用髮根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷的毛狀根的方法

2023-05-05 23:20:06 1

專利名稱：用髮根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷的毛狀根的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學、生理學、育種學以及基因工程等領域，涉及一種利用轉 基因技術獲得產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根的方法，具體涉及髮根農桿菌遺傳轉化粘毛 黃芩並獲得產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根的具體程序。本發明還提供利用基因工程技術 獲得的產黃芩苷的粘毛黃萃毛狀根及其培養的子代。
背景技術：
植物次生代謝產物具有極其複雜的化學結構，至今仍沒有找到有效的或經濟的合 成方法。相對於常規細胞培養，毛狀根培養系統具有生長快速、不需外源植物激素、
合成次生代謝物質能力強而且穩定、向培養液釋放部分代謝產物等優點。由於Ri質粒 轉化的毛狀根生長快，易於培養，有效成分高，具有表達完整的代謝通路，為藥用植 物次生代謝產物的工業化生產提供了廣闊前景。
目前，雖然國內外採用髮根農桿菌遺傳轉化藥用植物獲得生產次生代謝產物的毛 狀根的相關研究較多，但對遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷毛狀根的研究仍是空白。 粘毛黃芩屬於唇形科黃芩屬多年生藥用草本植物。該屬植物約300多種，世界廣布， 我國有100種以上，可作為黃芩藥用者約有7種左右，粘毛黃芩就是其中的一種。該 植物主要藥用成分為黃零苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等黃酮類化合物，現代藥 理學證實其具有清熱解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利膽、降壓脫敏、防曬美白等 作用。隨著國際上對黃芩苷等研究的持續升溫和認識的逐步深入，認為黃芩苷在清除 氧自由基、減輕組織的缺血再灌注損傷、調節免疫、促進細胞凋亡以及抗腫瘤和HIV 等多方面均有作用，具有重要的藥用價值和開發利用前景。然而目前獲得粘毛黃芩的 主要技術是人工栽培，但存在生產周期長、成活率低、農藥殘留超標和有效成分較低 等弊端，使得該方式商業前景尚不明朗。

發明內容
本發明的第一 目的就是提供一種轉基因技術遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷毛狀 根的方法，該方法將髮根農桿菌Ri質粒的T-DNA導入粘毛黃芩中，獲得粘毛黃芩毛狀根；
本發明的另一方面，還提供了一種用上述方法轉化的宿主細胞，這種經轉化的宿 主細胞發育為毛狀根。在實例中該宿主細胞是粘毛黃芩 本發明的技術方案如下
一種獲得產黃芩苷粘毛黃芩毛狀根的方法和利用該方法獲得的產黃芩苷的粘毛黃 芩毛狀根，該方法步驟如下-
(1) 採用任何可能的手段獲得無菌的粘毛黃芩；
(2) 採用任何轉基因方法轉移髮根農桿菌的Ri質粒的T-DNA到粘毛黃吝細胞、 組織、器官、植株中；包括以下步驟
A、 活化髮根農桿菌；
B、 髮根農桿菌浸染粘毛黃芩外植體；
C、 髮根農桿菌與粘毛黃芩外植體的共培養，步驟如下
I、 將侵染後的粘毛黃芩外植體接種在MS+AS 100/anoI丄"固體培養基上； II 、置於溫度為25°C ± 1. (TC恆溫暗培養1 5天
D、 外植體的除菌培養；
(3) 在特定的條件下篩選和鑑定毛狀根，方法如下
I 、提取粘毛黃芩毛狀根DNA
II、 獲得含ro/B和ra/C引物的PCR反應體系；
III、 PCR反應擴增毛狀根特有基因ro氾和ra/C;
IV、 電泳檢測目標條帶；
(4) 在適合的條件下培養粘毛黃芩毛狀根，用於生產黃芩苷。 用上述方法獲得的生命體，它是可生產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根。 在本發明中，術語"生命體"指粘毛黃芩的細胞、組織、器官、植株。 在本發明中，術語"任何轉基因方法"包括髮根農桿菌Ri質粒介導遺傳轉化、基
因槍法介導的遺傳轉化、花粉管通道介導基因轉化、生殖細胞浸泡法介導基因轉化。 在本發明中，術語"在特定的條件下篩選和鑑定轉化子"是指用在離體培養的條
件下根據毛狀根特殊的形態學特徵初步鑑定轉化子；可以使用PCR、 Southern雜交、
Northern雜交和Western印跡等方法來鑑定轉化子。
在本發明中，術語"在適合的條件下培養粘毛黃芩毛狀根"是指對經過鑑定的粘
毛黃芩毛狀根離體培養，並檢測黃芩苷的含量，篩選黃芩苷含量提高的優良轉化子進
行培養，獲得其後代。
在本發明中，利用轉基因技術，將髮根農桿菌Ri質粒的T-DNA導入粘毛黃芩細胞 獲得轉化毛狀根，通過篩選優良無性系，獲得黃芩苷及其相關黃酮類化合物含量相對 較高而穩定的毛狀根無性系，為黃芩苷的生產提供一種新型優質的可持續使用的藥源。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發 明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例l
粘毛黃芩無菌外植體的獲得
方法一利用外植體建立粘毛黃芩無菌外植體
採集粘毛黃芩新萌發出來的幼苗葉片，流水衝洗l小時；然後用75% (V/V)乙醇 浸泡45秒，無菌水衝洗3次；再用0.1% (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡9分鐘，無菌水 衝洗5次；然後接種在添加無菌叢生芽誘導培養基中(培養基盛於150mL三角瓶中，於 12rC滅菌20分鐘)，該培養基配方為MS基本培養基，30g/L蔗糖調節培養基，pH值 為5.8，再添加8.5g丄"的瓊脂粉。在光照培養箱中培養粘毛黃芩的葉片，培養條件為 25°C， 12小時光照，光照強度為55^1!101.111-2.3"。 17天後，即可獲得無菌的粘毛黃芩無 菌幼苗，等到幼莖長到6cm長時可用於遺傳轉化。
方法二利用粘毛黃芩種子在無菌條件下萌發獲得無菌外植體 選取粘毛黃芩飽滿種子在清水中浸泡10小時，然後流水衝洗5小時，75%(V/V) 乙醇浸泡30秒，0.1%HgCl2 (M/V)浸泡12分鐘，無菌水洗滌5次，接種於MS培 養基上，25t:的恆溫培養箱中暗培養。14天後，種子開始萌發，然後將其置於溫度為 25°C，光周期為12小時，光強為2000Lx的恆溫培養箱中，22天後長成茁壯的幼苗， 切取莖段做轉化外植體用。
實施例2
髮根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩獲得毛狀根
1、髮根農桿菌C58C1。使用前自超低溫冰箱取出，接種於50mlYEB液體培養基中(添加利福平終濃度為40mg七'1)， 28'C， 200rpm振蕩培養兩次，復甦菌體；
2、 第二次活化培養結束兩小時前加入乙醯丁香酮，使其終濃度達到lOOpmoH/1 也即菌液OD6oo達0.4時，加入乙醯丁香酮，繼續28。C， 200rpm振蕩培養，菌液00600 達0.6時，可用於轉化；
3、 室溫下4000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體用等體積MS液體培養基(含 lOOpmol'L-1乙醯丁香酮)懸浮，在28。C, 200rp振蕩培養，使菌液濃度達到的OD6。^0.2 左右，成為轉化液，此時可用於粘毛黃芩的遺傳轉化；1、 2、 3個步驟稱為活化髮根農 桿菌；
4、 取無菌粘毛黃芩幼嫩真葉、幼莖段、子葉和愈傷組織等植物不同部位，將莖切 成lcm小段，或將葉片切成2ci^左右，用無菌解剖針戳一些圓形傷口，放入上述轉 化液中，浸染15分鐘後取出，用無菌衛生紙吸乾，接種於添加100/mioH/1乙醯丁香 酮的MS固體培養基中共培養2 3天，培養條件為25°C，無光照。該步驟稱髮根農 桿菌與粘毛黃芩的共培養。
5、 共培養結束後，在無菌吸水紙上吸乾外植體上多餘水分，轉移至無植物生長調 節物的MS固體除菌培養基(添加500 mg，L"頭孢菌素以達到除菌的目的)中培養， 培養條件為25°C,黑暗條件下培養。9天後，在粘毛黃芩受傷的部位開始出現毛狀根。 該步驟稱為粘毛黃芩的除菌培養。
6、 外植體每隔5天轉入新鮮的同樣的培養基中，待轉化外植體上誘導出的毛狀根 長到5cm左右時，分別切下單條的毛狀根，接種在無植物生長調節物的1/2 MS固體培 養基上(添加500 mg七"頭孢菌素以達到除菌的目的)繼代培養；在無植物生長調節 物的1/2 MS固體培養基上生長的粘毛黃芩毛狀根表現出毛狀根特有的形態學特徵生 長十分迅速、分枝很多、生長失去向地性。以後每15 20天繼代培養一次，繼代5次 後，農桿菌可以去除桿菌；然後僅在1/2MS固體培養基上繼代培養方可。該步驟為粘 毛黃芩毛狀根的獲得與繼代培養。
實施例3
粘毛黃芩毛狀根的分子檢測
1、粘毛黃芩毛狀根基因組DNA的提取，方法如下
1)取200mg液體培養兩周的毛狀根，過濾後用10mL蒸餾水洗滌，充分吸乾，液 氮速凍，研磨成粉。2) 1.5 mL Eppendorf管中，力口 500 //L抽提buffer (3%巰基乙醇)，充分震蕩65。C 水浴50分鐘，每5分鐘顛倒混勻。
3) 4°C、 12，000rpm，離心10分鐘。
4) 吸上清，加500 ^L酚氯仿異戊醇(25:24:1)，輕輕混勻，靜置5分鐘鍾
至分層。
5) 室溫，12，000rpm，離心10分鐘。
6) 吸上清約350;/L，加等體積的氯仿異戊醇(24:1)，輕輕混勻，靜置5分鐘
至分層。
7) 室溫，12,000 rpm，離心10分鐘。
8) 吸上清約250;/L，加2倍體積的無水乙醇(一2(TC預冷)，充分混勾，室溫放 置10分鐘見有絮狀DNA析出。
9) 室溫，12,000 rpm，離心10分鐘。
10) 棄上清，沉澱用75%的乙醇洗2次，稍離心，吸淨殘餘乙醇，室溫放置10分 鍾，使乙醇揮發完全。
11) 力B lpLRNAase， 50//LTE，混勻，37。C水浴30—40分鐘。
12) 加40/zL氯仿，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層。 14)室溫，12，000rpm，離心10分鐘。
13) 吸取上清(約35 //L)到新Eppendorf管中，一2(TC保存，用於PCR檢測。 抽提緩衝液配方如下
100mM Tris-HCl(pH8.0) 2.5%(V/V) 巰基乙醇 500mM NaCl 20mM EDTA 1.5%(W/V) SDS
2、粘毛黃芩毛狀根中ro氾和w/C基因的PCR檢測
誘發並維持毛狀根形態的和ro/C基因是來源於髮根農桿菌的Ri質粒上。基 因檢測的PCR引物ra氾(423 bp)的引物為/ra氾(5，-GCT CTT GCA GTG CTA GAT ITS'), ro氾(5，-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC- 3，)； ro/C (626 bp)的引物為/ra/C (5，-TAA CAT GGC TGA AGA CGA CC- 3， )， m>/C (5'陽AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-
3，)。
反應體系均為(25 ;/L): ddH20 18 //L, 10 x PCRbuffer 2.5 〃L， 25腿ol/L MgCL2 2.0
//L， 10讓o1.1/1 dNTP mix 0.25;/L， 10 mmol/L primer 1 0.25 //L, 10 mmol/L primer 2 0.25 ;/L，
r叫DNApoLymerase 0.25 〃L (1.25 U)， Template基因組DNA 1.5 //L。
PCR反應程序94。C 5min—35循環(94°C for 40 sec—56°C for 40 sec—72。C
forlmin)—72°C 8 min。陽性對照為相應的工程菌，粘毛黃芩的天然葉片作為陰性對照。
PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。的擴增條帶大小為423 bp， w/c為626bp。
實施例4
粘毛黃芩毛狀根中黃芩苷含量和野生根中的含量比較
1、 黃芩苷吸收峰測定和標準曲線的製作
精密稱取2mg黃芩苷標準對照品，用200mL75X (V/V)乙醇溶解，配成濃度 為1000^g/mL，用乙醇溶液作空白對照，在200 500nm波長下測黃芩苷的吸光度值， 得到最大吸收波長。然後講母液分別梯度稀釋成200、 100、 80、 60、 40、 20/^mL"。 分別往試管中加各梯度濃度標準溶液1 mL，加75X乙醇至5mL,分別加入0.3mL5 %亞硝酸鈉，0.3mL 10%硝酸鋁溶液，然後以75%乙醇定容至10mL，混勻，放置20 分鐘，於278 nm波長處，用lcm比色杯測其吸光值，黃芩苷含量(//g)為橫坐標， 吸光值(A)為縱坐標，得對照品的線性回歸方程和標準曲線。
2、 粘毛黃芩中黃芩苷含量的測定
將培養30d的單克隆毛狀根洗淨，用吸水紙吸乾水分，稱鮮重後冷凍千燥30h至恆 重，研磨成粉，稱取100mg乾粉加入10mL甲醇超聲破碎20min，過濾，再提取一次， 合併濾液，將甲醇提取液濃縮蒸乾，用甲醇定容至10mL， 一2(TC保存，作為供試樣品 溶液。三年生自然根打粉後，稱取150mg，提取方法同上。
精密稱取2mg黃芩苷標準對照品，用色譜純甲醇溶解過濾，配成濃度為1000 pg/mL，分別梯度稀釋成280、 140、 70、 35、 17.5 pg'mU1。在相應的色譜條件下進樣， 且每一濃度進樣三次，記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積對進樣量回歸分析，得對 照品的線性回歸方程和標準曲線。結果為:粘毛黃芩毛狀根中黃芩苷含量佔乾重3.58%, 與3年生野生藥材黃芩黃苓苷的含量(7.62%)相比，約為藥材黃芩0.47倍，但從單 位時間黃芩苷生成量來看，毛狀根系是藥材黃芩的17.14倍，可見粘毛黃芩毛狀根培養 技術是獲取黃芩苷的高效策略。
權利要求
1.一種獲得產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根的方法，特徵在於採用轉基因技術，用髮根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩的器官，其步驟如下(1)粘毛黃芩無菌外植體的獲得；(2)採用轉基因方法轉移髮根農桿菌的Ri質粒的T-DNA到粘毛黃芩細胞、組織、器官或植株中；其中轉基因方法選擇髮根農桿菌Ri質粒介導遺傳轉化、基因槍法介導的遺傳轉化、花粉管通道介導基因轉化或生殖細胞浸泡法介導基因轉化；包括以下步驟A、活化髮根農桿菌；B、髮根農桿菌浸染粘毛黃芩外植體；C、髮根農桿菌與粘毛黃芩外植體的共培養，步驟如下I、將侵染後的粘毛黃芩外植體接種在MS+AS 100μmol·L-1固體培養基上；II、置於溫度為25℃±1.0℃恆溫暗培養1～5天D、外植體的除菌培養；(3)粘毛黃芩毛狀根的獲得與繼代培養；(4)粘毛黃芩毛狀根的分子檢測，方法如下I、提取粘毛黃芩毛狀根DNAII、獲得含rolB和rolC引物的PCR反應體系；III、PCR反應擴增毛狀根特有基因rolB和rolC；IV、電泳檢測目標條帶；(5)粘毛黃芩毛狀根中黃芩苷的含量檢測。
2. 用權利要求1所述方法獲得產黃芩苷的粘毛黃芩的毛狀根，其特徵在於其基因 組中整合了來自於Ri質粒的誘導毛狀根的基因。
3. 用權利要求1所述方法獲得粘毛黃芩毛狀根的繼代培養毛狀根。
全文摘要
本發明提供了一種利用基因工程技術遺傳轉化粘毛黃芩，獲得生產黃芩苷的粘毛黃芩的毛狀根的方法。涉及包含髮根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩的方法，遺傳轉化獲得可生產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根。其過程是用髮根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩，獲得了粘毛黃芩毛狀根，經分子檢測確為遺傳轉化的毛狀根，HPLC檢測表明遺傳轉化獲得的粘毛黃芩毛狀根能夠生產黃芩苷。本方法可以為黃芩苷的生產提供一種新型可持續的新型藥源。
文檔編號C12N15/82GK101182542SQ20071009305
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月27日 優先權日2007年11月27日
發明者敏 孫, 王淑芳, 桅 雷 申請人:西南大學