水體中的糞腸球菌的酶聯免疫檢測溶液及檢測方法

2023-05-19 01:59:56 1

專利名稱：：水體中的糞腸球菌的酶聯免疫檢測溶液及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及環境科學水處理領域，具體地說，涉及水體中的糞腸球菌的快速檢測方法。
背景技術：
：糞腸球菌為圓形或橢圓形、呈鏈狀排列的革蘭氏陽性細菌，無芽孢、無鞭毛，為需氧或兼性厭氧菌。腸球菌主要存在人類或動物的腸道，是人體腸道的正常菌群，在人類糞便中的數量僅次於大腸菌群，其致病力較弱。生活汙水、處理後廢水及各種用於娛樂水體中均可檢出常見菌株糞腸球菌。但目前對實際環境中糞腸球菌的定性、定量檢測研究較少，國外僅見利用PCR技術檢測糞腸球菌及利用酶聯免疫技術測定糞腸球菌表面蛋白Esp和莢膜多糖的報導，因此建立快速檢測糞腸球菌的方法對完善淡水、海水水質檢測標準具有重要的意義和實際應用價值。目前對實際環境中糞腸球菌的定性、定量檢測研究較少，究其原因，可能存在一下幾個方面的問題1.日常水質檢測指標大腸菌群不包含糞腸球菌，因而一直以來未得到足夠的重視。2.該菌對營養要求較高，培養較困難。3.目前對糞腸球菌的研究多為臨床分離菌株的耐藥機制、不同菌株的耐藥類型、致病基因、膜蛋白及胞外酶等，對糞腸球菌的定量檢測研究較少。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠快速檢測水體中的糞腸球菌的酶聯免疫檢測溶液和檢測方法。為了實現上述目的，本發明提供以下技術方案一組快速檢測糞腸球菌的溶液，包括pH7.4的PBS緩衝液:KC1:KH2P04:Na2HP04—12H20:NaCl重量比為1:1.2:14.5:40;用於ELISA過程中所有樣品的稀釋和洗板。包被液Na2C03:NaHC03重量比為l:1.92.0;用於稀釋抗原，使抗原與酶標板結合力更高。PBST洗滌液:1000mlPBS緩衝液加Tween-200.5ml;用於洗板的溶液，Tween-20為表面活性劑，使清洗更加徹底。稀釋液PBS加1X牛血清白蛋白(BSA);用於抗血清和二抗的稀釋，BSA可以使一抗、二抗更加穩定，減少非特異性反應。封閉液PBS加2XBSA;包被之後，用於堵塞酶標板上沒有結合抗原的部分，減少後續加入的各種蛋白質對酶標板的吸附，防止非特異性反應的發生。二抗羊抗兔IgG—HRP酶標抗體；與抗血清結合，故稱為二抗或者抗抗體，HRP為辣根過氧化物酶，是迄今在ELISA中使用最廣泛的標記酶，其性質穩定，與抗原或抗體耦聯後，活性很少受損失。底物溶液四甲基聯苯胺(TMB)可溶性單組分底物溶液；TMB為HRP色原底物，與HRP反應後在波長450mn處有最大吸光度，其具有靈敏度高，無毒性等優點。終止液2M的H2S04;可使TMB與HRP反應的產物穩定存在。一種快速檢測糞腸球菌的方法，包括以下步驟A、抗血清獲得糞腸球菌置於0.05%甲醛溶液中，3(TC下滅活8h;滅活菌體用生理鹽水反覆洗滌，重複離心三次，製成終濃度為1Xl(TCFU/mL的抗原；雄性紐西蘭大白兔2隻，耳緣靜脈注射滅活抗原，第一次lmL/只，此後每次增加O.lmL;第二次免疫距第一次2周，此後每周一次，共6次；末次注射後一周，耳動脈採血，玻片凝集法測定效價，達到1280:1以上即從心臟取血；取血後將血清置於室溫凝固lh，後4'C靜置過夜，4°C3000r/min離心15min，分離上清液，得到抗血清；B、抗lfni青與尿腸球菌(￡rterococcus/aeciu/B)、盲腸月免球菌(i5)亡arococciAcec6>i//ff)、堅強腸球菌(j5)ter。c。cc〃5"Gtu"朋s)、鳥腸球菌(i5)feroc。ccyssi/i咖)、金黃色葡萄球菌(5Y邵/u^ococcus如ret/5)反應，4°C3000r/min離心去除發生交叉反應部分；C、建立間接ELISA反應用包被液稀釋糞腸球菌菌體抗原，每孔200uL，6(TC烘乾；洗板機洗滌3次，甩幹；加入封閉液，每孔200uL，37"溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入稀釋的抗血清和陰性血清，37。C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入l:10000酶標抗體，每孔200yL，37'C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入底物溶液，每孔100PL，室溫避光反應10min;加入50yL終止液；酶標儀測定450nm吸光度。所述的包被濃度為1X1051X107CFU/mL。所述的檢測用抗血清最佳稀釋度為1:100000256000，二抗稀釋度為1:10000。使用的酶標板為可拆卸聚乙烯高吸附力酶標板。所述抗血清稀釋度為l:128000。本發明適用於實驗室培養或者野外樣品處理後，糞腸球菌的快速檢測，具有以下優點1.具有極高的靈敏度和專一性。去除交叉反應菌體後，抗血清僅與糞腸球菌發生免疫學反應，本酶聯免疫法的檢測限能夠達到1.5X103CFU/mL左右，非常靈敏。2.所需試劑配製方便。所有試劑均為常用鹽類，沒有毒性，各種溶液常溫保存即可。3.檢測過程操作簡單。不需要使用複雜的儀器，反應過程簡單，不需要專業人員、不需要特殊的培訓即可進行。圖1為間接ELISA檢測糞腸球菌的敏感性曲線其中，橫坐標為log抗原濃度(CFU/mL)，縱坐標為吸光度(A)。具體實施例方式實施例1用包被液系列稀釋已知濃度糞腸球菌菌體抗原，每孔200yL，60。C烘乾；洗板機洗滌3次，甩幹；加入封閉液，每孔200yL，37。C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入不同稀釋度(如表2、3)的抗血清和陰性血清，37匸溫育lh;洗漆3次，甩幹；加入l:IOOOOHRP標記的酶標抗體，每孔200uL，37。C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入底物溶液，每孔100yL，室溫避光反應10min，加入50uL終止液；酶標儀測定450nm吸光度。通過上述過程得到標準曲線。按照同樣操作測定待測樣品吸光度，計算出樣品中糞腸球菌菌體濃度。表1糞腸球菌抗血清吸附前後效價tableseeoriginaldocumentpage5表示沒有凝集反應表2抗原最適包被濃度tableseeoriginaldocumentpage5表3抗血清最佳稀釋度tableseeoriginaldocumentpage5權利要求1.一組快速檢測糞腸球菌的溶液，其特徵在於，包括pH7.4的PBS緩衝液KCl:KH2PO4:Na2HPO4—12H2O:NaCl重量比為1∶1.214.5∶40；包被液Na2CO3:NaHCO3重量比為1∶1.9～2.0；PBST洗滌液每1000mlPBS緩衝液加Tween-200.5ml，Tween-20為表面活性劑；稀釋液PBS緩衝液加1％牛血清白蛋白(BSA)；封閉液PBS加2％BSA；二抗羊抗兔IgG—HRP酶標抗體；底物溶液四甲基聯苯胺(TMB)可溶性單組分底物溶液；終止液2M的H2SO4。2、—種快速檢測糞腸球菌的方法，其特徵在於，包括以下步驟A、抗血清獲得糞腸球菌置於0.05%甲醛溶液中，3(TC下滅活8h;滅活菌體用生理鹽水反覆洗滌，重複離心三次，製成終濃度為lX10'°CFU/mL的抗原；雄性紐西蘭大白兔2隻，耳緣靜脈注射滅活抗原，第一次lmL/只，此後每次增加O.lmL;第二次免疫距第一次2周，此後每周一次，共6次；末次注射後一周，耳動脈採血，玻片凝集法測定效價，達到1280:1以上即從心臟取血；取血後將血清置於室溫凝固lh，後4。C靜置過夜，4。C3000r/min離心15min，分離上清液，得到抗血清；B、抗血清與屎腸球菌(i5)ter。c。cc〃51/aeci咖)、盲腸腸球菌(￡"tar。c。cciAcecoiffl)、堅強腸球菌(f/terococcw5"c/"ra/s)、鳥腸球菌(terococci/s1sKi〃歷)、金黃色葡萄球菌(5Yap/y7ococcus反應，4°C3000r/min離心去除發生交叉反應部分；C、建立間接ELISA反應用包被液稀釋糞腸球菌菌體抗原，每孔200"L，6CTC烘乾；洗板機洗滌3次，甩幹；加入封閉液，每孔200yL，37'C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入稀釋的抗血清和陰性血清，37'C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入l:10000酶標抗體，每孔200uL，37'C溫育lh;洗滌3次，甩幹；加入底物溶液，每孔100uL，室溫避光反應10min;加入50uL終止液；酶標儀測定450nm吸光度。3、如權利要求2所述的快速檢測糞腸球菌的方法，其特徵在於包被濃度為1X1051X107CFU/mL。4、如權利要求2所述的快速檢測糞腸球菌的方法，其特徵在於檢測用抗血清最佳稀釋度為1:100000256000，二抗稀釋度為1:10000。5、如權利要求2所述的快速檢測糞腸球菌的方法，其特徵在於使用的酶標板為可拆卸聚乙烯高吸附力酶標板。6、如權利要求4所述的快速檢測糞腸球菌的方法，其特徵在於所述抗血清稀釋度為1:128000。全文摘要一種水體中的糞腸球菌的酶聯免疫檢測溶液及檢測方法，涉及環境科學水處理領域，具體地說，涉及水體中的糞腸球菌的快速檢測方法。本發明的一組快速檢測糞腸球菌的溶液，包括PBS緩衝液、包被液、洗滌液、還包括稀釋液、封閉液、二抗、底物溶液、終止液。一種快速檢測糞腸球菌的方法，包括以下步驟A.抗血清獲得；B.抗血清與屎腸球菌、盲腸腸球菌、堅強腸球菌、鳥腸球菌、金黃色葡萄球菌反應，離心去除發生交叉反應部分；C.建立間接ELISA反應等。本發明適用於實驗室培養或者野外樣品處理後，糞腸球菌的快速檢測，具有以下優點具有極高的靈敏度和專一性，所需試劑配製方便，檢測過程操作簡單。不需要使用複雜的儀器，反應過程簡單，不需要專業人員、不需要特殊的培訓即可進行。文檔編號G01N33/569GK101441216SQ20081015176公開日2009年5月27日申請日期2008年9月25日優先權日2008年9月25日發明者琳朱,王秀娟申請人:南開大學