酸酷(Tween 80)和辛苯昔醇例如叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇(Triton X-100)的組合也是合適的。另ー種有用的組合包含Iaureth 9加上聚氧こ烯脫水山梨糖醇酯和/或辛苯昔醇。表面活性劑的優選量(按重量計％)是聚氧こ烯脫水山梨糖醇酯(例如Tween80)0.01 - 1%,特別是約O. I % ;辛基或壬基苯氧基聚氧こ醇(polyoxyethanols)(例如Tri-η Χ-100，或在Tri-n系列中的其他去垢劑)0. 001 - 0.1 %，特別是0.005 - 0. 02% -M氧こ烯醚(例如Iaureth 9)0. I - 20 %，優選0. I - 10 %，且特別是0. I - I %或約0.5%。在另ー個實施方案中，藥物組合物在控釋系統中遞送。例如，試劑可以使用靜脈內輸注、經皮貼劑、脂質體或其他施用模式進行施用。在另ー個實施方案中，使用聚合材料；例如在微球體中或埋植劑中。還由本發明包含的是通過水溶性聚合物的共價附著修飾的化合物，所述水溶性聚合物例如聚こニ醇、聚こニ醇和聚丙ニ醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮或聚脯氨酸。此類修飾可以增加化合物在水溶液中的可溶性，消除聚集，增強化合物的物理和化學穩定性，且極大減少化合物的反應原性。在另ー個實施方案中，所需體內生物學活性通過更不頻繁地或以比未修飾化合物更低的劑量施用此類聚合物-化合物加合物(abducts)來達到。在一個優選實施方案中，疫苗組合物在具有氯化鈉的L-組氨酸緩衝液中配製。已就伴隨描述和附圖而言描述了本發明的多個實施方案，應當理解本發明並不限於那些精確實施方案，並且多種變化和修飾可以由本領域技術人員在其中實現，而不背離如在附加權利要求中定義的本發明的範圍或精神。下述實施例舉例說明但不限制本發明。
實施例實施例I :肺炎鏈球菌莢膜多糖的製備
培養肺炎球菌的方法是本領域眾所周知的。參見例如，Chase，1967，Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。製備肺炎球菌莢膜多糖的方法也是本領域眾所周知的。參見例如，歐洲專利號EP0497524。肺炎球菌亞型的分離物可從ATCC獲得。
該細菌鑑定為有莢膜、無運動、革蘭氏陽性、柳葉刀狀雙球菌，其在血瓊脂上是α-溶血的。亞型是在使用特異性抗血清的Quelling反應的基礎上區分的。參見例如，美國專利號5，847，112。細朐庫
代表PCV-15中存在的肺炎鏈球菌血清型各自的細胞庫以冷凍小瓶得自Merck CultureCollection(Rahway, NJ)。梓種
將解凍的種子培養物轉移至含有合適的預滅菌生長培養基的種子發酵罐。種子發酵
培養物在種子發酵罐中伴隨溫度和pH控制生長。將種子發酵罐的整個體積轉移至含有預滅菌生長培養基的生產發酵罐。牛產發酵
生產發酵是該過程的最後細胞生長階段。溫度、PH和攪動速率是受控的。滅活
發酵過程經由滅活劑的添加得到終止。在滅活後，將批次轉移至滅活槽，在其中它保持在受控的溫度和攪動下。純化
使用離心和過濾的組合去除細胞碎片。將批次超濾且滲濾。隨後對批次實施基於溶劑的分餾，其去除雜質且回收多糖。實施例2 :肺炎球菌多糖CRM197綴合物的製備 激活過稈
不同血清型糖類使用常見エ藝流程個別綴合至純化的CRM197載體蛋白質。在這個過程中，將糖類溶解，調節大小至靶分子量，化學激活且通過超濾更換緩衝液。隨後用激活糖類綴合純化的CRM197，且在最後0.2 μ m膜過濾前，將所得到的綴合物通過超濾純化。在每個步驟內的幾個エ藝參數，例如pH、溫度、濃度和時間是血清型特異性的，如本實施例中所述。步驟I :溶解
將純化的多糖溶解於水中至2 - 3 mg/mL的濃度。將溶解的多糖經過其壓カ預調為0-1000巴的機械勻漿器。在尺寸減小後，將糖類濃縮且用無菌水在10 kDa MWCO超濾器上滲濾。將滲透物棄去，並且用こ酸鈉緩衝液，50 mM終濃度，將滲餘物調整至pH 4.1。對於血清型4和5，使用以pH 5. O的100 mMこ酸鈉。對於血清型4，將溶液在50° 土 2°C溫育。通過冷卻至20 - 24°C停止水解。步驟2:高碘酸鹽反應
使用總糖類含量測定用於肺炎球菌糖類激活的所需高碘酸鈉摩爾當量。伴隨充分混合，對於除了 5、7F和19F(關於其的溫度是2 - 6°C )外的所有血清型，允許氧化在20 -24°C進行3 - 20小時。步驟3 :軺濾
將氧化糖類濃縮，並且在10 kDa MWCO超濾器上用10 mM磷酸鉀，pH 6.4(對於血清型5，10 mMこ酸鈉，pH 4. 3)滲濾。將滲透物棄去，並且通過添加3 M磷酸鉀緩衝液，將滲餘物調整至 pH 6. 3 - 8. 4。綴合討程 步驟I :綴合反應
將濃縮糖類與CRM197載體蛋白質以O. 2 - 2至I配料比混合。將摻和的糖類-CRM197混合物通過O. 2 μ m濾器過濾。綴合反應通過加入氰基硼氫化鈉溶液達到1.8 - 2.0摩爾氰基硼氫化鈉/摩爾糖類而起始。將反應混合物在20 - 240C (對於血清型3、5、6A、7F、19A和19F，8 - 12°C )溫育48 - 120小時。步驟2 :硼氫化物反應
在綴合溫育結束時，用I. 2 M碳酸氫鈉緩衝液或3 M磷酸鉀緩衝液(除了血清型5外)，將反應混合物調整至4 - 8°C，和pH 8 - 10。通過加入硼氫化鈉溶液達到O. 6 - I. O摩爾硼氫化鈉/摩爾糖類(對於血清型5，加入O摩爾硼氫化物)停止綴合反應。將反應混合物溫育45 - 60分鐘。步驟3 :超濾步驟
將反應混合物在100 kDa MWCO超濾器上滲濾，使用最低限度20體積的100 mM磷酸鉀，pH 8. 4緩衝液。來自100 kDa超濾器的滲餘物在300 kDa MWCO超濾器上滲濾，使用在20-24で最低限度20透析體積(diavolumes)的150 mM氯化鈉。將滲透物棄去。步驟4 :無菌過濾
將來自300 kDa MWCO滲濾的滲餘物通過O. 2 μ m濾器過濾，且填充到合適體積的硼矽玻璃容器內，用於釋放測試、過程中控制(in-process control)和配製(除了血清型19F外)。將血清型19F綴合物經過O. 2 μ m濾器進入容納槽內，且在20 - 24°C溫育。在溫育後，將綴合物在300 kDa MWCO超濾器上滲濾，使用在20 - 24°C最低限度20透析體積的150mM氯化鈉。將滲透物棄去，並且將滲餘物通過O. 2 μ m濾器過濾，且填充到合適體積的硼矽玻璃容器內，用於釋放測試、過程中控制和配製。將最終整體濃縮物貯存於2 - 8°C。實施例3:15價肺炎球菌綴合物疫苗的配製
基於批次體積和整體糖類濃度計算整體濃縮物的所需體積。通過加入含有氯化鈉和L-組氨酸、pH 5. 8的緩衝液，將合併的15種綴合物進ー步稀釋至靶吸附濃度。在足夠混合後，將摻和物通過O. 2 μ m膜無菌過濾。將無菌配製的整體在其與整體磷酸鋁摻和的過程中和之後輕輕混合。將配製的疫苗貯存於2 - 8°C。在可替代過程中，通過加入含有氯化鈉和L-組氨酸、pH 5. 8的緩衝液，將合併的15種綴合物進ー步稀釋至靶濃度。在無菌過濾前，向稀釋的緩衝的綴合物混合物中加入聚山梨醇酯80至O. 005%的終濃度。在無菌過濾後，將配製的疫苗貯存於2 - 8°C。表I顯示佐劑化和未佐劑化形式的PCV-15的最終組成。表I :佐劑化和未佐劑化15價肺炎球菌綴合物疫苗製劑的組成
權利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含 (1)由與載體蛋白質綴合的來自肺炎鏈球菌{Streptococcuspneumoniae)的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的莢膜多糖組成的多價多糖蛋白質綴合物混合物，和 (2)藥學可接受的載體。
2.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白質是CRM197。
3.權利要求I的免疫原性組合物,其進一步包含佐劑。
4.權利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是基於鋁的佐劑。
5.權利要求4的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
6.權利要求5的免疫原性組合物，其中所述佐劑是磷酸鋁。
7.一種誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多糖的免疫應答的方法，其包括給人施用免疫有效量的權利要求I的免疫原性組合物。
8.權利要求7的方法，其中施用的所述免疫原性組合物是配製為含有下述的單個O.5mL劑量2 μ g每種多糖，除了 4 μ g的6B夕卜；約32 μ g CRM197載體蛋白質；0. 125 mg元素鋁(O. 5 mg磷酸鋁)佐劑；150 mM氯化鈉和20 mM L-組氨酸緩衝液。
全文摘要
本發明提供了具有15種不同多糖蛋白質綴合物的多價免疫原性組合物。每種綴合物由與載體蛋白質優選CRM197綴合的莢膜多糖組成，所述莢膜多糖由肺炎鏈球菌的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)製備。優選配製為在基於鋁的佐劑上的疫苗的免疫原性組合物提供了針對特別是在嬰兒和幼兒中的肺炎球菌疾病的廣泛覆蓋。
文檔編號A61K39/00GK102858365SQ201180008742
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月3日 優先權日2010年2月9日
發明者M.J.考爾菲爾德, P.L.阿爾, J.T.布盧, J.L.肯農 申請人:默沙東公司