一種基因定點突變方法和以此方法獲得的抗草甘膦基因及其表達載體和轉化子的製作方法

2023-05-18 18:22:36 3

專利名稱：一種基因定點突變方法和以此方法獲得的抗草甘膦基因及其表達載體和轉化子的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種基因定點突變方法和通過該方法獲得的重組細菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因(aroA)、以及含有此基因的表達載體和轉化子。
背景技術：
草甘膦是使用最為廣泛的廣譜除草劑，具有對人畜無毒，雜草難以對它產生抗性，低土壤殘留量等特點，市場潛力巨大。
5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶(E.C.2.5.1.19)，催化植物和微生物中的莽草酸代謝途徑倒數第二個反應，使PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)與3-磷酸莽草酸反應生成EPSP(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸)和無機磷。由於草甘膦具有與PEP相似的結構，可形成EPSP合成酶·S-3-P·草甘膦複合物，阻遏PEP與酶的結合，阻斷芳香族胺基酸的的合成，從而殺滅絕大多數的植物，雜草和農作物皆不例外。
由於草甘膦可無選擇地殺死雜草和作物，因此而制約了它在農業上的應用，使之不能被大規模用於作物的田間除草。然而草甘膦價格便宜，是目前農民最喜用的除草劑。為了適應市場的需要，從二十世紀八十年代中期開始，人們為培育抗草甘膦農作物作了大量的工作。其中最成功的例子是將改良過的草甘膦靶標酶EPSP合成酶導入植物中，以提高轉基因植物對草甘膦的抗性。
過去採用定點突變法改良EPSP合成酶來降低酶對草甘膦親和力。由於對酶的三維結構和胺基酸位點的作用並不完全清楚，所以使用定點突變法取得的效果十分有限。以往的定點突變方法遇到的問題是，突變後酶降低了對草甘膦的親和力的同時對酶原底物的親和力也下降，因而影響了酶的催化活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種基因定點突變方法，採用此方法，可以人為加大發生基因突變的準確性；並運用該方法，把通過基因優化法獲得的突變基因作進一步改良，獲得活性更高而草甘膦敏感度更低的EPSP合成酶基因並將之用於轉基因植物。
本發明的基因定點突變方法是選用具有如下結構特點的DNA序列作源模板需突變的位點與一單酶切位點相距10-20個鹼基；根據該源模板的序列特點，設計出與源模板序列相對應的一個5』-端引物和兩個3』-端引物，並採用兩步PCR擴增反應，從而得到引入點突變的基因片段。
首先，選定要進行定點突變的序列作為源模板，根據該源模板序列設計一個5′端引物和兩個3′端引物；重點在兩個3』-端引物的設計上。5』-端引物與源模板的5』-端序列相對應，而兩個3′端引物問有10-20個鹼基的重疊序列，並且其一帶有需要在擴增產物中引入的突變序列，另一帶有需要在擴增產物中引入的酶切位點序列。由5′端引物和帶有突變序列的3′端引物進行第一輪PCR擴增反應，得到引入突變位點的擴增產物；再以此擴增產物為模板，利用原5′端引物和帶有酶切位點的3′端引物進行第二輪擴增，把酶切位點引入到前述帶突變位點的序列的3′端；最終，獲得既帶有突變序列，又帶有酶切位點的DNA片段。再通過將該片段與源模板上的相應片段進行酶切片段互換，實現基因序列的定點突變。
通常，上述本發明的基因定點突變方法所用PCR擴增方法的具體條件和操作步驟如下第一步擴增反應反應系統以約102-104拷貝源模板DNA、1×TaqDNA聚合酶緩衝液、4種dNTP各200μmol/L、根據源模板設計的5』-端引物和帶有需引入的突變序列的3』-端引物各20pmol以及TaqDNA聚合酶約0.5-5U構成反應系統。
反應條件為[1]94℃ 5分鐘[2]循環94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循環30次[3]72℃ 10分鐘通過瓊脂糖凝膠電泳，分離第一步PCR擴增的產物，用作第二步擴增的模板。
第二步擴增反應反應系統以約102-104拷貝第一步PCR擴增的產物DNA、1×TaqDNA聚合酶緩衝液、4種dNTP各200μmol/L、根據源模板設計的5』-端引物和帶有帶有酶切位點的3』-端引物各20pmol以及TaqDNA聚合酶約0.5-5U構成反應系統。
反應條件為[1]94℃ 5分鐘[2]循環94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循環30次[3]72℃ 10分鐘反應完畢，再通過瓊脂糖凝膠電泳分離純化擴增產物，與源模板分別進行酶切，把帶突變序列的新片段，連接到源模板上的相應位置，從而實現定點突變。
發明人的研究發現，基因優化法能克服定點突變的局限性，增大了發生突變的速度和幅度。若在基因優化法獲得的突變基因的基礎上，再有目的地進行定點突變，兩者相結合，則能減少單純使用定點突變法的盲目性。因此，上述本發明的基因定點突變方法所用的源模板優選通過基因優化方法(參見CN1358858A專利申請)獲得的突變基因序列，或者是攜帶有通過基因優化方法獲得的突變基因序列的質粒。
按照上述本發明的基因定點突變方法，以通過CN1358858A專利申請公開的基因優化方法獲得的細菌EPSP合成酶基因aroA-M1(序列表中2101序列)作為源模板，並設計出三個與該源模板和點突變要求相對應的引物
引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′經兩步PCR擴增，最終獲得發生了點突變的新基因，命名為aroA-M142。aroA-M142的表達蛋白與aroA-M1基因編碼的胺基酸序列相比，在位點42上，發生由蛋氨酸替代蘇氨酸的變化。
aroA-M1的DNA序列及其表達蛋白的胺基酸序列分別見序列表2101和2102序列所示；aroA-M142的DNA序列及其表達蛋白的胺基酸序列分別見序列表2103和2104序列所示。
將aroA-M142基因片段插入到質粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位點之間，即可得到含有aroA-M142基因序列的質粒pET-aroA-M142。
將aroA-M1基因片段插入到質粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位點之間，即可得到含有aroA-M1基因序列的質粒pET-aroA-M1(該質粒結構參見附圖4)。若直接以質粒pET-aroA-M1為源模板，按照與上述以aroA-M1為源模板相同的步驟和條件進行定點突變，則可直接得到帶有發生了定點突變的新基因aroA-M142的質粒pET-aroA-M142。
將質粒pET-aroA-M142轉化大腸桿菌BL-21(DE3)，即可獲得命名為BL21(aroA-M142)的轉化子。
下面通過實施例和附圖進一步詳細敘述本發明


圖1pET-aroA-M142質粒結構圖；圖2aroA-M1基因定點突變為aroA-M142的原理示意圖；圖3各轉化子的蛋白電泳圖；圖4pET-aroA-M142質粒構建路線示意圖；圖5轉化子在含30mM草甘膦的M9液體培養基中的生長曲線；圖6轉化子在含60mM草甘膦的M9液體培養基中的生長曲線。
具體實施例方式
實施例1突變EPSP合成酶基因aroAM142及其表達載體pET-aroA-M142的獲得利用前面所述的基因定點突變法，使aroAM1基因序列124-126位置發生ACC→ATG的變化，使其表達的EPSP合成酶蛋白的第42位胺基酸殘基發生Thr→Met的置換。
定點突變原理如圖2所示。圖2中primer1、primer2和primer3分別代表引物A、引物B和引物C；ACC代表源模板上原有序列，ATG代表突變後序列；NcoI和NdeI分別代表酶切位點。
具體操作方法如下直接以質粒pET-aroA-M1為源摸板。
由於aroAM1基因上距離編碼酶蛋白的第42位胺基酸殘基的124-126核苷酸序列約20個bp處，有一NdeI酶切位點。通過兩輪引物重疊的PCR擴增反應，把點突變序列和酶切位點引入擴增產物中，再通過擴增產物與pET-aroA-M1質粒DNA之間酶切片段的互換，完成定點突變的操作。根據aroAM1基因的結構特點，我們設計了下列三個引物引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′其中，引物A根據aroA-M1的5′端序列設計，引物B和引物C根據aroAM1基因DNA序列118-150bp而設計，引物B、C之間有19個鹼基的重疊；引物A、C的下劃線處，分別代表NcoI和NdeI酶切位點，引物B中的加黑斜體(CAT)處，表示在PCR擴增產物中引入的突變序列。
需要通過兩次PCR擴增反應才能完成突變。
第一次PCR反應以約102-104拷貝pET-aroA-M1質粒模板DNA、1×TaqDNA聚合酶緩衝液、4種dNTP各200μmol/L、引物A和B各20pmol以及TaqDNA聚合酶約0.5-5U構成反應系統。
反應條件為[1]94℃ 5分鐘[2]循環94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循環30次[3]72℃ 10分鐘擴增反應完畢，走1％瓊脂糖凝膠電泳並使用「QIAquick Gel Extration Kit＂分離純化大小約為130bp的PCR擴增產物，該擴增產物應含有點突變序列。
取約102-104拷貝上述擴增產物作為第二輪PCR反應的模板，並以1×TaqDNA聚合酶緩衝液，4種dNTP各200μmol/L，引物A和C各20pmol，TaqDNA聚合酶約0.5-5U構成反應系統。反應條件同上。反應完畢，經1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗證明獲得大小約為150bp的片段，該片段既帶有突變序列，又帶上NdeI酶切位點序列。
表達載體pET-aroA-M142的構建路線如圖4所示。圖中所標A片段，代表經上述兩步PCR擴增而獲得的片段，其上帶有NcoI和NdeI酶切位點；B片段代表pET-aroA-M1上的NcoI和NdeI酶切位點間的片段。將PCR擴增而獲得的A片段用「QIAquick Gel Extration Kit＂分離純化，用NcoI和NdeI雙酶切處理，並用「QIAquick Gel Extration Kit＂分離純化酶切產物。同時，用NcoI和NdeI雙酶切pET-aroA-M1質粒DNA，走1％瓊脂糖凝膠電泳並使用「QIAquick Gel Extration Kit＂分離純化載體大片段，棄B片段。按載體∶插入片段＝1∶3的比例混合上述PCR擴增後的酶切片段和載體，用T4連接酶在16℃連接12小時，獲得的表達載體命名為pET-aroA-M142，其結構如圖1所示。pET-aroA-M142上攜帶的突變的aroA基因命名為aroA-M142。
本實施例中，若以aroA-M1基因片段代替pET-aroA-M1質粒(作為源摸板)，其餘步驟和條件相同，則最終得到的是發生了定點突變的基因片段aroA-M142。再將aroA-M142基因片段插入到質粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位點之間，即可得到含有aroA-M142基因序列的質粒(表達載體)pET-aroA-M142。實施例2轉化子BL21(aroAM1)、BL21(EcaroA)和BL21(aroAM142)的獲得分別取質粒pET-aroA-M1、pET-EcaroA(參見CN1358858A專利申請)和pET-aroA-M142用標準氯化鈣轉化法轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得的轉化子分別命名為BL21(aroAM1)、BL21(EcaroA)和BL21(aroA-M142)。實施例3轉化子BL21(aroAM1)、BL21(EcaroA)和BL21(aroAM142)的草甘膦抗性檢驗將轉化子BL21(aroAM1)、BL21(aroAM142)和BL21(EcaroA)分別接種到含有1mM IPTG、50μg/ml氨卞青黴素以及30mM和60mM草甘膦的M9液體培養基中，以200rpm、37℃空氣浴的條件培養。每隔2小時測定一次培養液OD600，記錄其生長情況，測定結果如圖5、圖6所示。從圖中的生長曲線可以看出，攜帶突變基因的轉化子在含有60mM草甘膦的M9基本培養基上仍能生存，並且BL21(aroAM142)比BL21(aroAM1)生長速度更快，滯後期更短，顯示出對草甘膦抗性的提高(圖6)；攜帶有野生型基因的轉化子BL21(EcaroA)在含有30mM的草甘膦的M9基本培養基上的生長已受到嚴重的抑制(圖5)。由此可見，突變子的抗草甘膦能力比野生型有了明顯提高，而定點突變可使轉化子的抗性進一步增強。實施例4突變EPSP合成酶基因DNA序列的測定和比較本發明使用ABI 377型測序儀，測定了aroA-M1和aroA-M142的完整DNA序列並作比較，具體序列見序列表。其中，序列2101和2102代表aroA-M1的DNA序列和表達蛋白的胺基酸序列，序列2103和2104代表aroA-M142的DNA序列和表達蛋白的胺基酸序列。
aroA-M142所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶與aroA-M1基因所編碼的EPSP合成酶的胺基酸序列相比，含有下列胺基酸置換蘇氨酸42→蛋氨酸。
從測序結果亦可見，酶蛋白的突變，是由於胺基酸的置換而非由於胺基酸的增加或缺失而引起的。並且，發生置換的胺基酸，並不包含在前人報導的與酶的活性中心或酶與底物(包括PEP，S-3-P和草甘膦)的結合位點相關的胺基酸中。根據前人的研究推測，K22，R27，G96，R100和P101等胺基酸是酶與底物S-3-P結合的相關位點；而H385，C408和K411等胺基酸則和酶與PEP的結合有關。並且，本發明所涉及的胺基酸置換，也未見有關其在草甘膦抗性中起重要作用的報導。實施例5轉化子蛋白質表達情況的分析和EPSP合成酶粗提物的製備分別用5ml含有50μg/ml氨卞青黴素的LB液體培養基培養轉化子BL21(aroA-M1)、BL21(aroA-M142)及BL21(EcaroA)，以200rpm、37℃空氣浴的條件至細胞濃度達108/ml，以1％的接種量，轉接到新鮮的含有50μg/ml氨卞青黴素的LB液體培養基中，200rpm、37℃繼續培養至OD600＝0.75時，加入IPTG至1mM以誘導重組蛋白的合成。200rpm、30℃繼續培養三小時。離心收取菌體。用緩衝液A(50mM Tris-Cl，0.1mM DTT，pH7.2)重懸菌體。細胞懸液置-70℃凍結，再在室溫中重融。然後用Fluko公司的乳化機處理細胞懸液使其破壁。以12000rpm離心30分鐘，棄去細胞碎片。上清液即為EPSP合成酶粗提物，可用於有關該酶的各項指標的測定。各轉化子蛋白表達情況見圖3所示，標示M道為蛋白標準物，1、2、3道，分別代表BL21(EcaroA)誘導前、誘導表達後和蛋白粗提物的情況；4、5、6代表BL21(aroA-M1)的相應情況；7、8、9代表BL21(aroA-M142)的相應情況。從蛋白圖譜可見，經IPTG誘導之後，在所有轉化子的蛋白樣品中均檢測到了EPSP合成酶42KD的特異性蛋白帶(如圖中箭頭所指位置)，並且，在相同培養條件下，各轉化子對EPSP合成酶的表達水平沒有明顯不同。該結果顯示，對草甘膦抗性的差異，不是由於EPSP合成酶的表達水平的差異而引起的。實施例6EPSP合成酶活力及米氏常數的測定EPSP合成酶活力的測定採用Lanzetta所述的孔雀綠顯色定量測定無機磷的方法。反應系統含有50mM Hepes/NaOH，pH7.2，1mM PEP，1mM S-3-P，0.1mM(NH4)Mo7O24·4H2O。各組分按量加好後，先在30℃預熱5分鐘，然後加入適量上述粗提酶液，酶反應持續20分鐘，即加入孔雀綠溶液終止反應。精確反應60秒，立刻加入34％檸檬酸鈉溶液，混勻後靜置15分鐘，測定OD660，所用的空白對照管的成分與反應管起始成分相同，區別在於沒有酶作用的時間，即加入酶液後，立刻加入孔雀綠溶液，其它各步操作與酶反應管相同。
米氏常數的測定，採用傳統的雙倒數作圖法。測定結果如表一所示。表一Specific activityaKm(PEP)bKi(Glyphosate)cEnzymes(nkat/mg protein) (μmol/L) (μmol/L)EcaroA0.126±0.0078 22.28±6.26 1.48±0.459aroA-M1 0.961±0.0622.7±0.81 4.9903±1.546aroA-M142 1.102±0.1760.335±0.06 4.04±0.67說明a.酶的比活，是在底物過量的條件下，即在含1.0mMPEP和0.5mM S-3-P的反應系統中測定的酶的比活力。
b.表示底物之一PEP所對應的米氏常數，反應系統中，S-3-P的含量固定在0.5mM，而PEP則取由1μmol/L至50μmol/L的一系列變化值。
c.表示PEP的競爭性抑制劑草甘膦與酶的解離常數。
d.以上各數據均為對兩批EPSP合成酶粗提物，各測定三次後獲得。
發明人在CN 1358858A專利申請中公開了一種新穎獨特而簡便高效的基因優化方法；並以此方法獲得了多個發生多點突變的，具有較強草甘膦抗性的EPSP合成酶基因。其編碼的酶具有比野生型低得多的K[PEP]，而K[Glyphosate]卻明顯增加；既提高了酶的催化效率，又減低了酶與草甘膦的親和力，使該酶抵禦草甘膦的能力大幅度提高。本發明在此基礎上，通過對各突變基因的序列分析，選定突變位點，並建立了獨特的定點突變方法，對突變基因作進一步的改造。結果表明，把基因優化法與定點突變法結合使用，可建立起一套行之有效的方法，人為增大正向突變的機率，使對目標基因進行改造的速度和準確度都得到相應的提高。
本發明以利用基因優化的方法(具體方法見CN 1358858A)獲得的高抗性的突變子aroA-M1為材料，運用獨特的基因定點突變法，對aroA-M1作進一步的改造，使其表達蛋白的第42個胺基酸殘基發生蘇氨酸→蛋氨酸的突變，產生的突變體命名為aroA-M142。aroA-M142的Ki[Glyphosate]比野生型的提高了2.73倍，而K[PEP]卻僅為野生型的1.5％，並且aroA-M142的Ki[Glyphosate]/K[PEP]值比大腸桿菌的增大了183倍。由此可見，EPSP合成酶蛋白的第42個胺基酸殘基，是與酶活性及酶與底物相互作用中起重要作用的位點。並且，該胺基酸位點，不包含在前人報導的與酶的活性中心或酶與底物(包括PEP、S-3-P和草甘膦)的結合位點相關的胺基酸中，也未見有關其在草甘膦抗性中起重要作用的報導。這對於研究探索酶蛋白結構與功能的關係及其應用也具有重要意義。
本發明所建立的基因定點突變法，可有效應用於對基因的定點改造，並可成為研究酶蛋白結構與功能關係的有力工具。本發明所提供的突變基因，有望成為構建抗草甘膦農作物新品種的優良材料。
序列表110中山大學120一種基因定點突變方法和以此方法獲得的抗草甘膦基因及其表達載體和轉化子160421012111284212DNA213大腸桿菌(Escherichia coli)4001atg gaa tcc ctg acg tta caa ccc atc gct cgt gtc gat ggc act att 48Met Glu Ser Leu Thr Leu Gln Pro Ile Ala Arg Val Asp Gly Thr Ile1 5 10 15aat ctg ccc ggt tcc aag agc gtt tct aac cgc gct tta ttg ctg gcg 96Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala20 25 30gca tta gca cac ggc aaa aca gta tta acc aat ctg ctg gat agc gat 144Ala Leu Ala His Gly Lys Thr Val Leu Thr Asn Leu Leu Asp Ser Asp35 40 45gac gtg cgc cat atg ctg aat gca tta aca gcg tta ggg gta agc tat 192Asp Val Arg His Met Leu Asn Ala Leu Thr Ala Leu Gly Val Ser Tyr50 55 60acg ctt tca gcc gat cgt acg cgt tgc gaa att atc ggt aac ggc ggt 240Thr Leu Ser Ala Asp Arg Thr Arg Cys Glu Ile Ile Gly Asn Gly Gly65 70 75 80cca tta cac gca gaa ggt gcc ctg gag ttg ttc ctc ggt aac gcc gga 288Pro Leu His Ala Glu Gly Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly85 90 95acg gca atg cgt ccg ctg gcg gca gct ctt tgt ctg ggt agc aat gat 336Thr Ala Met Arg Pro Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Ser Asn Asp100 105 110att gtg ctg acc ggt gag ccg cgt atg aaa gaa cgc ccg att ggt cat 384Ile Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His115 120 125ctg gtg gat gcg ctg cgc ctg ggc ggg gcg aag atc act tac ctg gaa 432Leu Val Asp Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Leu Glu130 135 140caa gaa aat tat ccg ccg ttg cgt tta cag ggc ggc ttt act ggc ggc 480Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu Arg Leu Gln Gly Gly Phe Thr Gly Gly145 150 155 160aac gtt gac gtt gat ggc tcc gtt tcc agc caa ttc ctc acc gca ctg 528Asn Val Asp Val Asp Gly Ser Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu
165 170 175tta atg act gcg cct ctt gcg ccg gaa gat acg gtg att cgt att aaa 576Leu Met Thr Ala Pro Leu Ala Pro Glu Asp Thr Val Ile Arg Ile Lys180 185 190ggc gat ctg gtt tct aaa cct tat atc gac atc aca ctc aat ctg atg 624Gly Asp Leu Val Ser Lys Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Leu Asn Leu Met195 200 205aag acg ttt ggt gtt gaa att gaa aat cag cac tat caa caa ttt gtc 672Lys Thr Phe Gly Val Glu Ile Glu Asn Gln His Tyr Gln Gln Phe Val210 215 220gta aaa ggc ggg cag tct tat cag tct ccg ggt act tat ttg gtc gaa 720Val Lys Gly Gly Gln Ser Tyr Gln Ser Pro Gly Thr Tyr Leu Val Glu225 230 235 240ggc gat gca tct tcg gct tct tac ttt ctg gca gca gca gca atc aaa 768Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ala Ile Lys245 250 255ggc ggc act gta aaa gtg acc ggt att gga cgt aac agt atg cag ggt 816Gly Gly Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Gly Arg Asn Ser Met Gln Gly260 265 270gat att cgc ttt gct gat gtg ctg gaa aaa atg ggc gcg acc att tgc 864Asp Ile Arg Phe Ala Asp Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Thr Ile Cys275 280 285tgg ggc gat gat tat att tcc tgc acg cgt ggt gaa ctg aac gct att 912Trp Gly Asp Asp Tyr Ile Ser Cys Thr Arg Gly Glu Leu Asn Ala Ile290 295 300gat atg gat atg aac cat att cct gat gcg gcg atg acc att gcc acg 960Asp Met Asp Met Asn His Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr Ile Ala Thr305 310 315 320gcg gcg tta ttt gca aaa ggc acc acc acg ctg cgc aat atc tat aac 1008Ala Ala Leu Phe Ala Lys Gly Thr Thr Thr Leu Arg Asn Ile Tyr Asn325 330 335tgg cgt gtt aaa gag acc gat cgc ctg ttt gcg atg gca aca gaa ctg 1056Trp Arg Val Lys Glu Thr Asp Arg Leu Phe Ala Met Ala Thr Glu Leu340 345 350cgt aaa gtc ggc gcg gaa gtg gaa gag ggg cac gat tac att cgt atc 1104Arg Lys Val Gly Ala Glu Val Glu Glu Gly His Asp Tyr Ile Arg Ile355 360 365acg ccg ccg gcg aag ctc caa cac gcg gat att ggc acg tac aac gac 1152Thr Pro Pro Ala Lys Leu Gln His Ala Asp Ile Gly Thr Tyr Asn Asp370 375 380cac cgt atg gcg atg tgt ttc tca ctg gtc gca ctg tcc gat acg cca 1200His Arg Met Ala Met Cys Phe Ser Leu Val Ala Leu Ser Asp Thr Pro385 390 395 400gtc acg atc ctg gac cct aaa tgt acc gca aaa acg ttc cct gat tat 1248Val Thr Ile Leu Asp Pro Lys Cys Thr Ala Lys Thr Phe Pro Asp Tyr405 410 415ttc gaa caa ctg gcg cga atg agt acg cct gcc taa1284Phe Glu Gln Leu Ala Arg Met Ser Thr Pro Ala *420 4252102211427212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)400 2Met Glu Ser Leu Thr Leu Gln Pro Ile Ala Arg Val Asp Gly Thr Ile1 5 10 15Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala20 25 30Ala Leu Ala His Gly Lys Thr Val Leu Thr Asn Leu Leu Asp Ser Asp35 40 45Asp Val Arg His Met Leu Asn Ala Leu Thr Ala Leu Gly Val Ser Tyr50 55 60Thr Leu Ser Ala Asp Arg Thr Arg Cys Glu Ile Ile Gly Asn Gly Gly65 70 75 80Pro Leu His Ala Glu Gly Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly85 90 95Thr Ala Met Arg Pro Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Ser Asn Asp100 105 110Ile Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His115 120 125Leu Val Asp Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Leu Glu130 135 140Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu Arg Leu Gln Gly Gly Phe Thr Gly Gly145 150 155 160Asn Val Asp Val Asp Gly Ser Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu165 170 175Leu Met Thr Ala Pro Leu Ala Pro Glu Asp Thr Val Ile Arg Ile Lys180 185 190Gly Asp Leu Val Ser Lys Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Leu Asn Leu Met195 200 205Lys Thr Phe Gly Val Glu Ile Glu Asn Gln His Tyr Gln Gln Phe Val210 215 220Val Lys Gly Gly Gln Ser Tyr Gln Ser Pro Gly Thr Tyr Leu Val Glu225 230 235 240Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ala Ile Lys245 250 255Gly Gly Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Gly Arg Asn Ser Met Gln Gly260 265 270Asp Ile Arg Phe Ala Asp Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Thr Ile Cys275 280 285Trp Gly Asp Asp Tyr Ile Ser Cys Thr Arg Gly Glu Leu Asn Ala Ile290 295 300Asp Met Asp Met Asn His Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr Ile Ala Thr305 310 315 320Ala Ala Leu Phe Ala Lys Gly Thr Thr Thr Leu Arg Asn Ile Tyr Asn325 330 335Trp Arg Val Lys Glu Thr Asp Arg Leu Phe Ala Met Ala Thr Glu Leu340 345 350Arg Lys Val Gly Ala Glu Val Glu Glu Gly His Asp Tyr Ile Arg Ile355 360 365Thr Pro Pro Ala Lys Leu Gln His Ala Asp Ile Gly Thr Tyr Asn Asp370 375 380His Arg Met Ala Met Cys Phe Ser Leu Val Ala Leu Ser Asp Thr Pro385 390 395 400Val Thr Ile Leu Asp Pro Lys Cys Thr Ala Lys Thr Phe Pro Asp Tyr405 410 415Phe Glu Gln Leu Ala Arg Met Ser Thr Pro Ala *420 42521032111284212DNA213大腸桿菌(Escherichia coli)4003atg gaa tcc ctg acg tta caa ccc atc gct cgt gtc gat ggc act att 48Met Glu Ser Leu Thr Leu Gln Pro Ile Ala Arg Val Asp Gly Thr Ile1 5 10 15aat ctg ccc ggt tcc aag agc gtt tct aac cgc gct tta ttg ctg gcg 96Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala20 25 30gca tta gca cac ggc aaa aca gta tta atg aat ctg ctg gat agc gat 144Ala Leu Ala His Gly Lys Thr Val Leu Met Asn Leu Leu Asp Ser Asp35 40 45gac gtg cgc cat atg ctg aat gca tta aca gcg tta ggg gta agc tat 192Asp Val Arg His Met Leu Asn Ala Leu Thr Ala Leu Gly Val Ser Tyr50 55 60acg ctt tca gcc gat cgt acg cgt tgc gaa att atc ggt aac ggc ggt 240Thr Leu Ser Ala Asp Arg Thr Arg Cys Glu Ile Ile Gly Asn Gly Gly65 70 75 80cca tta cac gca gaa ggt gcc ctg gag ttg ttc ctc ggt aac gcc gga 288Pro Leu His Ala Glu Gly Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly85 90 95acg gca atg cgt ccg ctg gcg gca gct ctt tgt ctg ggt agc aat gat 336Thr Ala Met Arg Pro Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Ser Asn Asp100 105 110att gtg ctg acc ggt gag ccg cgt atg aaa gaa cgc ccg att ggt cat 384Ile Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His115 120 125ctg gtg gat gcg ctg cgc ctg ggc ggg gcg aag atc act tac ctg gaa 432Leu Val Asp Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Leu Glu130 135 140caa gaa aat tat ccg ccg ttg cgt tta cag ggc ggc ttt act ggc ggc 480Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu Arg Leu Gln Gly Gly Phe Thr Gly Gly145 150 155 160aac gtt gac gtt gat ggc tcc gtt tcc agc caa ttc ctc acc gca ctg 528Asn Val Asp Val Asp Gly Ser Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu165 170 175tta atg act gcg cct ctt gcg ccg gaa gat acg gtg att cgt att aaa 576Leu Met Thr Ala Pro Leu Ala Pro Glu Asp Thr Val Ile Arg Ile Lys180 185 190ggc gat ctg gtt tct aaa cct tat atc gac atc aca ctc aat ctg atg 624Gly Asp Leu Val Ser Lys Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Leu Asn Leu Met195 200 205aag acg ttt ggt gtt gaa att gaa aat cag cac tat caa caa ttt gtc 672Lys Thr Phe Gly Val Glu Ile Glu Asn Gln His Tyr Gln Gln Phe Val210 215 220gta aaa ggc ggg cag tct tat cag tct ccg ggt act tat ttg gtc gaa 720Val Lys Gly Gly Gln Ser Tyr Gln Ser Pro Gly Thr Tyr Leu Val Glu225 230 235 240ggc gat gca tct tcg gct tct tac ttt ctg gca gca gca gca atc aaa 768Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ala Ile Lys245 250 255ggc ggc act gta aaa gtg acc ggt att gga cgt aac agt atg cag ggt 816Gly Gly Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Gly Arg Asn Ser Met Gln Gly260 265 270gat att cgc ttt gct gat gtg ctg gaa aaa atg ggc gcg acc att tgc 864Asp Ile Arg Phe Ala Asp Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Thr Ile Cys275 280 285tgg ggc gat gat tat att tcc tgc acg cgt ggt gaa ctg aac gct att 912Trp Gly Asp Asp Tyr Ile Ser Cys Thr Arg Gly Glu Leu Asn Ala Ile290 295 300gat atg gat atg aac cat att cct gat gcg gcg atg acc att gcc acg 960Asp Met Asp Met Asn His Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr Ile Ala Thr305 310 315 320gcg gcg tta ttt gca aaa ggc acc acc acg ctg cgc aat atc tat aac 1008Ala Ala Leu Phe Ala Lys Gly Thr Thr Thr Leu Arg Asn Ile Tyr Asn325 330 335tgg cgt gtt aaa gag acc gat cgc ctg ttt gcg atg gca aca gaa ctg 1056Trp Arg Val Lys Glu Thr Asp Arg Leu Phe Ala Met Ala Thr Glu Leu340 345 350cgt aaa gtc ggc gcg gaa gtg gaa gag ggg cac gat tac att cgt atc 1104Arg Lys Val Gly Ala Glu Val Glu Glu Gly His Asp Tyr Ile Arg Ile355 360 365acg ccg ccg gcg aag ctc caa cac gcg gat att ggc acg tac aac gac 1152Thr Pro Pro Ala Lys Leu Gln His Ala Asp Ile Gly Thr Tyr Asn Asp370 375 380cac cgt atg gcg atg tgt ttc tca ctg gtc gca ctg tcc gat acg cca 1200His Arg Met Ala Met Cys Phe Ser Leu Val Ala Leu Ser Asp Thr Pro385 390 395 400gtc acg atc ctg gac cct aaa tgt acc gca aaa acg ttc cct gat tat 1248Val Thr Ile Leu Asp Pro Lys Cys Thr Ala Lys Thr Phe Pro Asp Tyr405 410 415ttc gaa caa ctg gcg cga atg agt acg cct gcc taa 1284Phe Glu Gln Leu Ala Arg Met Ser Thr Pro Ala *420 4252104211427212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)4004Met Glu Ser Leu Thr Leu Gln Pro Ile Ala Arg Val Asp Gly Thr Ile1 5 10 15Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala20 25 30Ala Leu Ala His Gly Lys Thr Val Leu Met Asn Leu Leu Asp Ser Asp35 40 45Asp Val Arg His Met Leu Asn Ala Leu Thr Ala Leu Gly Val Ser Tyr50 55 60Thr Leu Ser Ala Asp Arg Thr Arg Cys Glu Ile Ile Gly Asn Gly Gly65 70 75 80Pro Leu His Ala Glu Gly Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly85 90 95Thr Ala Met Arg Pro Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Ser Asn Asp100 105 110Ile Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His115 120 125Leu Val Asp Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Leu Glu130 135 140Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu Arg Leu Gln Gly Gly Phe Thr Gly Gly145 150 155 160Asn Val Asp Val Asp Gly Ser Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu165 170 175Leu Met Thr Ala Pro Leu Ala Pro Glu Asp Thr Val Ile Arg Ile Lys180 185 190Gly Asp Leu Val Ser Lys Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Leu Asn Leu Met195 200 205Lys Thr Phe Gly Val Glu Ile Glu Asn Gln His Tyr Gln Gln Phe Val210 215 220Val Lys Gly Gly Gln Ser Tyr Gln Ser Pro Gly Thr Tyr Leu Val Glu225 230 235 240Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ala Ile Lys245 250 255Gly Gly Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Gly Arg Asn Ser Met Gln Gly260 265 270Asp Ile Arg Phe Ala Asp Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Thr Ile Cys275 280 285Trp Gly Asp Asp Tyr Ile Ser Cys Thr Arg Gly Glu Leu Asn Ala Ile290 295 300Asp Met Asp Met Asn His Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr Ile Ala Thr305 310 315 320Ala Ala Leu Phe Ala Lys Gly Thr Thr Thr Leu Arg Asn Ile Tyr Asn325 330 335Trp Arg Val Lys Glu Thr Asp Arg Leu Phe Ala Met Ala Thr Glu Leu340 345 350Arg Lys Val Gly Ala Glu Val Glu Glu Gly His Asp Tyr Ile Arg Ile355 360 365Thr Pro Pro Ala Lys Leu Gln His Ala Asp Ile Gly Thr Tyr Asn Asp370 375 380His Arg Met Ala Met Cys Phe Ser Leu Val Ala Leu Ser Asp Thr Pro385 390 395 400Val Thr Ile Leu Asp Pro Lys Cys Thr Ala Lys Thr Phe Pro Asp Tyr405 410 415Phe Glu Gln Leu Ala Arg Met Ser Thr Pro Ala *420 42權利要求
1.一種基因定點突變的方法，其特徵是選用具有如下結構特點的DNA序列作源模板需突變的位點與一單酶切位點相距10-20個鹼基；根據該源模板序列設計一個5′端引物和兩個3′端引物；兩個3′端引物間有10-20個鹼基的重疊序列，並且其一帶有需要在擴增產物中引入的突變序列，另一帶有需要在擴增產物中引入的酶切位點；由5′端引物和帶有突變序列的3′端引物進行第一輪PCR擴增反應，把突變位點引入擴增產物；再以此擴增產物為模板，利用原5′端引物和帶有酶切位點的3′端引物進行第二輪擴增，把酶切位點引入到前述帶突變位點的序列的3′端；再通過酶切片段的互換，用該序列取代源模板上的相應序列，實現定點突變。
2.按照權利要求1所述的基因定點突變方法，其特徵是所用PCR擴增方法的具體反應條件和操作步驟如下第一步擴增反應以源模板DNA 102-104拷貝、1×TaqDNA聚合酶緩衝液、4種dNTP各200μmol/L、5′-端引物A和3′-端引物B各20pmol以及TaqDNA聚合酶約0.5-5U構成反應系統；反應程序及參數為[1]94℃ 5分鐘[2]循環94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循環30次[3]72℃ 10分鐘擴增反應完畢，走1％瓊脂糖凝膠電泳並用「QIAquick Gel Extration Kit」分離純化大小約為130bp的PCR擴增產物，該擴增產物含有點突變序列；第二步擴增反應取102-104拷貝上述擴增產物作為第二輪PCR反應的模板，並以1×TaqDNA聚合酶緩衝液，4種dNTP各200μmol/L，5′-端引物A和3′-端引物C各20pmol，TaqDNA聚合酶約0.5-5U構成反應系統；反應程序及參數同第一步擴增反應；反應完畢，再通過瓊脂糖凝膠電泳分離純化擴增產物，與源模板分別進行酶切，把帶突變序列的新片段，連接到源模板上的相應位置，從而實現定點突變。
3.根據權利要求1或2所述的基因定點突變方法，其特徵是所用的源模板是通過基因優化方法獲得的突變基因序列。
4.根據權利要求1或2所述的基因定點突變方法，其特徵是所用的源模板是帶有經基因優化法獲得的突變基因序列的質粒。
5.根據權利要求3所述的基因定點突變方法，其特徵是所用的源模板是通過基因優化方法獲得的細菌EPSP合成酶基因aroA-M1；根據該源模板設計的一個5′端引物和兩個3′端引物序列如下引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′最終獲得發生定點突變的EPSP合成酶基因。
6.根據權利要求4所述的基因定點突變方法，其特徵是所用的源模板是帶有經基因優化法獲得的細菌EPSP合成酶基因aroA-M1的質粒；根據該源模板設計的一個5′端引物和兩個3′端引物序列如下引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATIAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′最終獲得帶有發生了定點突變的EPSP合成酶新基因的質粒。
7.由權利要求5所述方法獲得的，命名為aroA-M142的DNA序列，其特徵是其表達蛋白與aroA-M1基因編碼的胺基酸序列相比，在位點42上，發生由蛋氨酸替代蘇氨酸的變化。
8.含有權利要求7所述的aroA-M142基因序列的質粒pET-aroA-M142，其特徵是aroA-M142基因片段插入到質粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位點之間。
9.具有草甘膦抗性的轉化子BL21(aroA-M142)，由權利要求8所述質粒pET-aroA-M142轉化大腸桿菌BL-21(DE3)而獲得。
全文摘要
本發明涉及一種基因定點突變方法和通過該方法獲得的重組aroA基因、以及含有此基因的載體和轉化子。本方法選用「需突變的位點與一單酶切位點相距10－20個鹼基」的DNA序列作源模板，按源模板的序列特點設計出相對應的一個5』－端引物和兩個3』－端引物，並採用兩步PCR擴增反應，得到引入點突變的基因片段。運用該方法，可以人為加大發生基因突變的準確性。本發明還應用該定點突變法，把通過基因優化法獲得的基因aroA－M1作進一步改良，獲得活性更高而草甘膦敏感度更低的EPSP合成酶基因aroA－M142；aroAM142編碼的酶具有比野生型低得多的K
文檔編號C12N15/19GK1405318SQ02151910
公開日2003年3月26日 申請日期2002年11月11日 優先權日2002年11月11日
發明者何鳴, 聶燕芳, 徐培林 申請人:中山大學