光熱變換分光分析方法及執行該方法的光熱變換分光分析裝置的製作方法
2023-05-19 12:47:21
專利名稱：光熱變換分光分析方法及執行該方法的光熱變換分光分析裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種光熱變換分光分析方法及裝置，向試件聚光照射激勵光，形成熱透鏡，同時，照射檢測光，感光透過試件的檢測光，測定導致熱透鏡引起的折射的檢測光的強度變化，尤其是涉及在關於微小空間的測定中可進行高精度的超微量分析、同時可在任意場所進行簡便測定的光熱變換分光分析方法及裝置。
背景技術：
近年來，作為進行半導體或生物試件、或各種液體試件等的分析或測定的方法，廣泛利用分光分析方法。但是，在現有的分光分析方法中，在分析微小空間中的微量物質或微小物質的情況下，必需在真空環境內進行測定。另外，利用電子束或離子束產生試件破壞或損壞等問題。
另外，在處理溶液或生物組織中等超微量的試件的情況下，必需使用具有高的空間解析度並可以高精度進行分析的光學區域的顯微鏡。實際用作這種顯微鏡的限於雷射螢光顯微鏡。因此，分析的對象也自然限於雷射螢光顯微鏡螢光分子。
基於這種情況，要求如下分析方法，即不必真空環境，可非接觸進行非損壞的無擔心的分析，且分析對象也不限於螢光分子，具有高的空間解析度並可以高精度進行分析。
作為滿足這些要求的分析方法，利用光熱變換現象產生的熱透鏡效應的光熱變換分光分析法引人注意。
該光熱變換分光分析法是如下分析方法，即利用所謂光熱變換效應，當向試件聚光照射光時，由於試件中的溶質吸收的光所放出的熱能，溶媒局部溫度上升，從而折射率變化，形成熱透鏡。
圖3是熱透鏡的原理說明圖。
圖3中，若經顯微鏡的物鏡向極微小試件聚光照射激勵光，則感應光熱變換效應。大部分物質中，伴隨溫度上升，折射率變小。因此，聚光照射激勵光的試件越接近溫度上升程度大的聚光中心，折射率下降越大，越接近遠離聚光中心的周邊部，溫度上升的程度因熱擴散而越小，所以折射率下降越小。光學上該折射率的分布正好發揮與凹透鏡一樣的效應，所以將該效應稱為熱透鏡效應。該熱透鏡效應的大小、即凹透鏡的度數與試件的光吸收度成正比。另外，在折射率與溫度成正比變大的情況下，相反產生與凸透鏡一樣的效應。
這樣，上述光熱變換分光分析法觀察試件中的熱擴散、即試件的折射率變化，所以適於檢測極微小試件的濃度。
作為執行上述光熱變換分光分析法的光熱變換分光分析裝置，例如記載於特開平10-232210號公報中。
在這種光熱變換分光分析裝置中，將試件配置在顯微鏡的物鏡下方，從激勵光用光源輸出的規定波長的激勵光入射到顯微鏡，由物鏡聚光照射到試件中的極微量區域。將聚光照射後的激勵光的焦點位置作為中心，形成熱透鏡。
另一方面，從檢測光源放射波長與激勵光不同的檢測光，在入射到顯微鏡後，從顯微鏡射出。該射出的檢測光聚光照射到由激勵光形成於試件中的熱透鏡上。透過試件的檢測光因熱透鏡的效應而發散或聚光。從該試件發散或聚光後射出的光作為信號光，經聚光透鏡及過濾器、或僅經過濾器，由檢測器感光、檢測。檢測到的信號光的強度對應於試件中形成的熱透鏡折射率。
檢測光的頻率可以是與激勵光相同的頻率，另外，激勵光也可兼用檢測光。一般在設激勵光與檢測光的頻率不同的情況下，得到良好的靈敏度。
但是，上述光熱變換分光分析裝置由於光源、測定部或檢測部(光電變換部)的光學系統等的結構複雜，所以大型，缺乏可搬運性。因此，當利用該光熱變換分光分析裝置來進行分析或化學反應時，存在裝置的設置場所或裝置的操作被限定的問題，進而存在用戶的作業效率差的問題。
在使用利用熱透鏡的光熱變換分光分析法時，多數情況下激勵光的焦點位置與檢測光的焦點位置必需不同。圖4A、B是涉及激勵光的行進方向的熱透鏡的形成位置與檢測光的焦點位置的說明圖，圖4A表示物鏡中有色差的情況，圖4B表示物鏡中無色差的情況。
在物鏡130中有色差的情況下，如圖4A所示，熱透鏡131形成於激勵光的焦點位置132上，同時，檢測光的焦點位置133偏離激勵光的焦點位置132△L，所以可由該檢測光來檢測熱透鏡131的折射率變化，作為檢測光的焦距變化。另一方面，在物鏡130中無色差的情況下，如圖4B所示，檢測光的焦點位置133與激勵光的焦點位置132、即熱透鏡131的位置大致一致。結果，檢測光不會引起熱透鏡131的折射，所以不能檢測熱透鏡131的折射率變化但是，顯微鏡的物鏡通常被無色差地製造，所以由於上述理由，檢測光的焦點位置133與形成於激勵光的焦點位置132上的熱透鏡131的位置大致一致(圖4B)。因此，不能檢測熱透鏡131的折射率變化。從而，必然如圖5A及圖5B所示，每次測定時，形成熱透鏡的試件的位置都偏離檢測光的焦點位置133，或如圖6所示，使用未圖示的透鏡，使檢測光多少發散或聚光後入射到物鏡130，由此檢測光的焦點位置133偏離熱透鏡131，花費手續，存在用戶的作業效率差的問題。
發明內容
本發明的目的在於提供一種可進行高靈敏度測定的光熱變換分光分析方法及執行該方法的小型光熱變換分光分析裝置。
為了實現上述目的，根據本發明的第1形態，提供一種光熱變換分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透鏡將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定工序，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射工序中聚光照射的所述激勵光與所述檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置偏離所述激勵光的焦點位置的長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、30倍以下。
為了實現上述目的，根據本發明的第2形態，提供一種光熱變換分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透鏡將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定工序，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述激勵光與所述檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，檢測光的焦點位置相對激勵光的焦點位置的偏離是激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、25倍以下。
根據本發明的第1及第2形態，所述聚光透鏡最好是棒狀透鏡。
為了實現上述目的，根據本發明的第3形態，提供一種光熱變換分光分析裝置，具備聚光透鏡，將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定部件，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射的激勵光與檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置偏離所述激勵光的焦點位置的長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、30倍以下。
為了實現上述目的，根據本發明的第4形態，提供一種光熱變換分光分析裝置，具備聚光透鏡，將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定部件，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射的激勵光與所述檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置相對所述激勵光的焦點位置的偏離長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、25倍以下。
根據本發明的第3及第4形態，所述聚光透鏡最好是棒狀透鏡。
圖1是表示本發明實施形態的光熱變換分光分析裝置的示意結構圖。
圖2是表示△L與光熱變換分光分析方法下的信號強度的關係一例的圖。
圖3是熱透鏡的原理說明圖。
圖4A是關於激勵光的行進方向的熱透鏡的形成位置與檢測光的焦點位置的說明圖，表示物鏡中有色差的情況。
圖4B是關於激勵光的行進方向的熱透鏡的形成位置與檢測光的焦點位置的說明圖，表示物鏡中無色差的情況。
圖5A是關於激勵光的行進方向的熱透鏡的形成位置與檢測光的焦點位置的說明圖，表示熱透鏡關於檢測光的焦點位置形成於物鏡側的情況。
圖5B是關於激勵光的行進方向的熱透鏡的形成位置與檢測光的焦點位置的說明圖，表示熱透鏡關於檢測光的焦點位置形成於物鏡的相反側的情況。
圖6是現有光熱變換分光分析裝置中檢測熱透鏡的折射率變化的方法說明圖。
具體實施例方式
下面，參照附圖來詳細說明本發明實施形態的光熱變換分光分析方法及執行該方法的光熱變換分光分析裝置。
圖1是表示本發明實施形態的光熱變換分光分析裝置的示意結構圖。
圖1中，在從激勵光用光源111射出的激勵光的光路上，在激勵光用光源111附近，配置調製激勵光並使後述的熱透鏡信號S/N比提高的截光器(chopper)112。調製後的激勵光在由反射鏡114改變行進方向後，透過分色鏡113。在該分色鏡113的兩個面中與激勵光入射的面相反的面，入射來自檢測光用光源120的檢測光。檢測光被分色鏡113反射，與激勵光同軸後，導入具有適當色差的透鏡10。
透鏡10由可動的保持部15保持。在本實施形態中，透鏡10是折射率分布型棒狀透鏡。另外，透鏡10隻要具有規定的色差，則不限於折射率分布型棒狀透鏡。
該棒狀透鏡10由折射率從中心向周邊部連續變化的例如玻璃或塑料制的圓柱狀透明體構成(例如特開昭63-63502號公報)。
棒狀透鏡10已知作為集束性光傳導體，設軸上折射率為n0，2次分布常數為g，則從中心軸向半徑方向位於r距離位置上的折射率n(r)近似地由關於r的2次方程式n(r)＝n0{1-(g2/2)·r2}表示。
棒狀透鏡10在0＜z0＜π/2g的範圍內選擇其長度z0時，其成像特性兩端面平坦，與通常的凸透鏡相同，通過平行入射光線，在射出端的s0＝cot(gz0)/n0g的位置上形成焦點。
另外，棒狀透鏡10例如通過以下方法製造。
即，在以摩爾百分率SiO257-63％、B2O317-23％、Na2O5-17％、Tl2O3-15％為主要成分的玻璃形成棒後，在硝酸鈣鹽浴等離子交換媒體中處理該玻璃棒，將玻璃中的鉈離子及鈉離子與媒體中的鈣離子進行離子交換，在玻璃棒內提供從中心向周邊連續降低的折射率分布。
棒狀透鏡10的光軸在圓柱狀棒狀透鏡10的兩端面垂直交叉，所以可使激勵光及檢測光雙方的光軸容易地重合在棒狀透鏡10的光軸上。並且，該棒狀透鏡10與顯微鏡用物鏡相比小的多，所以可以使裝置整體小型化。
在X-Y試件臺125上配置在棒狀透鏡10的下方流過用於檢測的試件的帶流路板狀部件20。X-Y試件臺125可動的區域是圖1的紙面上與紙面正交的平面內。
流過用於檢測的試件的帶流路板狀部件20由重疊3層粘接的玻璃基板201、202、203構成，在中間的玻璃基板202中，形成用於混合、或攪拌、或合成、或分離、或抽取、或檢測試件等的流路204。
該帶流路板狀部件20的材料從持久性、耐藥性方面，期望是玻璃。尤其是若考慮細胞等生物試件、例如作為DNA分析用的用途，則最好是耐酸性、耐鹼性高的玻璃，具體而言，最好是硼矽酸玻璃、礆石灰玻璃、鋁硼矽酸玻璃、石英玻璃等。但是，通過限定用途，可使用由塑料等有機物質製造的物質。
棒狀透鏡10的激勵光的焦點位置必需位於帶流路板狀部件20的流路204中。但是，棒狀透鏡10不必接觸帶流路板狀部件20，在接觸的情況下，可由板狀部件20的上部玻璃板201的厚度來調整棒狀透鏡10的焦距。在上部玻璃板201的厚度不夠的情況下，也可在棒狀透鏡10與上部玻璃板201之間加入用於調整焦距的隔板。在這些情況下，因為也不必調整焦距，所以可進一步小型化裝置。
以下說明激勵光的焦點位置與檢測光的焦點位置的偏差(ΔL)為多大合適。在測定對象物是非常薄的薄膜的情況下，得到用於聚光照射激勵光的物鏡的共焦點長度的√3倍最佳的結果(Analyst，August1995，Vol.120，2053)。共焦點長度(Icnm)由Ic＝π·(d/2)2/λ1來計算。這裡，d是由d＝1.22×λ1/NA計算的愛裡盤，λ1是激勵光的波長(nm)，NA是所用的棒狀透鏡10的數值孔徑。ΔL的值表示激勵光的焦點位置與檢測光的焦點位置的差，所以檢測光的焦距不會因比激勵光的焦距長還是短而不同。
但是，上述ΔL的最佳值是在激勵光與檢測光為相同頻率、試件相對物鏡的共焦點長度不厚的情況下得到的。
當前，在微小空間中進行化學反應的集成化技術從化學反應的高速性、微小量的反應、在位(on site)分析等觀點看引人注意，世界上潛心進行研究。
作為上述集成化技術之一，有在小的玻璃基板等中製作的細微流路中進行全部試件的混合、反應、分離、抽取、檢測。這既可以僅將分離作為目的的單一功能下使用，也可複合使用。
作為僅將分離作為目的，提議分析極微量的蛋白或核酸等的電泳裝置。具備由彼此接合的兩塊玻璃基板構成的帶流路板狀部件(例如特開平8-178897號公報)。
形成於其中使用的板狀部件的流路必需邊維持作為液體的特性邊流過溶液，所以深度通常為50-100微米左右。在該流路中作為測定對象物的溶液流過的狀態下，實施光熱變換分光分析，意味著測定對象物的厚度(深度)比激勵光的共焦點長度大得多。例如，由NA(數值孔徑)0.4的物鏡聚光波長為532nm的激勵光情況下的共焦點長度為3.9微米，流路的厚度是其10倍以上。將測定對象的厚度比共焦點長度大的情況與上述薄膜相比，生成熱透鏡的薄膜與在厚度方向上層疊多數的狀態相同，最終變為其積分值，所以可以預想激勵光與檢測光的焦點位置偏差的最佳值比薄膜的情況還大。但是，若激勵光與檢測光的焦點位置偏差過大，則透過激勵光生成的熱透鏡的檢測光量變得過少，檢測靈敏度降低。因此，光熱變換分光分析方法中使用的物鏡具有的色差、即激勵光的焦點位置與檢測光的焦點位置的差(ΔL)期望是激勵光的共焦點長度的2倍-30倍，更期望是2倍-25倍。進一步期望是3倍-25倍。
在用於光熱變換分光分析方法中的激勵光的強度小的情況或測定對象物的濃度低的情況等，由於離開激勵光的焦點位置的部分中熱透鏡的度數變小，所以預想積分測定對象物的厚度整體的熱透鏡效應變小。在這種情況下，期望ΔL比上述值小。從而，期望ΔL為2倍-25倍，較期望是3倍-25倍、更期望是3倍-20倍。
這裡，示例使用折射率分布型棒狀透鏡得到何種程度色差。在所用的折射率分布型棒狀透鏡中，使用日本板硝子株式會社的SELFOC透鏡目錄中記載的SLH透鏡。該目錄中記載了直徑為1.8mm透鏡的特性，所以將其換算成直徑1mm後使用。
在設帶流路板狀部件的材質為パィレツクス(註冊商標)玻璃、比流路靠上的部分的厚度(上部玻璃201的厚度)為0.18mm、流路深度為0.1mm、折射率分布型棒狀透鏡SLH的直徑為1mm、該透鏡中光實際透過的有效直徑為0.7mm、棒長為1.7mm、激勵光波長為488nm、檢測光波長為633nm、激勵光的焦點位置位於流路正中的情況下，激勵光與檢測光的焦點位置差(ΔL)為45微米。此時的焦點位置中的NA為0.46，激勵光下的共焦點長度為2.7微米。因此，△L為共焦點長度的約17倍。
圖2是表示ΔL與光熱變換分光分析方法下的信號強度的關係一例的圖。圖2所示信號強度是在下述條件下測定的。
使用無色差、NA為0.4的顯微鏡物鏡來作為物鏡。激勵光原樣導入物鏡，在檢測光入射到物鏡以前，通過發散或聚光，使焦點位置變化。試件是以10-4摩爾的濃度來溶解落日黃的水溶液，流入0.1mm厚度的流路中。激勵光的波長為532nm，檢測光的波長為633nm。圖2在這種條件下使激勵光的焦點位置位於溝的中心，從該位置向光軸方向偏離檢測光的焦點位置，測定由光熱變換分光分析方法得到的信號強度並繪製。
圖2中，信號強度最高是ΔL約為60微米的情況，是激勵光的共焦點長度的約15倍(相對激勵光的共焦點長度為3.9微米)。在得到的信號強度為最高強度的1/2以上的區域中，ΔL為從激勵光的共焦點長度的4倍到27倍。
在作為面向上述帶流路板狀部件20的流路204的位置、夾持帶流路板狀部件20並面對棒狀透鏡10的位置上，配置激勵光與檢測光分離、僅使檢測光選擇透過的波長過濾器116及檢測透過該波長過濾器116的檢測光的光電變換器117。在光電變換器117之前也可插入僅使檢測光的部分透過的針孔。由光電變換器117得到、由前置放大器121放大的信號被發送到鎖定放大器122，與截光器112同步，之後，由計算機123進行分析。
根據本發明的實施形態，由於棒狀透鏡10具有使用的激勵光及檢測光的波長及適於測定用的帶流路板狀部件20的流路204的尺寸等的色差量，所以可高靈敏度測定，同時，不必在外部設置調整激勵光或檢測光的焦點位置的光學系統，所以可小型化裝置。
產業上的可利用性如上詳細所述，根據本發明，激勵光與檢測光的頻率不同，聚光透鏡中檢測光的焦點位置偏離激勵光的焦點位置的長度為激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上30倍以下，所以提供足夠的信號強度，結果，可高靈敏度測定。
在本發明中，激勵光與檢測光的頻率不同，聚光透鏡中檢測光的焦點位置偏離激勵光的焦點位置的長度為激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上25倍以下，所以信號強度更大，結果，可更高靈敏度測定。
在本發明中，因為聚光透鏡是棒狀透鏡，所以可省略調整激勵光及檢測光的焦點位置用的光學系統，因此可小型化裝置。
權利要求
1.一種光熱變換分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透鏡將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定工序，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射工序中聚光照射的所述激勵光與所述檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置偏離所述激勵光的焦點位置的長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、30倍以下。
2.一種光熱變換分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透鏡將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定工序，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射的激勵光與檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置偏離所述激勵光的焦點位置的長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、25倍以下。
3.根據權利要求1或2所述的光熱變換分光分析方法，其特徵在於所述聚光透鏡是棒狀透鏡。
4.一種光熱變換分光分析裝置，具備聚光透鏡，將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定部件，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射的激勵光與檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置偏離所述激勵光的焦點位置的長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、30倍以下。
5.一種光熱變換分光分析裝置，具備聚光透鏡，將激勵光與檢測光聚光照射到試件上；和測定部件，測定透過所述激勵光的聚光照射生成的熱透鏡的檢測光的偏向所伴隨的強度變化，其特徵在於所述聚光照射的激勵光與所述檢測光的頻率不同，所述聚光透鏡中，所述檢測光的焦點位置偏離所述激勵光的焦點位置的長度是所述激勵光的頻率下共焦點長度的2倍以上、25倍以下。
6.根據權利要求4或5所述的光熱變換分光分析裝置，其特徵在於所述聚光透鏡是棒狀透鏡。
全文摘要
本發明提供一種可進行高靈敏度測定的光熱變換分光分析方法及執行該方法的光熱變換分光分析裝置，光熱變換分光分析裝置包括在從激勵光用光源(111)的激勵光的光路上配置在激勵光用光源(111)附近的截光器(112)、改變激勵光的行進方向的反射鏡(114)、入射來自檢測光用光源(120)的檢測光、使激勵光與檢測光變為同軸的分色鏡(113)、具有適當色差的透鏡(10)、將該透鏡(10)調整到3軸進行保持的保持部(15)。
文檔編號G01N25/16GK1516809SQ0281203
公開日2004年7月28日 申請日期2002年6月7日 優先權日2001年6月13日
發明者山口淳, 服部明彥, 北森武彥, 渡慶次學, 學, 彥 申請人:日本板硝子株式會社, 財團法人神奈川科學技術研究院