無抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體的構建和應用的製作方法
2023-05-18 22:24:11 4
無抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體的構建和應用的製作方法
【專利摘要】穿梭載體是具有兩種不同的複製起點和篩選標記、能夠在大腸桿菌和另一種宿主細胞中獨立存在並進行複製的質粒載體。目前廣泛使用的穿梭載體都含有用作篩選標記的抗藥基因，其生物安全性是限制微生物轉基因技術推廣應用的關鍵因素。本發明成功利用葡萄糖胺合成酶基因取代抗藥基因，獲得酵母-大腸桿菌，穿梭載體pGFA。新載體的特徵：(1)不含潛在危害性基因，具有生物安全性；(2)篩選功能強，能夠有效維持重組表徵；(3)不受微環境中富營養條件的影響；(4)兩種宿主共用篩選標記，從而精簡了載體分子、擴大了載體容量、提高了基因轉化率。通過pGFA賦予新功能的酵母細胞可以在食品發酵、飼料添加、環境修復等領域得到推廣應用。
【專利說明】無抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體的構建和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域；具體涉及分子生物技術、基因工程、細胞工程、環境修復等【技術領域】；更具體涉及I種不含抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體及其應用技術。
【背景技術】
[0002]穿梭載體是具有兩種不同的複製起點和篩選標記、能夠在大腸桿菌和另一種宿主細胞中獨立存在並進行複製的質粒載體(吳乃虎，2001，《基因工程原理》，p.502)。大腸桿菌是轉化率最高、質粒最容易分離的宿主細胞。為了有效轉化大腸桿菌以外的宿主細胞，人們首先需要在大腸桿菌中進行基因克隆和載體構建，並通過大腸桿菌細胞製備較大量的純質粒；因此，所採用的質粒必須含有一套大腸桿菌的複製元件和篩選標記，同時含有第二套適用於另一種宿主細胞的複製元件和篩選標記。
[0003]篩選標記是質粒載體所必備的基本元件。抗藥基因是微生物轉基因的有效篩選標記，目前所使用的在不同微生物和大腸桿菌之間共用的穿梭載體都含有用作篩選標記的抗藥基因。通過這些載體轉基因可能導致抗藥基因的擴散，其生物安全性問題長久以來一直是限制微生物轉基因技術推廣應用的關鍵因素。營養缺陷型篩選標記可以避免抗藥基因的傳播，具有生物安全性，但是自然環境或自然培養基中富含胺基酸、核苷酸等營養成分，使相關的營養缺陷型篩選標記不能夠維持篩選壓力。同時，由於細菌易於回復突變，營養缺陷型篩選標記在細菌如大腸桿菌中未能有效運用。
[0004]穀氨醯胺:6_磷酸果糖氨基轉移酶(Gfa)又稱6_磷酸葡萄糖胺合成酶(Glm);它是一種胞內酶，催化底物穀氨醯胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和穀氨酸，即氨基己糖合成代謝途徑中的第一步反應(Bearne SL, J Biol Chem, 1996, 271:ρ.3052-7)。Gfa 幾乎存在於每個物種和組織中，是生命`活動所必需的(Yamazaki K，et al.，Gene, 2000, 261:p.329-36 ；Smith RJ, et al., J Bacteriol，1996，178:ρ.2320-7)。Gfa 編碼基因的失活會使細胞依賴於外源葡萄糖胺的補充。
[0005]本實驗室在以前的研究中，我們首次用實驗證明葡萄糖胺合成酶基因可以是一種既適用於真菌又適用於細菌的生物安全性的篩選標記基因(Wu G，et al., PLoS One,2011.6:p.el7082)。我們敲除了大腸桿菌(Escherichia coli)的Gfa編碼基因glmS和粟裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的Gfa編碼基因gfal,構建了兩種gfa缺失菌株，E.coli Δ glmS和S.pombe Δ gfal ;這些菌株在不添加葡萄糖胺的培養基中不能正常生長。當我們用帶有glmS基因的大腸桿菌質粒pHsh-glmS轉化大腸桿菌後,含有質粒的大腸桿菌細胞得到成功篩選。同樣，用帶有gfal的粟酒裂殖酵母質粒pREP-AGCX轉化菌株S.pombeAgfal能夠使它重新獲得在不添加葡萄糖胺的培養基上生長的能力；其中，pREP-AGCX和其他所有的穿梭載體一樣:至少帶有I個用作大腸桿菌篩選標記的抗藥，如amf (氨苄青黴素抗藥基因)(Wu G, et al.，PLoS One, 2011,6:p.el7082)。
【發明內容】
[0006]1.發明目的:
[0007]以Gfa缺失菌株為基礎，創建I個既能夠被酵母系統又能夠被大腸桿菌系統識別和轉錄表達的非抗藥性篩選標記，從而構成I個不帶有任何抗藥基因的穿梭載體。本發明的穿梭載體由生物安全性基因構成，從而能夠在基因重組菌株的應用範圍方面取得突破:用該質粒進行遺傳改造的細胞可以直接應用於食品發酵、飼料添加、環境修復等複雜環境。
[0008]2.技術關鍵:
[0009]將粟酒裂殖酵母基因gfal (Sp-gfa)用著酵母-大腸桿菌穿梭載體中的篩選標記，對Sp-gfa上遊的轉錄表達元件進行重新設計和改造,使穿梭載體中的Sp-gfa在大腸桿菌和粟酒裂殖酵母都具有篩選標記功能，不再使用抗生素篩選，達到構建生物安全性穿梭載體的目的。
[0010]3.技術方案:
[0011](1)利用生物信息學軟體分析粟酒裂殖酵母gfal基因的啟動子和終止信號序列區，並將含有自身啟動子和終止信號序列的gfal基因插入到一個原核載體PHsh中。
[0012](2)在pHsh-Sp-gfa中，刪除gfa基因中的內含子序列，並人工改造gfa基因的終止密碼子下遊序列，形成可以在大腸桿菌中使用的終止子序列。
[0013](3)在優化過的pHsh-Sp-gfa載體基礎上，人工設計改造gfa基因的啟動子序列，加入大腸桿菌的σ 70啟動子核心序列和核糖體結合位點SD序列，並轉化Ε.coli Δ glmS。
[0014](4)將經過改造的可在大腸桿菌中發揮篩選功能的gfa基因序列插入到pREP3X中，並刪除載體中的Ieu和amp篩選標記基因序列,構建成新型穿梭載體pGFA(圖1)。
[0015](5)驗證改造後的穿梭載體在gfa缺失型菌株S.pombe Δ gfal和E.coli Δ glmS中的轉化和選擇功能。
[0016](6)新型穿梭載體pGFA克隆外源基因在裂殖酵母中進行表達試驗。
[0017]4.本發明可取得的有益效果:
[0018](I)本發明產生的質粒pGFA是一個生物安全性的轉基因載體。這是生物工程領域第I個成功剔除抗生素篩選標記基因的新型穿梭載體，質粒的基本元件僅包含質粒複製元件和gfa篩選標記，前者廣泛存在於自然界而後者是各種生物都具有的必需基因。
[0019](2) pGFA所使用的非抗藥基因篩選標記能夠有效地維持篩選壓力，從而有效防止重組基因的丟失。
[0020](3) pGFA的篩選作用不依賴於抗菌素或其他化學品的添加，也不受自然環境或發酵原料中的糖、胺基酸、核苷酸等營養成分的影響。
[0021](4)在pGFA中，不同宿主共用同一個篩選標記，質粒的分子得到充分精簡，外源目標基因的容量進一步擴大，基因轉化率得到提聞。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1.本發明的穿梭載體pGFA(B)與通用穿梭載體㈧的結構圖比較。
[0023]圖2.篩選標記gfa基因的起始密碼子上遊序列人工設計改造前後比較。
[0024]圖3.載體 pGFA 轉化 E.coli Δ glmS(A,B)和 S.pombe Δ gfal 的互補驗證(C,D):在不補充葡萄糖胺的培養基上，只有帶有PGFA的菌株才能生長(B，D)。
[0025]圖4.運用載體pGFA克隆木聚糖酶基因，使無抗藥基因酵母重組菌分泌木聚糖酶。【具體實施方式】:
[0026]本發明中所用術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面的方法結合具體實施例，並參照數據進一步詳細的描述本發明。應理解實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
[0027]1.所用材料與常規技術
[0028](I)菌株及質粒:
[0029]敲除粟酒裂殖酵母S.pombe YHL6381 菌株(h+，his3_Dl，leul-32，ura4_D18，ade6_M210)中的gfal基因構獲得gfa缺失型菌株S.pombe Δ gfal,敲除E.coli K12菌株中的glmS基因獲得gfa缺失型菌株E.coli Λ glmS，具體方法參見Wu G，et al.(PLoS One,2011,6:p.el7082)。本研究中還用到 E.coli DH10B 菌株以及質粒 pREP3X(MaundrelI，K.1993, Gene 123:127-130), pHsh-Amp(Wu H, et al.,2010, Biotechnol Lett,32:795-801)。
[0030](2)感受態細胞的製備及基因轉化方法:
[0031]菌株E.coli AglmS在含有5mM鹽酸葡萄糖胺(購自Sigma公司，貨號G4875)的LB培養基中培養(37°C )，並按照標準大腸桿菌感受態製備方法製備電轉化感受態細胞。採用電穿孔系統(Bio-rad Gene Pulser Xcell?)並按其操作要求進行大腸桿菌的電轉化。粟酒裂殖酵母菌株S.pombe Δ gfal在含有IOmM鹽酸葡萄糖胺的YES培養基中培養，按照標準醋酸鋰轉化方法進行基因轉化。本研究中所使用的酵母培養基YES和EMM中均添加了終濃度為225mg/l的組氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶。
[0032](3)其他常規DNA操作方法:
[0033]實驗中所使用的T4 DNA連接酶購自NEB公司，PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、PrimeSTAR? max DNA聚合酶、DNA分子量Marker等常規試劑均購自大連Takara生物公司，DNA片段割膠回收中所用QG、PE試劑購自Qiagen公司。PCR反應和DNA片段連接反應均按照相應說明書要求操作。根據E.Z.N.A.?Yeast Plasmid Mini Kit試劑盒操作說明，提取酵母質粒。基因序列的測定由上海美吉生物公司完成。
[0034]2.在酵母gfa基因及其表達元件中植入大腸桿菌基因表達元件
[0035](I)基因克隆:根據GeneBank數據中的GeneID:2539622基因數據，設計引物(SEQID N0.1和N0.2)從粟酒裂殖酵母基因組中擴增gfal基因及其自身帶有的啟動子和終止信號序列。得到的PCR產物長度為2，718bp，其鹼基序列列表於SEQ ID N0.3，定名為Sp-gfa。設計引物SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5擴增大腸桿菌表達載體pHsh-Amp的線性片段，將它與Sp-gfa連接構建成大腸桿菌表達質粒pHsh-Sp-gfa。由於Sp-gfa插入pHsh_Amp質粒中的amp基因序列與複製元件序列之間,保證Sp-gfa的表達不受pHsh_Amp自身啟動子的影響。
[0036](2)終止子和內含子:帶有自身啟動子的酵母基因gfal在大腸桿菌中不能夠表達，需要經過添加大腸桿菌的終止子、啟動子，並去除內含子。我們在gfal基因編碼框的下遊區設計加入不依賴P因子的終止子序列，採用反向PCR方法，以構建得到的pHsh-SpGfa質粒為模板，用引物SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7擴增，得到的PCR片段，磷酸化處理後，進行連接反應得到質粒pHsh-Sp-gfa-term。在gfal基因中發現兩個緊鄰的內含子,我們通過一步反向PCR的方法將其去除，所用引物序列見SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9，所得到的質粒命名為 pHsh-Sp-gfa-Δ intron。
[0037](3)啟動子和核糖體結合位點:為了保證gfal基因在大腸桿菌中的各個生長時期都能表達，所以我們將其設計在組成型啟動子的控制下。因此，我們採用反向PCR的方法，在gfal基因的上遊序列區中設計引物插入σ 7°類型啟動子的核心序列-10區(5，-ΤΑΤΑΑΤ-3，)和-35 區(5，-TTGACA-3』 )，所用引物序列為 SEQ ID N0.10 和 SEQ IDN0.11，得到的質粒命名為pHsh-Sp-gfa-σ 70。
[0038]在大腸桿菌中，目的基因的表達除了有啟動子核心序列元件外，還要有核糖體結合位點SD序列，以便在翻譯過程中使核糖體能正確結合到轉錄合成的mRNA上。採用反向PCR方法，將大腸桿菌基因dmsC的核糖體結合位點序列加入到pHsh-Sp-gfa- σ 70中的gfal基因的前面，所用引物為SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13。測序正確的質粒命名為pHsh-Sp-gfa-Ec，啟動子序列改造前後比較見圖2。經人工改造後的的gfal基因及表達元件序列見SEQ ID N0.14。
[0039](4)篩選標記功能驗證:我們用pHsh-Sp-gfa-Ec轉化E.coli Δ glmS,結果顯示gfa缺失型大腸桿菌的轉化子獲得了在不添加葡萄糖胺的培養基上生長的能力，證明一個酵母-大腸桿菌共用型的非抗藥基因篩選標記Sp-gfa-Ec已經構建成功。
[0040]3.新型穿梭載體pGFA的構建
[0041](I)質粒PREP3X中酵母篩選標記的替換
[0042]通用型穿梭載體pREP3X中的篩選標記基因是leu,適用於胺基酸Leucine營養缺陷型酵母菌株，但是在含有 酵母粉或蛋白腖的培養基中無選擇壓力。我們為了以gfa篩選標記替換leu，我們用引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從質粒pHsh-Sp-gfa-Ec中擴增出Sp-gfa-Ec ;用引物SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16從穿梭載體pREP3X中擴增出刪除了 Ieu的線性載體片段，將其與Sp-gfa-Ec片段連接後,獲得穿梭載體pRep-Sp-gfa-Ec。
[0043](2)抗藥基因amp的刪除
[0044]Sp-gfa-Ec在大腸桿菌E.coli Δ glmS中已經具備篩選標記基因的功能，所以，我們除去質粒pRep-Sp-gfa-Ec中的篩選標記amp,建立無抗藥基因穿梭載體pGFA。用引物SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18，以質粒pR印-Sp-gfa-Ec為模板進行反向PCR擴增。對PCR產物進行磷酸化處理後，用T4 DNA連接酶連接，反應液轉化E.coli Δ glmS感受態細胞，在無抗生素的LB固體培養基平皿上培養轉化子，獲得的質粒被命名為pGFA-nmt。
[0045](3) nmt啟動子的替換:
[0046]在穿梭載體pGFA-nmt中位於多克隆位點上遊控制外源基因表達的啟動子是裂殖酵母nmt基因的啟動子；nmt啟動子的啟動轉錄功能受到酵母粉中的營養成分的抑制，因此，本發明中將它替換為磷酸丙酮酸水合酶eno基因的啟動子。根據NCBI資料庫中eno基因信息(SPBC1815.01)，設計引物SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.20，以酵母基因組DNA為模板擴增eno基因啟動子片段。同時，以構建的質粒pGFA-nmt為模板，設計引物為SEQ IDN0.21和SEQ ID N0.22，擴增載體片段。將得到的eno基因啟動子片段和載體片段進行平端連接後轉化E.coli AglmS0獲得的質粒為eno基因啟動子替換nmt啟動子後的質粒，被命名為pGFA，其分子大小為7007bp (圖1)，序列見SEQ ID N0.23。
[0047]用pGFA轉化大腸桿菌E.coli Δ glmS和酵母S.pombe Δ gfal,驗證其中的Sp-gfa-Ec在兩種宿主中能否發揮篩選功能，圖3顯示轉化pGFA質粒的gfa缺失型菌株E.coli AglmS和S.pombe Λ gfal均獲得了正常生長的能力。因此，宿主菌株在不補充葡萄糖胺的自然培養基的生長能力依賴於穿梭載體的存在，換言之，PGFA是一個無抗藥基因而穩定有效的生物安全性穿梭載體。
[0048]4.新型穿梭載體pGFA應用實例:
[0049]實例1.用pGFA構建產生木聚糖酶的裂殖酵母
[0050]為了檢驗構建的質粒pGFA的實用效果，以本實驗室之前構建的質粒pREP-AGCX為模板(Wu H, et al.，2010，Biotechnol Lett，32:795-801)，設計引物 SEQ ID N0.24 和SEQ ID N0.25，得到分泌信號肽cpy和木聚糖酶XynA融合的片段序列，並將個PCR片段割膠回收和磷酸化處理。以PGFA為模板，設計引物SEQ ID N0.26和SEQ ID N0.27，擴增載體序列。通過平端克隆方式將兩片段連接到一起，並轉化E.coli Λ glmS，得到的質粒命名為pGFA-CX。將質粒pGFA-CX轉化S.pombe Δ gfal感受態細胞，在YES培養基上篩選。挑取裂殖酵母轉化子到EMM液體培養基中培養，培養3天後使用蛋白濃縮柱濃縮胞外分泌蛋白，並取相當於胞外培養液Iml的樣品量進行SDS-PAGE電泳分析。木聚糖酶XynA的大小為23kD左右，結果如圖4所示，在轉化pGFA-CX的酵母培養液中在23kD處有明顯的目的蛋白條帶。木聚糖酶活性的測定是以0.5%燕麥木聚糖為底物，利用對羥基苯甲酸醯肼與水解反應產生的還原糖的顯色反應進行比色，410nm下測定其吸收值(Lever M, Anal Biochem,1972,47:273-279.)。在EMM培養液中測得分泌表達的木聚糖酶活最高可達30U/ml。
[0051]實例2.用pGFA構建具有降低膽固醇能力的裂殖酵母
[0052]根據Gene Bank資料庫中來源於Streptomyces clavuligerus的膽固醇氧化酶信息(NZ_CM000913.1)設計引物SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.29擴增膽固醇氧化酶基因片段，得到的PCR產物割膠並磷酸化處理。以pGFA為模板，設計引物SEQ ID N0.26和SEQID N0.27，擴增載體序列片段。將載體序列與磷酸化的膽固醇氧化酶基因片段平端連接，並電轉化E.coli Δ glmS,在無抗性LB培養基上篩選。挑轉化子測序，正向插入的質粒命名為pGFA-Clo。將質粒pGFA-Clo轉化S.pombe Δ gfal感受態細胞，在YES培養基上篩選轉化子。挑取轉化子在EMM液體培養基中培養。收集培養的5ml酵母細胞，在5000rpm離心lOmin，用150 μ I的PBS緩衝液重懸細胞，並加入0.1mm的酸洗玻璃珠震蕩破碎酵母細胞。將破碎的細胞混合液在12000rpm下高速離心以去除細胞殘留，取上清液進行酶活分析(季文明，陳毅力，食品與生物技術，2000,19 (3) =251-254)，檢測到明顯酶活。
【權利要求】
1.一種新型酵母-大腸桿菌穿梭載體，其基本特徵在於不含有任何用作篩選標記的抗藥基因。
2.一種穿梭載體，其特徵在於只帶有I個能夠被不同的宿主細胞共同使用的非抗藥性篩選標記基因。
3.一種穿梭載體，其特徵在於控制外源基因表達的啟動子是來源於酵母菌eno基因的強啟動子。
4.如權利要求2所述的穿梭載體中的篩選標記，其特徵在於是由人工設計和合成的、能夠被酵母和細菌共用的穀氨醯胺:6_磷酸果糖氨基轉移酶的基因表達盒，其組合元件依次為:酵母啟動子、大腸桿菌啟動子、核糖體結合位點、開放閱讀框、大腸桿菌轉錄終止子、酵母轉錄終止信號序列。
5.一種大腸桿菌載體pHsh-Sp-gfa-Ec其特徵在於帶有如權利要求4所述的穀氨醯胺:6-磷 酸果糖氨基轉移酶的基因表達盒。
6.如權利要求4和權利要求5所述的穀氨醯胺:6_磷酸果糖氨基轉移酶的基因表達盒，其鹼基序列與pHsh-Sp-gfa-Ec中的Sp-gfa-Ec序列(SEQ ID N0.14)的同源性高於80%。
【文檔編號】C12N15/54GK103757048SQ201310191146
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2013年5月22日
【發明者】邵蔚藍, 王洪成 申請人:仙奕生物科技（南京）有限公司