轉基因菸草及其獲得方法和應用的製作方法
2023-05-18 20:44:56 1
轉基因菸草及其獲得方法和應用的製作方法
【專利摘要】一種植物病原黃單胞菌ssbX轉基因菸草，是將來自稻黃單胞菌的ssbX基因通過農桿菌介導的方式轉入菸草中，獲得ssbX轉基因菸草；所述ssbX基因序列如SEQ ID NO.1所示，序列長度為552bp；ssbX基因的蛋白質序列如SEQ ID NO.2所示，編碼183個胺基酸。ssbX基因的啟動子為CaMV 35S，其序列如SEQ ID NO.3所示，序列長度為538bp。ssbX轉基因菸草的篩選標記基因為Km，序列如SEQ ID NO.4所示，序列長度為792bp。本發明獲得的植物病原黃單胞菌ssbX轉基因菸草，在菸草植物中表達，增強了對病毒病和細菌病害的抗病性，可作為抗病育種資源。
【專利說明】植物病原黃單胞菌SSbx轉基因菸草及其獲得方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術，特別涉及一株植物病原黃單胞菌SsbxR基因菸草及其 獲得方法和應用。 技術背景
[0002] 稻黃單胞菌種下的水稻條斑病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)和水 稻白葉枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的兩個致病變種，分別引起水稻發生水稻 細菌性條斑病（簡稱條斑病）（BacterialLeafStreak，BLS)和水稻白葉枯病（Bacterial LeafBiight，BLB)，是水稻上的重要細菌病害。稻黃單胞菌與水稻互作，也同其他植物病原 物-植物互作一樣，存在著相互鬥爭並協同進化著的過程。植物在生長發育過程中面臨著 非常複雜的生存環境和遭受病原真菌、細菌和病毒的侵染。經過漫長進化，植物逐漸形成了 一系列複雜的主動適應機制以防禦病原菌的侵染。在病原菌侵染位點，免疫性的植物產生 過敏反應（HypersensitiveResponse，·)，並通過活性氧（ROS)迸發、內源水楊酸（SA)的 積累和信號傳導，使植株產生系統獲得性抗性（SystemicAcquiredResistance,SAR)或 誘導性系統抗性（InducedSystemicResistance,ISR)。植物在抵禦病原菌侵染時通常由 2個防禦系統：第1層防禦系統稱為病原相關分子模式觸發的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI)，它通過模式識別受體（patternrecognitionreceptors，PRRs)來識別病 原菌共有的PAMPs。例如，細菌鞭毛蛋白（flagellin)、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)、 真菌的葡聚糖（glucans)、幾丁質（chitins)等是已經鑑定的PAMPs。這些PAMPs可被植物 的PRRs識別，迅速觸發基礎免疫性，包括HR產生（有時也不產生HR)、活性氧迸發（ROS)、 植物保衛素（Phytoallexin)的產生以及一些病程相關蛋白基因的表達。此類防禦反應可 以有效地抑制病原菌的生長，阻止植物病害的發生。
[0003] 較早認識激發非寄主植物產生HR的是在革蘭氏陰性植物病原細菌中發現的。隨 後認為革蘭氏陰性植物病原細菌產生的harpin蛋白直接與HR產生相關，並認為harpin蛋 白也是PAMPs。為了進一步的明確harpin蛋白的功能及與植物互作的機制，越來越多的研 究把目光放在了尋找植物中存在的harpin蛋白的受體或互作蛋白上以及利用植物基因工 程技術研究harpin轉基因株系的抗病性。目前X.oryzaepv.oryzicola中已知的harpin 蛋白是由hrp基因族中的hpal基因編碼的。
[0004]除Hpal外，還發現hrp基因族外的Single-strandedDNA-bindingprotein(Ssbx) 編碼基因也具有harpin蛋白的特性：受HrpG和HrpX調控並通過T3SS途徑分泌、對熱穩定、 對蛋白酶K敏感，能激發菸草產生HR，且在產生HR的菸草細胞中發生明顯的基因組DNA片 段化、誘導菸草中活性氧迸發和胼胝質的積累、激活植物的基礎防衛反應基因的表達，如： HINl和HSR203J等（Lietal.，2013)。據此，將Ssbx 蛋白稱之為harpin-likeprotein B(HlpB)。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的，是通過將過敏反應的激發子轉入菸草中，提供一種植物病原黃單 胞菌SSbx轉基因菸草及其獲得方法和應用。
[0006] 為了實現本發明的目的，本發明採用了以下技術方案：
[0007] -種植物病原黃單胞菌SSbx轉基因菸草，是將來自稻黃單胞菌的SSbx基因通過農 桿菌介導的方式轉入菸草中，獲得Ssbx轉基因菸草；所述SSbx基因序列如SEQIDN0.1所 示，序列長度為552bp;SSbx基因的蛋白質序列如SEQIDNO. 2所示，編碼183個胺基酸。
[0008] 所述SSbx基因的啟動子為CaMV35S，其序列如SEQIDNO. 3所示，序列長度為 538bp。
[0009] 所述ssbx轉基因菸草的篩選標記基因為Km，序列如SEQIDNO. 4所示，序列長度 為 792bp。
[0010] 上述植物病原黃單胞菌SSbx轉基因菸草的獲得方法，包括以下步驟：
[0011] A、將來自稻黃單胞菌的^匕基因構建在轉基因載體PCAMBIA2300上，獲得重組載 體pCSsbX;
[0012] B、將重組載體pCSsbX轉入農桿菌EHA105中，再感染菸草葉肉細胞，在含有卡那黴 素的MS培養基上獲得再生植株；
[0013]C、以Ssb5^PKm基因為靶標基因，通過PCR和Southern雜交技術對菸草再生植株 進行篩選，獲得SSbx轉基因菸草植株。
[0014] 上述植物病原黃單胞菌SSbx轉基因菸草的應用，所述^匕基因轉入菸草後在菸草 中穩定表達，顯著提高菸草對細菌和病毒病害的抗性。
[0015] 本發明將SSbx基因通過農桿菌介導的方式轉入菸草中，整合到染色體上，獲得了 SSbx轉基因菸草，該SSbx轉基因菸草顯著提高了菸草對細菌病害和病毒病害的抗性，對於 培育抗病菸草品種，具有極大的應用價值。
[0016] 本發明中所涉及的SSbx轉基因菸草和其提高了菸草抗病性為首次報導。^匕基 因序列可在Xanthomonasresource網站上查詢獲得（http://www.xanthomonasorg)， CaMV35S啟動子和Km基因序列可在NCBI資料庫中查詢獲得（http://www.ncbi.nlm.nih. gov)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1為SSbx轉基因載體的構建過程示意圖；
[0018] 圖2為SSbx轉基因菸草的檢測和SSbx基因的表達；
[0019] 圖3為SSbx轉基因菸草生長能力測定；
[0020] 圖4為SSbx轉基因菸草抗病能力測定；
[0021] 圖5為SsbxR基因菸草中防衛基因的表達測定。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0023] 實施例
[0024] 1、ssbx轉基因載體的構建
[0025] 以水稻條斑病菌RS105菌株gDNA為模板，利用引物Ssb-F(BmaHI)(SEQID N0.5):5'-CGGGATCCATGGCCCGCGGCATCAATAAAGI^PSsb-R(XbaI):(SEQIDN0.6):5'CCAAG CTTTCAGAACGGGATATCGTCGTCGGC，通過PCR擴增獲得 552bp的ssbx 基因（SEQIDN0. 1)產物， 測序正確後通過XbaI和BamHI雙酶切，構建在經過XbaI和BamHI雙酶切的pCAMBIA2300 載體上，並且使其置於CaMV35S啟動子下，獲得重組載體pCSsbX(圖1A)。重組載體pCSsbX 經XbaI和BamHI以及HindIII和SacI雙酶切驗證正確後轉化農桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中用於後續轉基因實驗（圖1B)。
[0026]質粒pCAMBIA2300 和EH105 為公知公用，見文獻Chenetal.，2009。
[0027] 2、ssbx轉基因煙早的犾得和ssbx基因表達的檢測
[0028] 將含有Ssbx轉基因的重組載體pCSsbX的農桿菌菌株EHA105活化後，單菌落接種 於2mLYEB液體培養基（含Km50μg/mL和Rif25μg/mL)中，28°C震蕩培養過夜至對數生 長期，在無菌狀態下4,OOOrpm離心IOmin收集菌體經洗滌後用於感染菸草葉肉愈傷細胞。
[0029]從菸草（Nicotianatobacumcv.Xanthi)完全展開的葉上取0· 5X0. 5cm2 的葉蝶， 經70%乙醇中浸泡30sec和浸入30%的次氯酸鈉溶液中5min表面消毒以及無菌水衝洗 後，置於MS培養培養基上25°C黑暗下與農桿菌共培養2-3天。按照葉盤方法獲得再生植 株。再生植株置於菸草生長條件的溫室中培養，獲得轉基因菸草Ttl代種子。
[0030] 農桿菌介導的轉基因菸草方法為公知公用，見文獻Horsh，etal.，1985。
[0031] 選取Ttl代菸草植株TSsbl、TSsb-2和TSsb-3,以未轉基因的菸草WT和轉空載體 PCAMBIA2300的菸草EV為對照，按照AxyPrep基因組DNA小量試劑盒（Axygen，USA)提取 gDNA後作為模板，以Ssb-F(BmaHI)(SEQIDNO. 5)和Ssb-R(XbaI)(SEQIDN0. 6)以及引 物Kana-F(SEQIDNO. 7)和Kana-R(SEQIDNO. 8)為引物，分別PCR擴增目標基因ssbx(SEQ IDNO. 1)和Km(SEQIDNO. 4)，發現僅在TSsb-l、TSsb-2 和TSsb-3 植株中有 552bp的ssbx 基因（圖2A)，確定TSsb-1、TSsb-2和TSsb-3植株中轉入了ssbx基因。
[0032]按照Trizol試劑盒（Invitrogen，USA)提取上述植株的RNA，經RNase-freeDNase I試劑盒（TaKaRa，China)去除gDNA後，按照AMVandEx-TaqDNApolymerase(TaKaRa， China)方法合成cDNA並作為模板，以以Ssb-F(BmaHI)(SEQIDNO. 5)和Ssb-R(XbaI) (SEQIDNO·6)以及引物Kana-F(SEQIDNO·7)和Kana-R(SEQIDNO·8)為引物，定量PCR 方法測定ssbx轉基因菸草植株中的ssbx基因的表達。發現TSsb-I、TSsb-2和TSsb-3植株 中SSbx基因穩定表達（圖2B)。
[0033] 將上述植株的gDNA，通過XbaI和BamHI雙酶切，以ssbx基因（SEQIDNO. 1)為 探針，通過Southern雜交，發現TSsb-I和TSsb-2植株中存在ssbx基因（圖2C)，確認TSsb-I 和TSsb-2為正確的用於後續實驗的材料。
[0034] 3、SSbx轉基因菸草生長能力測定
[0035]取WT、EV、TSsb-l和TSsb-2植株Ttl代種子50粒催芽育苗，於（25°C，光照/黑暗， 16h/8h)下培養20天後發現，SSbx轉基因菸草植株生長弱於WT和EV植株（圖3A)。洗根後 測定根長和莖長發現，Ssbx轉基因菸草根長和莖長顯著短於WT和EV菸草（圖3B、圖3C)。 成株期的Ssbx轉基因菸草高度也低於WT和EV菸草（圖3A)。說明Ssbx基因異源表達後 降低了菸草的生長勢。
[0036] 4、ssbx轉基因菸草抗病能力測定
[0037]待WT、EV和ssbx轉基因菸草生長至6片葉時，將病原細菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000的hopQl-1菌株調至I X 105CFU/mL，按照Wei等人（2007)用無針頭注 射器注入菸草葉肉細胞中，在接種〇、1、2、3、4和5天時取注射區域菸草葉，經表面消毒後置 於ImL無菌水中研碎，按照10、10-\ 10-2梯度稀釋，取100 μ L塗板於KB培養基上，於25Γ 下培養3d後統計菌落數。發現Ssbx轉基因菸草中hopQl-Ι菌株的生長數少於WT和EV煙 草，說明Ssbx轉基因菸草提高了抗病性（圖4A)。
[0038]按照Ge et al. (2005)文獻方法，對WT、EV和Ssbx轉基因菸草進行菸草花葉病毒 (TMV)摩擦接種。TMV病毒濃度為6Xl(T3mg/mL，含600目金剛砂少許，用棉籤塗布菸草葉 表面，7天後在三生菸葉上觀察統計TMV產生的枯斑數。結果發現，SSbx轉基因菸草產生的 枯斑數顯著少於WT和EV煙（圖4B)，說明Ssbx基因提高了菸草對TMV病毒的抗性。
[0039] 5、Ssbx轉基因菸草中防衛基因的表達測定
[0040]如上述，WT、EV和Ssbx轉基因菸草接種hopQl-Ι菌株後，於接種後的0和8小時， 取注射區域的菸草組織，按照Trizol試劑盒（InvitrogemUSA)提取上述菸草組織的RNA， 經RNase-free DNase I試劑盒（TaKaRa，China)去除gDNA後，按照AMV and Ex-Taq DNA polymerase (TaKaRa，China)方法合成cDNA並作為模板，以Che等人（2013)報導的引物為 引物，1^&1-乜1^?〇?方法比較0和8小時點？1?11、？1?1-13、!1預1、邯1?203<1和361'1基因的 表達量。結果發現，Ssbx轉基因菸草中上述基因的表達量顯著高於WT和EV菸草（圖5)， 說明ssbx基因表達提尚了菸草的抗性。
[0041]關於農桿菌介導的轉基因方法和菸草生長條件：Sohn et al.，Transgenic tobacco expressing the hrpN(EP) gene from Erwinia pyrifoliae triggers defense responses against Botrytis cinerea. Molecular Cells，2007,24 (2) :232-239.
[0042]關於基因重組分子操作和PCR技術：Sambrook J，Russell DW，Molelcular cloning，A Laboratory Manual(3rd ed)，2001，Spring Harbor Laboratory Press。
[0043]關於ssbx基因的特性以及菸草中抗病基因測定：Li et al.，A highly-conserved single-stranded DNA-binding protein in Xanthomonas functions as a harpin-like protein to trigger plant immunity. PLoS ONE,2013,8(2) :e56240〇
[0044]關於hopQl-1菌株以及接種菸草方法：Wei et al.，A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQl-I is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant Journal，2007,51 (I)： 32-46.
[0045]關於TMV接種菸草方法：Ge et al.，Beta-Aminobutyric acid-mediated enhancement of resistance in tobacco against TMV and consideration of its capability in Wounded tobacco plants. Indian J Biochem Biophys，2005,42 (3)： 166-72.
[0046]關於質粒pCAMBIA2300和Ε?105的應用：Chen et al.，Expression of thymosin a I concatemer in transgenic tomato(Solanum lycopersicum)fruits. Biotechnol Appl Biochem. 2009. 52,3032312。
[0047] 序列表 上海交遘大學 <12_鞫痛黶黌攀廳菌___寧臟響纖靡_ <1修* PaiaitIn version 3.5 I 552 DNA Xanthomonas oryzaepv.oryzicola <220--% CDS(1M552) 1 etewcpg ieteMtw igiMccic gtcggcaaee ligpa?p isepae 雜 I^necce aggccggcal ggcpiciiMegciipgw Iggccaccac tm ?ΙΡΜΙΜCem^sgcaccpglggc ?cgcgtggt gttlitegia 誦 --ctecg幽cpgiie^Cgeaeggpt^piggttllggpiec 纖 acpcMM* ?UteUgga^gigg _ mm§m %?ι?ρ*ι 麵 $4〇 etcccgttctgd 552 2 1S3PRT Xantktmonm or^mp￥,or^ieota Ssbx蛋白僱 CDS (1),.(183) 2 Mrt Ala Al* Oly He Asn Lys Val He Leu Val Oiy Asn Leu Gly AsnJ 5 10 15 Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Thr Gln Ala G!y Met Ala He Ibr Are V-ai 20 25 Ii Ser Leu Aia Tk Thr Scr Met Aif Lys Asp Aig (51ii Gly Asn Asn GlnM m 45 Giu Aif Thr Glu Trp His Aig Val Val Phe Phe Oly Lys Leu GIy Oiu50 55 60 He Ala Oly Olii T^r Lew Aig Lys Gly Ser Gln￥alTyr VaiCjIuG1j> 65 70 ?5 ? OIu Leu ArgTytAsp Lys Tjt Thr Qly Gln Asp GIy Vai Gla Lys fyr SS M ? Ser Thr Asp He Val Ala Asn Gh Met Leu Met Leu Oly Gl^ Aig Gly Η? IOS HO Olu Gly Gly Oly Gly Cly Met GIy Gly Glu Aig Pro OIn Arg Ser Gln115 120 125 Ak Pro Aif Oln Gln Gln Gfy GIy Cly Gl| Oly Gln Gly Asp GIy GIjf
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【權利要求】
1. 一種植物病原黃單胞菌ssbx轉基因菸草，是將來自稻黃單胞菌的ssbx基因通過農 桿菌介導的方式轉入菸草中，獲得ssbx轉基因菸草；所述ssbx基因序列如SEQ ID N0.1所 示，序列長度為552bp;SSbx基因的蛋白質序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼183個胺基酸。
2. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因菸草，其特徵在於，所述ssbx基因的 啟動子為CaMV 35S，其序列如SEQ ID NO. 3所示，序列長度為538bp。
3. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因菸草，其特徵在於，所述ssbx轉基因 菸草的篩選標記基因為Km，序列如SEQ ID NO. 4所示，序列長度為792bp。
4. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因菸草的獲得方法，其特徵在於，包括 以下步驟： A、 將來自稻黃單胞菌的ssbx基因構建在轉基因載體pCAMBIA2300上，獲得重組載體 pCSsbX ； B、 將重組載體pCSsbX轉入農桿菌EHA105中，再感染菸草葉肉愈傷細胞，在含有卡那黴 素的MS培養基上獲得再生植株； C、 以881^和Km基因為靶標基因，通過PCR和Southern雜交技術對菸草再生植株進行 篩選，獲得ssbx轉基因菸草植株。
5. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因菸草的應用，其特徵在於：所述ssbx基因轉入菸草後在菸草中穩定表達，顯著提高菸草對細菌和病毒病害的抗性。
【文檔編號】C12N15/84GK104357481SQ201410691935
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月25日 優先權日:2014年11月25日
【發明者】陳功友, 鄒麗芳, 孫玉靜, 馬文秀 申請人:上海交通大學