一種監測治療基因體內表達情況和範圍的方法

2023-05-18 23:55:26 1

一種監測治療基因體內表達情況和範圍的方法
【專利摘要】發明屬於分子標記【技術領域】，具體公開了一種監測治療基因體內表達情況和範圍的方法。本發明通過將治療基因與標記基因HSV-1TK融合，可以利用對HSV-1TK成像的方法來間接反映治療基因表達情況和體內分布情況，經濟而有效。另外，標記基因HSV-1TK本身也是治療基因，與其它腫瘤治療基因融合後，能起到協同殺傷腫瘤作用。
【專利說明】一種監測治療基因體內表達情況和範圍的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記【技術領域】，更具體地，涉及一種監測治療基因體內表達情況 和範圍的方法。

【背景技術】
[0002] 隨著腫瘤分子生物學和生物技術的發展，基因治療在未來有可能成為腫瘤治療的 另外一種常規手段。建立一種監測治療基因體內分布和表達情況方法，有利於評估治療的 有效性和安全性。目前是通過活檢用免疫組化方法來檢測組織中基因表達情況，但這種方 法存在著明顯的缺點：（1)對機體造成損傷，也不能進行重複連續觀察。（2)不能方便獲得 治療基因在體內分布和表達情況的信息。而分子成像方法可以非侵入的觀察和評估治療基 因在體內的位置、數量和持續表達時間。而這些信息對基因治療應用於臨床具有重要價值。 臨床分子成像的前提是需要合適的"標記基因"和"標記底物"相結合。HSV-1TK是一個被 廣泛研究的基因。不僅可用來對多種腫瘤的基因治療。同時HSV-1TK也是應用於分子成像 較為成熟的"標記基因"。HSV-1TK酶的三個常用"標記底物"是IUdR、GCV和FIAU，放射性 標記底物可用於非侵入的分子成像。FIAU做為一個潛在的"標記底物"，是因為它是典型的 2' -氟代核苷類似物，放射性標記的碘（I)或碳（C)能摻入分子中，可用gamma相機和SPECT 成像。已有的研究表明，FIAU經放射性標記後，分子成像的穩定性優於IUdR或GCV。基於 此，以HSV-1TK基因做為"標記基因"，FIAU做為"標記底物"來進行體內分子成像。
[0003] 但對於許多其它的治療基因沒有辦法來進行gamma相機和SPECT方法的體內分子 成像。針對每個治療基因來開發新的探針或放射性標記方法代價非常昂貴，周期也會較長。


【發明內容】

[0004] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一種監測治療基因體內表達情況和範 圍的方法。所述方法能夠實現非侵入和實時監測治療基因表達和分布情況。
[0005] 為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的。
[0006] 一種監測治療基因體內表達情況和範圍的方法，包括如下步驟：將治療基因與標 記基因 HSV-1TK融合，構建融合基因載體後，轉染治療受體，利用對HSV-1TK體內分子成像 的方法來間接反映治療基因在治療受體內的表達情況和體內分布情況。
[0007] 優選地，所述治療基因為⑶基因、P53基因、Rb基因等。
[0008] 更優選地，所述治療基因為⑶基因。
[0009] 把"報告基因"與"治療基因"融合，由於"報告基因"與"治療基因"受同一啟動子 的驅動，因此"報告基因"與"治療基因"可在體內同時表達，而且表達產物是嚴格等量的， 獲得產物是各自蛋白的單一雜合體一融合蛋白，從"報告基因"分子成像中獲得的信息就能 間接反映與之融合的"治療基因"表達情況，即"治療基因"的"非直接成像"。這樣，在研究 其它基因對腫瘤治療時，就可以選擇與現有成熟的報告基因（如HSV-1TK)進行融合，這對觀 察眾多的治療基因體內分布和表達情況具有重要的意義。
[0010] 優選地，所述體內分子成像的方法為gamma相機成像或SPECT成像。
[0011] 優選地，所述標記基因 HSV-1TK以FIAU為標記底物，且FIAU的集聚水平與 HSV-1TK基因表達水平成正比。
[0012] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明通過將治療基因與標記基因 HSV-1TK融合，可以利用對HSV-1TK成像的方法來 間接反映治療基因表達情況和體內分布情況，經濟而有效。另外，標記基因 HSV-1TK本身也 是治療基因，與其它腫瘤治療基因融合後，能起到協同殺傷腫瘤作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.在NCIH460TK+細胞株中，檢測HSV-1TK mRNA表達、前藥GCV敏感性和FIAU 集聚水平三者間的關係；（A)HSV-ITK mRNA表達與前藥GCV敏感性關係；（B)HSV-ITK mRNA 表達與FIAU集聚水平的關係；（C) FIAU集聚水平與前藥GCV的關係。
[0014] 圖2. Gamma相機體內成像方法監測HSV-1TK基因的表達，其中，圖A中箭頭所示為 NCIH460TK+所成腫瘤，對側為野生型NCIH460所成腫瘤；圖B為靜脈注射2-[14C]FIAU 24小 時後gamma相機成像；圖C為靜脈注射2-[14C]FIAU 36小時後gamma相機成像。
[0015] 圖3.融合基因表達載體的構建。
[0016] 圖 4. pcDNA3. 1 -TK、pcDNA3. 1 -CD 和 pDNA3. Ι-TKglyCD 轉染 HEK293 細胞，檢測 HSV-1TK，CD 和 TKglyCD 表達情況；其中 1 為 pcDNA3. 1 ;2 為 pcDNA3. 1 -TK ;3 為 pcDNA3. 1 -CD ;4 為 pcDNA3. 1 -TKglyCD。
[0017] 圖 5. pcDNA3. 1 -TKglyCD 對腫瘤細胞 NCIH460 的殺傷作用：pcDNA3. 1 -CD, pcDNA3. 1 -TK，pcDNA3. l/HA-myc-His(-)Z-TKglyCD和空質粒pcDNA3. 1 轉染NCIH460細胞 後，分別給予前藥5-FC和GCV後細胞增殖情況。
[0018] 圖6.標記基因 HSV-1TK表達情況和治療基因表達情況成線性關係。

【具體實施方式】
[0019] 下面結合說明書附圖和具體實施例來詳細解釋本發明，下列實施例並不能用於限 定本發明所保護的範圍。其中關於重組載體的構建、載體瞬時轉染細胞等分子生物學方法 均為本領域常規的方法，另外實施例中沒有詳細描述的分子生物學方法都參考本領域分子 生物學的常規操作來執行。
[0020] 實施例1本發明監測方法建立的依據 一、細胞水平研究FIAU的集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比。
[0021] 1、製備穩定轉染HSV-1TK基因的NCIH460細胞株：轉染前24h接種NCIH460細胞 到6孔板中，轉染當天當細胞密度達到6(Γ80%時，用pcDNA3. 1-TK (攜帶HSV-1TK基因的 真核表達載體）轉染NCIH460,轉染方法按照轉染試劑Lipofectamine2000操作方法進行。 轉染48h後用G418抗生素進行篩選，以1(Γ14天細胞全部死亡的G418濃度為最佳篩選濃 度。用含維持濃度G418培養基維持細胞生長，直至篩選可見克隆為止。分離克隆放大培養 並獲得一定細胞數量後，用RT-PCR和Western方法鑑定，鑑定成功的細胞即是穩定轉染了 HSV-TK基因的NCIH460細胞系。
[0022] 2、篩選出穩定轉染HSV-1TK基因的NCIH460細胞株，命名為NCIH460TK+。然後，評 價在NCIH460TK+中是否FIAU集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比，評價過程為：為了 評價在NCIH460TK+中是否FIAU集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比，從兩方面做了 檢測：（1) NCIH460TK+對前藥GCV的敏感性；（2) NCIH460TK+中HSV-1TK的mRNA表達水平。 結果如圖1所示，FIAU的集聚水平與HSV-1TK基因表達水平以及對前藥GCV的敏感性具有 高度的一致性。說明在體外實驗中，用HSV-1TK做為"標記基因"，放射性標記的FIAU做為 "標記底物"，能成功的反映出細胞中所轉染的HSV-1TK基因表達水平。體外實驗為HSV-1TK 做為"標記基因"和FIAU做為"標記底物"的體內分子成像可行性奠定了良好的基礎。
[0023] 二、小鼠動物體內研究標記基因的體內表達情況。
[0024] Gamma相機方法體內成像監測HSV-1TK基因的表達：將步驟一的NCIH460TK+細 胞株接種裸鼠一側皮下成瘤，對側用野生型NCIH460成瘤做為對照。待腫瘤生長到直徑為 3. 2±0. 6cm時，靜脈注射50 MCi 2-[14C]FIAU，用gamma相機分別於24、36小時後進行成 像，顯示出裸鼠體內分布和代謝示蹤劑（圖2)。結果表明，在靜脈注射2-[ 14C]FIAU 24小時 和36小時後，用NCIH460TK+所成腫瘤區域有高水平的2-[14C]FIAU來源的放射活性。而野 生型NCIH460所成腫瘤和鼠的其它器官沒有顯示大量放射活性。
[0025] 三、HSV-1TK和⑶融合基因的構建和功能鑑定。
[0026] 1、利用Insightll軟體，計算由不同Linker序列連接蛋白之間能量的情況，做結 構模擬圖觀察兩個蛋白的摺疊是否受到影響。
[0027] 2、根據所預測的Linker序列（Linker序列為GSGGGGGGGGG)，構建CD基因和 HSV-1TK融合基因的表達載體，重組載體結構如圖3所示，具體構建步驟如下：以pNGVL-TK 質粒為模板，PCR方法擴增HSV-1TK基因序列， 上遊引物序列是 5' -CCGGAATTCACCATGGCTTCGTACCCC-3'， 下遊引物序列是 5' -CGCGGATCCGTTAGCCTCCCCCATCTC-3'。
[0028] PCR反應條件：預變性94°C 2分鐘，變性94°C 15秒，退火52°C 30秒，延伸72°C 1分鐘，共30個循環，最後72 °C延伸7分鐘。
[0029] PCR產物經EcoRI和BamHI雙酶切，酶切產物與同樣經過EcoRI和BamHI雙酶切的 pcDNA3. 1載體連接，構建pcDNA3. 1-TK重組質粒。以實驗室構建的⑶質粒為模板，PCR方 法擴增⑶基因， 上遊引物為 5' -CCGGAATTCACCATGGGGAGGCTAACAGTGTC-3'， 下遊引物序列為 5'-CGC GGATCCACGTTTGTAATCGATGGCTTC-3'， PCR反應條件與上述一樣。⑶基因 PCR產物經EcoRI和BamHI雙酶切後克隆到同樣酶 切的pcDNA3. 1質粒上，構建pcDNA3. 1-CD重組質粒。
[0030] 構建HSV-lTKglyCD融合基因表達載體： PCR 擴增 1 inker 和 CD 基因序列，上遊引物是 5' -CGC GATCCGGCGGGGGCGGTGGAGGAGGGGG TGGGAGGCTAACAGTGTC-3', 下遊引物是 5' -CGCGGATCCACGTTTGTAATCGATGGCTTC-3'。
[0031] PCR反應條件與上述一樣，PCR產物大小是1310 bp，PCR產物經BamHI酶切後，連 接到pcDNA3. 1-TK中，構建pcDNA3. Ι-TkglyCD重組質粒· PstI鑑定CD基因的方向。陽 性的重組質粒經pstI酶切後大小為 442,782,2662,4045 bp。pcDNA3.1-TkglyCD重組質粒 再經測序驗證正確。
[0032] 3、檢測融合基因表達：將步驟2構建得到的融合基因表達載體pcDNA3. 1-Tkgly⑶ 轉染HEK293細胞，用Western Blot方法檢測HSV-1TK和CD融合基因表達情況。檢測結果 如圖4所示。由圖4 Western Blot檢測結果可知，融合蛋白完整表達，且大小與預期一致。
[0033] 4、腫瘤細胞NCIH460的殺傷作用，來評價融合基因的功能：將步驟2製備得到的質 粒載體轉染腫瘤細胞NCIH460, 24小時後單獨或聯合給予相應的前藥（5-FC和GCV)共培養， 96小時後用WST-1方法檢測細胞增殖情況。WST-1檢測結果如（圖5)，細胞增殖情況一樣。 說明融合基因保留了各自基因功能，所表達蛋白的功能未受影響。
[0034] 實施例2 一種監測治療基因（⑶基因）體內表達情況和範圍的方法，具體包括如下步驟： 1、將標記基因 HSV-1TK和治療基因（⑶基因）通過linker序列（linker序列為 GSGGGGGGGGG)，連接構建得到得到融合基因的表達載體，具體步驟參加實施例1的步驟三。
[0035] 2、將融合基因表達載體pcDNA3. Ι-TKglyCD轉染腫瘤細胞NCIH460 ; 3、在裸鼠兩前上肢和一側後下肢接種野生型腫瘤細胞，另一側後下肢接種穩轉 TKgly⑶基因的腫瘤細胞NCIH460作為陽性對照。待腫瘤生長直徑達到3±0. 6cm時。從靜 脈給予2-[14C]FIAU。並於給予2-[14C]FIAU後的4、24、36和48小時用gamma相機和SPECT 成像，優化成像時間。最後一次體內成像後殺死裸鼠，並迅速剝取腫瘤，組織冷凍切片，組織 切片用定量放射自顯影成像。Real-time PCR測定組織中⑶融合基因表達量和範圍，並同 時和gamma相機和SPECT成像進行比較。（結果見圖6) 圖6結果顯示：⑶基因體內表達情況和分布與Gamma相機方法體內成像HSV-1TK基因 信號強弱成正相關。
【權利要求】
1. 一種監測治療基因體內表達情況和範圍的方法，其特徵在於，將治療基因與標記基 因 HSV-1TK融合，構建融合基因載體後，轉染治療受體，利用對HSV-1TK體內分子成像的方 法來間接反映治療基因在治療受體內的表達情況和體內分布情況。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述治療基因為CD基因、P53基因或Rb 基因。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述治療基因為CD基因。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述體內分子成像的方法為gamma相機成 像或SPECT成像。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述標記基因 HSV-1TK以FIAU為標記底 物，且FIAU的集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比。
【文檔編號】C12N15/85GK104195172SQ201410375803
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】張巨峰, 羅霞 申請人:廣東藥學院