基因多態性檢測方法、診斷方法以及用於其的裝置及檢驗試劑盒的製作方法
2023-05-05 22:21:41 2
專利名稱：基因多態性檢測方法、診斷方法以及用於其的裝置及檢驗試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測以人為代表的動物或植物的基因組DNA的多態性、特別是SNP(單鹼基多態性)的方法、裝置、試劑，以及使用該結果進行疾病發病率的診斷或進行所給予的藥劑的種類與效果以及副作用之間的關係等的診斷的方法及其裝置。
該基因多態性檢測方法或裝置可以用於基因分析的研究或臨床領域。
背景技術：
作為利用基因多態性來預測疾病的患病容易程度等的方法或裝置，提出了如下所述的方法或裝置。
為了決定患者是否容易患上敗血病及/或敗血病是否快速進展，從患者身上採集核酸樣品，檢測該樣品中的型式2(pattern 2)等位基因或與型式2等位基因連鎖不平衡的標記基因，如果檢測出型式2等位基因或與型式2等位基因連鎖不平衡的標記基因，則判斷為該患者容易患敗血病(參照專利文獻1。)。
為了診斷人的flt-1基因中的1或其以上的單核苷酸多態性，通過決定人核酸的1或其以上的位置1953、3453、3888(分別按照EMBL受理編號X51602中的位置)、519、786、1422、1429(分別按照EMBL受理編號D64016中的位置)、454(按照序列編號3)及696(按照序列編號5)的序列，參照flt-1基因中的多態性，決定此人的體質(特開2001-299366號公報。)。
有與鑑別SNP位點的鹼基即分型有關的很多手法的報導。下述手法是其中具有代表性的手法。
為了使用較少量的基因組DNA，對涉及到數十萬處的SNP位點進行分型，使用基因組DNA及多對引物同時擴增至少包括一個單鹼基多態性位點的多個鹼基序列，使用擴增後的多個鹼基序列，利用分型工序辨別該鹼基序列中含有的單鹼基多態性位點的鹼基。作為該分型工序，使用侵入(invade)法或Taqman PCR法(參照專利文獻3。)。
但是，在SNP的分型中，在進入擴增工序的階段必須配製基因組DNA，其中需要花費時間、人力和成本。
另一方面，如果只著眼於擴增DNA的PCR法，還提出了不用進行前處理而從血液等樣品直接進行PCR反應的方法。於是，在擴增含有基因的樣品中的目的基因的核酸合成法中，向基因擴增反應液中添加含有基因的樣品中的基因包含體或含有基因的樣品本身，在添加後的該反應液的pH為8.5～9.5(25℃)下，擴增含有基因的樣品中的目的基因(參照專利文獻4。)。
專利文獻1特表2002-533096號公報專利文獻2特開2001-299366號公報專利文獻3特開2002-300894號公報專利文獻4專利第3452717號公報專利文獻5專利第3494509號公報非專利文獻1Hsu T.M.，Law S.M.Duan S，Neri B.P.，Kwok P.Y.，「利用雙色螢光偏振技術的侵入檢測，對單核苷酸多態性進行的基因分型(Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay withdual-color fluorescence polarization detection)」，Clin.Chem.，2001Aug；47(8)1373-7發明內容就已經構建的分型系統而言，為了用PCR法擴增需要進行分型的多個SNP區域，雖然最初採集的DNA量很少即可，但在用PCR法擴增之前，必需進行預先從生物體樣品中提取DNA的前處理。為此該前處理需要花費時間和人力。
另一方面，已經確立了在不從血液等生物體樣品中提取核酸的狀態下，直接利用PCR法進行擴增的方法，但在將該直接PCR法與分型方法結合起來時，對需要進行分型的多個SNP位點同時進行擴增的自動化系統尚未構建起來。
於是，本發明的目的在於，可以從樣品的配製階段開始自動地進行用於多個目的SNP位點的分型。
本發明的基因多態性檢測方法包括使未實施核酸提取操作的生物體樣品，直接作用於含有將各多個多態性位點分別夾在中間並結合的多個引物的基因擴增反應液，使基因組DNA擴增的擴增工序；和使對應所述多個多態性位點配製而成的分型試劑作用於在所述擴增工序中擴增的基因組DNA，辨別所述多個多態性位點的鹼基的分型工序。
在此，如果表示多態性位點與引物的關係，則為了擴增1個多態性位點而需要將該多態性位點夾在中間並結合的一對引物。由於在成為對象的生物體樣品中存在多種多態性位點，所以這些多態性位點位於彼此分離的位置時，需要多態性位點的種類數的2倍種類的引物。但是，在2個多態性位點接近的情況下，可以分別將這些多態性位點夾在中間並使引物結合、擴增，另外也可以不在這些中的2個多態性位點之間結合引物，而只在2個多態性位點的序列的兩側結合引物，進行擴增。因而，必需的引物種類未必是多態性位點的種類數的2倍。本發明中的「分別將多個多態性位點夾在中間並結合的多個引物」不僅指一對引物將1個多態性位點夾在中間並結合的情況，還包括將2個或其以上的多態性位點夾在中間並結合的情況，使用的是擴增多個多態性位點所必需的種類的引物。
多態性包括變異、缺失、重複、轉移等。具有代表性的多態性是SNP。
在此，核酸提取操作是指分解核酸包含體(細胞、細菌、真菌、病毒等內部含有核酸的膜結構體)，從已分解的核酸包含體中提取核酸的一系列操作。核酸包含體的分解例如使用酶、表面活性劑、離液劑等進行。從已分解的核酸包含體提取核酸例如使用苯酚或苯酚/氯仿等進行。
因而，未實施核酸提取操作的生物體樣品是指未實施這一系列操作的樣品，包括含有核酸包含體的生物體樣品本身、進行了加熱處理或凍結處理等核酸包含體已分解的狀態的生物體樣品、從生物體樣品回收的核酸包含體。從生物體樣品回收核酸包含體的回收方法，例如可以舉出使用離心/超速離心、聚乙二醇等共沉澱劑、吸附載體等的方法。
在此，生物體樣品是指動植物組織、體液、排洩物等，體液包括血液或唾液。
基因組DNA包括以人為代表的動植物DNA、細菌及病毒等的DNA、進而還包括以RNA為模板合成的cDNA。
上述擴增工序可以使用PCR法等。在這種情況下，優選在25℃、pH為8.5～9.5的條件下進行PCR法。
從上述未實施核酸提取操作的生物體樣品的基因組DNA的擴增工序，詳細記載於專利文獻4、5中。
上述分型工序可以使用侵入法或Taqman PCR法。
在本發明的診斷方法中，準備針對特定的多態性或多個多態性的組合的診斷值作為資料庫，基於利用本發明的基因多態性檢測方法檢測出的多態性的結果，從所述資料庫讀取診斷值。在此，作為診斷值，可以包括疾病發病率、給予藥劑的種類與效果及副作用之間的關係等。
本發明的基因多態性檢測裝置的一個方式，具備如下所述的結構來自動地檢測基因多態性設置未實施核酸提取操作的生物體樣品的樣品設置部；對含有將多個多態性位點分別夾在中間並結合的多個引物的基因擴增反應液進行保持的擴增試劑保持部；保持對應上述多個多態性位點配製而成的分型試劑的分型試劑保持部；為了在將所述生物體樣品添加到所述基因擴增反應液中而成的反應液內使基因組DNA擴增，而控制該反應液的溫度的擴增部；具有保持分別對應所述多個多態性位點並發出螢光的探針的探針固定部，為了使在所述擴增部擴增的基因組DNA和所述分型試劑的反應液與各探針發生反應而控制該反應液的溫度的分型反應部；可以移動到所述樣品設置部、所述擴增試劑保持部、所述分型試劑保持部、所述擴增部及所述分型反應部的位置，將樣品、擴增試劑、分型試劑及樣品與這些試劑的反應液分注到規定位置的分注裝置；向所述分型反應部的各探針固定部照射激發光，來檢測螢光的螢光檢測裝置；對所述擴增部及分型反應部的溫度控制、所述分注裝置的分注動作以及所述螢光檢測裝置的檢測動作進行控制的控制部。
在此，各探針固定部不僅可以保持1種探針，還可以保持2種以上的探針。當在1個探針固定部保持2種以上的探針時，彼此分離配置，以能夠區別檢測從各探針發出的螢光。
作為上述分型反應部的例子，上述分型反應部在每個所述探針固定部具備上部開口並供給反應液的凹部。在這種情況下，優選進一步具有對防止反應液的蒸發的油進行保持的油保持部，所述分注裝置在向所述凹部分配反應液之前或之後，可以向所述凹部分配所述油。
作為上述分型反應部的另一個例子，上述分型反應部在每個所述探針固定部具備供給反應液的流道。該流道可以在每個上述探針固定部具備反應液的供給用入口和排出用出口，也可以與反應液的供給用共用入口和排出用共用出口連接。在這種情況下，上述探針固定部可以在上述流道內形成為凹部。
作為上述分型反應部的進而另一個例子，上述分型反應部具備在內部形成多個所述探針固定部的流道。
所述樣品設置部與所述擴增部共用溫度調節部。
在本發明的檢驗試劑盒中，將如下所述的結構形成為一體，這些結構包括收容含有將多個多態性位點分別夾在中間並結合的多個引物的基因擴增反應液的擴增試劑收容部；收容對應所述多個多態性位點配製而成的分型試劑的分型試劑收容部；以及個別保持對應所述多個多態性位點的各位點並發出螢光的探針的多個探針固定部。
檢驗試劑盒也可以進一步將收容對樣品進行稀釋的稀釋液的稀釋液收容部形成為一體。
本發明的基因多態性檢測裝置的其他一個方式，使用本發明的檢驗試劑盒，具備安裝該檢驗試劑盒的檢驗試劑盒安裝部；為了在所述擴增試劑收容部內、在所述基因擴增反應液與體液樣品的反應液內，使基因組DNA擴增，而控制該反應液的溫度的擴增部；為了使在所述擴增部擴增的基因組DNA和所述分型試劑的反應液與所述探針固定部的探針發生反應而控制該反應液的溫度的分型反應部；從所述擴增試劑收容部向所述分型試劑收容部移送液體以及從所述分型試劑收容部向所述各探針固定部移送液體的送液裝置；向所述各探針固定部照射激發光來檢測螢光的螢光檢測裝置；對所述擴增部及分型反應部的溫度控制、所述送液裝置的送液動作以及所述螢光檢測裝置的檢測動作進行控制的控制部。
作為送液裝置的一例，是被設置成具備分注噴嘴並可以向必要的場所移動的分注裝置。
本發明的基因多態性檢測裝置的其他一個方式，使用本發明的檢驗試劑盒，而作為該檢驗試劑盒，使用各收容部由軟質材料形成的檢驗試劑盒，所述送液裝置是通過擠壓所述各收容部並使其變形來送液的擠壓裝置。
本發明的診斷裝置具備本發明的基因多態性檢測裝置；存儲關於特定的SNP或多個SNP的組合的疾病發病率或給予藥劑的種類和效果及副作用等的診斷值的資料庫；基於利用所述基因多態性檢測裝置檢測出的SNP結果，從所述資料庫讀取診斷值並進行顯示的顯示裝置。
圖1是概要地表示本發明的檢測方法的圖。在此，對擴增工序使用PCR法、分型工序使用侵入法進行說明。
在PCR工序中，向血液等生物體樣品2中添加PCR反應液4，或相反，向PCR反應液4中添加生物體樣品2。例如採取1μL樣品2，向其中添加10μL左右的PCR反應液4。PCR反應液4被預先配製，含有用於需要測定的SNP位點的多個引物，向其中添加用於調節pH的緩衝液、4種脫氧核苷酸(deoxyribonucleotide)、其他必需的試劑，在與樣品2混合時，將pH調節成8.5～9.5。
使樣品2與PCR反應液4的混合液，按照規定的溫度循環進行PCR反應。PCR溫度循環包括變性、引物附著(退火)及引物延伸的3個工序，通過重複進行該循環，使DNA擴增。作為各工序的一例，變性工序為94℃下1分鐘，引物附著工序為55℃下1分鐘，引物延伸為72℃下1分鐘。樣品沒有實施基因組提取操作，但在PCR溫度循環的高溫下，DNA從血細胞或細胞游離出來，PCR反應所必需的試劑與DNA接觸，反應進行。
在PCR反應結束後，添加侵入試劑6。侵入試劑6中含有發出螢光的FRET探針及裂解酶(cleavase結構特異的DNA分解酶)。FRET探針是具有與基因組DNA完全沒有關係的序列的螢光標記寡核苷酸，與SNP的種類無關，是共用的序列。
接著，向分型反應部的探針固定部8中添加已添加侵入試劑6的反應液，使其反應。在探針固定部8的各部位，分別對應多個SNP位點個別保持侵入探針和報導(reporter)探針，反應液與侵入探針發生反應，只要存在對應該報導探針的SNP，就可以發出螢光。
在專利文獻3的段落 ～ 中有關於侵入法的詳細記載。
各報導探針根據與其對應的SNP鹼基準備2種探針，可以辨別出該SNP是純合子還是雜合子。
在本發明中使用的擴增工序的PCR法同時擴增多個目的SNP位點，而且從沒有實施核酸提取操作的生物體樣品，直接利用PCR法，使含有這些SNP位點的多個基因組DNA擴增。所以，使含有用於這些SNP位點的多個引物的基因擴增反應液直接作用於生物體樣品，使其在25℃、pH8.5～9.5的條件下，發生PCR反應。
PCR反應液包括pH緩衝液，MgCl2、KCl等鹽類，引物，脫氧核苷酸類及熱穩定性合成酶。此外，也可以根據需要添加表面活性劑或蛋白等物質。
pH緩衝液除了三(羥甲基)氨基甲烷與鹽酸、硝酸、硫酸等無機酸的組合以外，還可以使用各種pH緩衝液。在PCR反應液中，優選以10mM～100mM之間的濃度使用已調節pH的緩衝液。
引物是指作為利用PCR反應合成DNA的開始點發揮作用的寡核苷酸。引物可以合成，也可以從生物界中分離。
合成酶是通過附加引物來合成DNA用的酶，也包括化學合成系。作為適當的合成酶，包括大腸桿菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase)I、大腸桿菌(E.coli)的DNA聚合酶的克列諾(Klenow)片段、T4DNA聚合物、TaqDNA聚合酶、T.litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KOD DNA聚合酶、EX TaqDNA聚合酶、逆轉錄酶等，但不被這些所限定。「熱穩定性」是指即使在高溫下、優選在65～95℃下也可以保持其活性的化合物的性質。
在分型工序中使用的侵入法是通過使等位基因特異寡核苷酸與含有分型對象的SNP的DNA發生雜交(hybridyzation)，來對SNP位點進行分型的方法，是使用如下所述物質的方法，即含有分型對象的SNP的DNA，對分型對象的SNP的各等位基因具有特異性的2種報導探針及1種侵入探針，和識別DNA結構並切斷的具有特殊內切酶活性的酶(參照專利文獻3。)。
在本發明的基因多態性檢測方法中，從沒有實施核酸提取操作的生物體樣品中同時擴增目的多個多態性位點，並同時對這些多態性位點進行分型，所以可以以簡單的工序、在短時間內進行多態性的分型。
本發明的診斷方法是基於得到的多態性的分型，從資料庫讀取診斷值，所以可以在醫療現場使用。
在本發明的第一方式的基因多態性檢測裝置中，只將沒有實施核酸提取操作的生物體樣品設置於樣品設置部開始檢測，就可以自動地實行目的多個多態性的分型。
在本發明的第2、3方式的基因多態性檢測裝置中，由於使用的檢驗試劑盒是預先收容基因擴增反應液及分型試劑或進而還預先收容稀釋液，探針固定部作為一體形成，所以可以用簡單的測定裝置自動地實行目的多個多態性分型。
在本發明的診斷裝置中，可以從多態性的分型自動地實行至基於該分型的診斷值的顯示。
圖1是概要地表示本發明的檢測方法的流程圖。
圖2(A)是概要地表示一個實施例的基因多態性檢測裝置的主要部分立體圖，(B)是其中使用的分型反應容器的部分截面圖。
圖3是表示同一實施例的臺子和分注探針的布局。
圖4是表示基因多態性檢測裝置的其他實施例中的臺子和分注探針等的布局的平面圖。
圖5是概要地表示基因多態性檢測裝置的另一個實施例的主要部分立體圖。
圖6是表示在侵入反應區配置的分型反應容器的其他例子的圖，(A)為平面圖，(B)為(A)在X-X線位置的截面圖。
圖7是表示在侵入反應區配置的分型反應容器的另一個例子的平面圖。
圖8是表示在侵入反應區配置的分型反應容器的另一個例子的圖，(A)為平面圖，(B)為沿著1個流道的截面圖。
圖9是表示在侵入反應區配置的分型反應容器的另一個例子的圖，(A)為平面圖，(B)為在(A)的Y-Y線位置的截面圖。
圖10是表示條狀的檢驗試劑盒的一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖11是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖12是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖13是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖14是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖15是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖16是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖17是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖18是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖19是表示條狀的檢驗試劑盒的另一個實施例的圖，(A)為立體圖，(B)為將其正視圖與螢光檢測裝置的物鏡一起顯示的圖。
圖20是概要地顯示簡易型自動基因多態性檢測裝置的一個實施例的主要部分立體圖。
圖中2-樣品，4-PCR反應液，6-侵入試劑，8-探針固定部，10-樣品臺，12-採血管，14-PCR反應液容器，15-侵入反應試劑容器，17-礦物油容器，20-反應臺，22-PCR區，22a-預熱區，24-擴增反應容器，28-侵入反應區，30、30a、30b、30c、30d-分型反應容器，34-噴嘴，40-清洗水，42-孔，44-侵入探針，45-礦物油，50-螢光檢測裝置，70-PCR反應容器設置部，71-分型反應容器設置部，72-容器搬運臂，74、78-流道，82-室，88-稀釋液收容部，90-PCR反應液收容部，92-侵入反應試劑收容部，94、94a、94b、94c、96b、98-侵入探針固定部，122-檢驗試劑盒，120-基因多態性檢測裝置，124-噴嘴124，126-測光部，128-顯示器。
具體實施例方式
圖2(A)是概要地表示一個實施例的自動基因多態性檢測裝置的圖。
10是兼具樣品設置部與試劑保持部的取樣(sample)臺。樣品設置部中配置有採血管12作為樣品容器。作為採血管12，裝有可以搭載各種尺寸如直徑13mm的、直徑16mm的容器等、進而也可以搭載取樣量杯(sample cup)的通用接合器(universal adapter)，可以對應各種樣品容器。用採血管12採取血液，作為沒有實施基因組提取操作的體液樣品，搭載於取樣臺10上。
在取樣臺10的試劑保持部搭載作為擴增試劑的PCR反應液14和作為分型試劑的侵入反應試劑15。
以下顯示各反應液的組成，詳細地說明本發明，但本發明的技術範圍不被這些實施例所限定。
相對於人新鮮血液1μl，使用PCR反應液24μl，進行PCR。
在該PCR反應液中，混入各50mmol的40種引物(20對)、EX-TaqDNA聚合酶(寶酒造公司制)10個單位、TaqStart(CLONTECH Laboratories公司制)0.55μg、AmpDirect(島津製作所制)。引物例如可以使用專利文獻3的表1中記載的SNP ID1～20、序列編號1～40等。
侵入試劑使用侵入檢測試劑盒(Invader Assay Kit)(Third WaveTechnology公司制)。即，試劑盒中含有的緩衝液∶FRET探針∶裂解酶∶蒸餾水，混合配製成3∶3∶3∶50。
20是反應臺，反應臺20的內側為PCR區22，配置有擴增反應容器24。PCR區22設有溫度調節部，使反應液的溫度成為為了進行PCR擴增反應而設定的溫度。擴增反應容器24是可以一次性使用的樹脂制，為了使熱交換性變得更好而形成為薄壁。PCR區22的溫度設定為，在例如94℃、63℃、72℃的3個階段變化，重複進行該循環。
在反應臺20，在PCR區22的外周側配置有與PCR區22為同心圓狀的分型反應用侵入反應區28。在侵入反應區28配置有分型反應容器30，在分型反應容器30形成與需要檢測的SNP數目對應的數目或它們的數倍數的微小孔42。孔42的容量為例如數10nL～數μL。就侵入反應區28而言，為了成為與PCR區22不同的溫度，具備與PCR區22獨立的溫度調節部。侵入反應區28的溫度例如被設定為63℃。
分型反應容器30的截面圖如圖2(B)所示，在各孔42中預先固定有與SNP對應的侵入探針和報導探針44。向各孔42中分注含有利用PCR反應擴增的DNA的反應液和侵入反應試劑，與侵入探針44發生反應。只要在被分注的反應液中存在與該侵入探針44對應的SNP，FRET探針就會引起發出螢光。
作為報導探針和侵入探針的具體例，例如可以使用非專利文獻1的表1中記載的Primary probe 1、2和Invader probe。
侵入探針和報導探針以風乾的狀態固定於孔內。
為了從孔42的底面側測定來自分型反應容器30的螢光，分型反應容器30由低自發螢光性(很少從其自身產生螢光的性質)而且光透過性的樹脂例如聚碳酸酯等材料形成。
回到圖2(A)進行說明，為了測定來自分型反應容器30的螢光，而配置螢光檢測裝置50。螢光檢測裝置50具備發出473nm的雷射光的雷射二極體(laser diode)(LD)或發光二極體(LED)52作為激發光源，具備使該雷射光在容器30的孔42的底面聚光並照射的一對透鏡54、56。透鏡54使來自雷射二極體52的雷射光聚光成為平行光，透鏡56是使變為平行的雷射光會聚、照射於孔42的底面的物鏡。物鏡56還起到使從孔42產生的螢光聚光的透鏡的作用。在一對透鏡54、56之間設有分色鏡(dichroic mirror)58，分色鏡58的波長特性被設定為使激發光透過、使螢光反射。在分色鏡58的反射光(螢光)的光程上進一步設置分色鏡60。分色鏡60的波長特性被設定為反射525nm的光、透過605nm的光。在利用分色鏡60的反射光的光程上配置有檢測525nm的螢光的透鏡62和光檢測器64，在利用分色鏡60的透過光的光程上配置有檢測605nm的螢光的透鏡66和光檢測器68。通過利用此兩個檢測器64、68檢測2種螢光，檢驗出有無與固定於各孔的侵入探針對應的SNP，和該SNP是純合子還是雜合子。作為標記螢光體，可以使用例如FAM、ROX、VIC、TAMRA等。
在取樣臺10與反應臺20之間配置有具有噴嘴34的分注探針32。該噴嘴34在取樣臺10與反應臺20之間移動，進行如下動作，即從配置於取樣臺10的採血管12吸引樣品，向位於反應臺20的PCR區的擴增反應容器24分注的動作；將配置於取樣臺10的PCR反應液14分注於擴增反應容器24的動作；將配置於取樣臺10的侵入反應試劑15分注於擴增反應容器24的動作；進而將擴增反應容器24的反應液分注於分型反應容器30的孔42的動作。為了進行利用噴嘴34的分注動作的操作，注射器泵(syringe pump)38與清洗水40藉助切換閥36與噴嘴34連接。清洗水40用於液體的分注和噴嘴34的清洗。
為了防止在擴增反應容器24或孔42中在測定螢光時反應液乾燥，在取樣臺10中還進一步配置有礦物油的容器17，噴嘴34向孔42分注該礦物油，用符號45表示該礦物油，其可以覆蓋反應液的表面，抑制蒸發。
圖3是表示該實施例的各臺10、20和分注探針32的布局的平面圖，探針32以軸32a為中心，在水平面內旋轉，同時也向垂直方向變位，進行分注動作。
說明該實施例的動作。
分注探針32向PCR區的擴增反應容器24分注採血管12的樣品例如1～數μL，接著，分注探針32向已分注該樣品的擴增反應容器24內分注PCR反應液14例如5～10μL。另外，相反，也可以先分注該PCR反應液14，然後再分注樣品。在已分注樣品和PCR反應液的擴增反應容器中，例如重複進行1～1.5小時的規定溫度循環，進行PCR反應。也向PCR區的其他擴增反應容器24中依次分注樣品和反應液，重複進行PCR反應。
利用分注探針32，向結束PCR反應的擴增反應容器24中添加侵入反應試劑15並混合。該混合液利用分注探針32向侵入反應區28的分型反應容器30的多個孔42中分注，進行數分鐘～數小時的侵入反應。在該反應過程中或反應結束後，利用螢光檢測裝置50檢測螢光。在向分型反應容器30中分注反應液之後，為了防止反應液的蒸發，也可以在孔42的反應液上分注礦物油。
圖4是表示其他實施例的基因多態性檢測裝置中的臺等的布局的圖。在此，在PCR區的更內側設有預熱區22a。預熱區22a具備維持在94℃的溫度調節部，可以使在此處配置的擴增反應容器始終保溫在94℃。另外，為了可以交換PCR反應容器24和分型反應容器30，設有PCR反應容器設置部70和分型反應容器設置部71，為了交換這些PCR反應容器24和分型反應容器30而設有容器搬運臂72。
在該實施例的基因多態性檢測裝置中，利用容器搬運臂72，將擴增反應容器24和分型反應容器30分別搬運至規定的位置。擴增反應容器24被搬運至PCR反應區22和預熱區22a兩者並進行保持。採血管12的樣品首先被分注至預熱區22a的擴增反應容器24中，被預熱至94℃。預熱區22a的擴增反應容器在PCR反應開始時，由容器搬運臂72搬運至PCR區22。
然後，在圖2、3的實施例中說明的動作相同，向PCR區22的擴增反應容器24的樣品上分注PCR反應液，進行PCR反應。在PCR反應結束後，分注侵入反應試劑，然後擴增反應容器24的反應液被分注至分型反應容器30的多個孔，進行侵入反應，利用螢光檢測裝置檢測螢光。
在該實施例中，反應結束後的擴增反應容器24和分型反應容器30由容器搬運臂72搬運至廢棄部，被廢棄，新的擴增反應容器24和分型反應容器30被保持在反應臺的規定位置。
圖5是表示基因多態性檢測裝置的另一個實施例的圖，在該實施例中，省略了取樣臺，樣品設置部和PCR區被設於同一區域，溫度調節部也共用，擴增反應容器24兼具樣品容器的功能。PCR反應液容器14、侵入反應試劑容器15及礦物油容器17，配置於在反應臺20的附近且可被分注探針32進行分注的位置。其他結構與圖2的實施例相同。
對該實施例的動作進行說明。
採血管的樣品採取例如1～數μL，分注至擴增反應容器24，設置於PCR區。在PCR反應開始時，分注探針32向已分注有樣品的擴增反應容器24中分注PCR反應液14例如5～10μL。另外，相反，也可以先分注PCR反應液14，然後再分注樣品。在已分注樣品和PCR反應液的擴增反應容器中，例如重複進行1～1.5小時的規定溫度循環，進行PCR反應。也向位於PCR區的已分注樣品的其他擴增反應容器24中依次分注PCR反應液，重複進行PCR反應。
利用分注探針32，向已結束PCR反應的擴增反應容器24中添加侵入反應試劑15並混合。該混合液利用分注探針32向侵入反應區28的分型反應容器30的多個孔42中分注，進行數分鐘～數小時的侵入反應。在該反應過程中或反應結束後，利用螢光檢測裝置50檢測螢光。
圖6～9是分別表示配置於侵入反應區的分型反應容器的其他例子的圖。
圖6的分型反應容器30a在基體上形成多個流道74，在流道74固定有1種或多種侵入探針。當在1個流道74固定多種探針時，為了可以區別、檢測互相的螢光，在彼此分離的場所固定。為了從流道74的底面側測定螢光，基體是由低自發螢光性、光透過性的樹脂等材料形成。
形成流道74的基體，由2張基板76a、76b接合構成。為了使流道74在基板的內側，在一張基板76a的表面形成流道74用的槽，在該流道形成面接合有另一張基板76b。在流道74的兩端設有反應液用的入口78a和出口78b，它們分別貫通基板76b，在基體表面形成開口。
圖7的分型反應容器30b與圖6的分型反應容器30a一樣在基體內部具有流道74，但該分型反應容器30b的流道74在其中途形成有面積變大的部分74a。該部分74a的深度可以變得比其他流道部分深。在該部分74a固定有侵入探針。
在圖6、圖7的分型反應容器30a、30b中，如果向各入口78a分注反應液，則反應液進入各自的流道74，與固定於內部的侵入探針發生反應，如果存在與該侵入探針對應的SNP，則發出螢光。
圖8所示的分型反應容器30c，利用2張基板在基體內部形成有流道78，這一點雖然與圖6、7的分型反應容器相同，但固定有侵入探針的全部流道與共用的反應液入口80a和共用的反應液出口80b連接，這一點則是不同的。
在圖8的分型反應容器30c中，如果向共用的入口80a分注反應液，則反應液進入所有的流道78，與固定於各流道78的內部的侵入探針發生反應，如果存在與這些侵入探針對應的SNP，則發出螢光。
圖9所示的反應容器30d，在基體內部形成流道82的寬度很寬的室，在其兩端設有向基體表面開口的入口84a和出口84b。在室82內，多種侵入探針44被固定於彼此分離的位置。
在圖9的分型反應容器30d中，如果向共用的入口84a分注反應液，則反應液進入流道的室82，與各侵入探針44發生反應，如果存在與這些侵入探針44對應的SNP，則發出螢光。
圖10～圖19是表示在本發明的其他方式的檢測裝置中使用的條狀的檢驗試劑盒的圖。在各圖中，(A)為立體圖，(B)為其正視圖。
在各檢驗試劑盒中，具備向基板面的一個方向膨出的、稀釋液收容部88、PCR反應液收容部90及侵入反應試劑收容部92的3個收容部，和配置於基板面內的多個侵入探針固定部94。
在各收容部88、90、92中分別收容有稀釋液、反應液或反應試劑，為了在使用前的狀態下不發生液體洩漏，利用可以裝卸的薄膜或板密封各收容部88、90、92的開口。剝離稀釋液收容部88的開口的薄膜或板，利用噴嘴95，將樣品血液分注至稀釋液收容部88。樣品分注後，稀釋液收容部88的開口再次被薄膜或板關閉，檢驗試劑盒被安裝在檢測裝置。
侵入探針固定部94固定彼此不同的侵入探針，為了可以從基板的背面側檢測出產生的螢光，至少設置有侵入探針固定部94的部分的基板的材料是由低自發螢光性且光透過性的樹脂等形成。
在圖10的檢驗試劑盒中，侵入探針固定部94彼此分離配置，在基板表面露出。
從該檢驗試劑盒中的收容部88、90、92的液體的移送，使用分注噴嘴進行。所以，密封收容部88、90、92的開口的薄膜或板，優選為可以容易地被分注噴嘴穿過的材料。
該試劑盒，在使用時利用分注噴嘴將血液等樣品分注至稀釋液收容部88之後，安裝於後述的基因多態性檢測裝置(圖20)。在該基因多態性檢測裝置內，該試劑盒的稀釋液收容部88內的樣品由分注噴嘴移送至PCR反應液收容部90，在基因多態性檢測裝置內，利用規定的溫度循環進行PCR反應。在PCR反應結束後，PCR反應液收容部90內的反應液由分注噴嘴移送至侵入反應試劑收容部92中，與侵入反應試劑混合。然後，侵入反應試劑收容部92的反應液由分注噴嘴分注至各侵入探針固定部94上。在各侵入探針固定部94中，如果樣品中存在分別與其對應的SNP，則侵入反應會產生螢光，用基因多態性檢測裝置內的螢光檢測裝置進行檢測。
圖11的檢驗試劑盒，除了侵入探針固定部94a的結構以外，與圖10的相同。侵入探針固定部94a的結構與圖6的分型反應容器30a相同。
圖12的檢驗試劑盒，也是除了侵入探針固定部的結構以外，與圖10的相同。在該檢驗試劑盒中，侵入探針固定部94b成為流道形狀，在該流道內固定有侵入探針。固定有多個侵入探針的多個流道與共用的入口96a和出口96b連接。只有入口96a和出口96b具有開口，在基板內形成有流道。
在該檢驗試劑盒中，反應液向侵入探針固定部94b的分注，只需要向入口96a進行1次分注即可。向入口96a分注的反應液進入流道內，與固定於流道內的侵入探針發生反應，如果樣品中存在分別與其相對應的SNP，則侵入反應會產生螢光，用基因多態性檢測裝置內的螢光檢測裝置進行檢測。
在圖13的檢驗試劑盒中，多個侵入探針彼此分離固定在用符號94c表示的室上的寬流道上。室94c形成在基板內部，入口96a和出口96b具有開口。在這種情況下，反應液向侵入探針固定部94c的分注，也只需要向入口96a進行1次分注即可。向入口96a分注的反應液進入室94c內，與固定於室94c內的侵入探針發生反應，如果樣品中存在分別與其對應的SNP，則侵入反應會產生螢光，用基因多態性檢測裝置內的螢光檢測裝置進行檢測。
在圖14的檢驗試劑盒中，侵入探針固定部98，在濾紙等低自發螢光性(spontaneous-fluorescent)的材料的多個位置固定不同的侵入探針，安裝於基板。侵入探針固定部98在基板表面露出。
在該檢驗試劑盒中，反應液可以利用噴嘴只向侵入探針固定部98的一端分注，反應液通過在侵入探針固定部98的材料中擴散，來與固定於各位置的探針發生反應。
圖15的檢驗試劑盒也與圖14的檢驗試劑盒相同，具備在濾紙等低自發螢光性的材料的多個位置固定有不同侵入探針的侵入探針固定部96b。但是，在檢驗試劑盒中，侵入探針固定部96b由透明薄膜或透明板夾持並保持，為了向侵入探針固定部98分注反應液，與侵入探針固定部96b相通的入口100具有開口。向該入口100分注的反應液，通過流入到侵入探針固定部96b中並擴散，與在侵入探針固定部96b的各位置固定的探針發生反應。
在圖16～圖19所示的檢驗試劑盒中，收容部88、90、92由柔軟的材料形成，利用基板表面的槽108、110連接收容部88、90、92之間。在使用前的狀態下，收容部88、90、92由薄片或板密封，以使收容部88、90、92彼此獨立。另外，在設於基板表面的侵入探針固定部94b、94c、96b、98與侵入反應試劑收容部92之間的基板表面，還形成有槽104。
使用時剝離薄片或板，向稀釋液收容部88分注樣品。此後，如果將該檢驗試劑盒安裝於基因多態性檢測裝置，則液體可以利用槽108、110在收容部88、90、92之間流動，液體可以通過槽104，從侵入反應試劑收容部92向侵入探針固定部94b、94c、96b、98流動。
在基因多態性檢測裝置內的收容部88、90、92之間的送液、以及從侵入反應試劑收容部92向侵入探針固定部94b、94c、96b、98的送液，通過依次機械地擠壓、擠破收容部88、90、92來進行。即，如果擠破稀釋液收容部88，則稀釋液收容部88的液體通過槽108，向PCR反應液收容部90移動。接著，如果擠破PCR反應液收容部90，則PCR反應液收容部90的液體通過槽110，向侵入反應試劑收容部92移動。進而，如果擠破侵入反應試劑收容部92，則侵入反應試劑收容部92的液體通過槽104，向侵入探針固定部94b、94c、96b、98移動，發生侵入反應。
圖16的檢驗試劑盒具備與圖12相同的流道形狀的侵入探針固定部94b。在侵入探針固定部94b的頂端即收容部88、90、92的相反側的一端設有出口106，使用時通過剝離密封用的薄片或板，該出口露出開口，從侵入反應試劑收容部92送液，通過了侵入探針固定部94b的多餘的液體從該出口106排出。
圖17的檢驗試劑盒具備與圖13相同的室型的侵入探針固定部94c。該檢驗試劑盒也在侵入探針固定部94c的頂端即收容部88、90、92的相反側的一端設有出口106，在使用時通過剝離密封用的薄片或板，該出口露出開口，從侵入反應試劑收容部92送液，通過了侵入探針固定部94c的多餘的液體從該出口106排出。
圖18的檢驗試劑盒具備與圖14同樣的在濾紙等低自發螢光性的材料的多個位置固定有不同侵入探針的侵入探針固定部98。侵入探針固定部98在基板表面露出。
圖19的檢驗試劑盒具備與圖15同樣的在濾紙等低自發螢光性的材料的多個位置固定有不同侵入探針的侵入探針固定部98。該侵入探針固定部98由透明薄膜或透明板夾持並保持。
在圖18、19的檢驗試劑盒中的侵入探針固定部98，由於具備吸溼力大的紙等材料，所以可以由該材料吸收從侵入反應試劑收容部92送液的液體。
圖20是概要地表示簡易型自動基因多態性檢測裝置的實施例的圖，該基因多態性檢測裝置，使用圖10～圖19所示的檢驗試劑盒122，檢測SNP。
該基因多態性檢測裝置120具備安裝有多個檢驗試劑盒122的安裝部，檢驗試劑盒122在樣品被分注至稀釋液收容部的狀態下被安裝。設置有可以移動的噴嘴124，該噴嘴124向安裝於安裝部的檢驗試劑盒122進行送液。
雖在圖中未圖示，但為了在檢驗試劑盒122的PCR反應液收容部90內，在PCR反應液與生物體樣品的反應液內擴增基因組DNA，而具備控制該反應液的溫度的擴增部；為了使在該擴增部擴增的基因組DNA和分型試劑的反應液與探針固定部94、94a、94b、94c、96b、98的探針發生反應，而具備控制該反應液的溫度的分型反應部。
126是作為螢光檢測裝置的測光部，為了檢測出從檢驗試劑盒122的侵入探針固定部產生的螢光，可以設置成能在多個檢驗試劑盒122之間移動的同時進行螢光檢測且可以移動。根據檢測的螢光判斷的分型結果顯示在顯示器128。
以上的實施例是基因多態性檢測裝置，但還可以作為疾病發病率或給予藥劑的種類與效果及副作用等的診斷裝置。在這種情況下，在這些基因多態性檢測裝置中設置有針對特定的SNP或多個SNP的組合而存儲疾病發病率或給予藥劑的種類與效果及副作用等的診斷值的資料庫，或者連接外部的此類資料庫。在連接外部的資料庫的情況下，可以用專用的線路連接，或者也可以藉助通用的通信線路連接。在作為診斷裝置的情況下，基於利用本發明的基因多態性檢測裝置檢測的SNP結果，從資料庫讀取診斷值，在顯示裝置顯示。
產業上的可利用性本發明在基因分析的研究或臨床領域，可以檢測以人為代表的動物或植物的基因組DNA的多態性特別是SNP(單鹼基多態性)，進而除了可以用於使用該結果進行疾病發病率的診斷、或給予藥劑的種類與效果及副作用之間的關係等的診斷以外，還可以用於動物或植物的品種判斷、感染病診斷(感染菌的型判斷)等。
權利要求
1.一種基因多態性檢測方法，其中，包括使未實施核酸提取操作的生物體樣品，直接作用於含有將多個多態性位點分別夾在中間並結合的多個引物的基因擴增反應液，使基因組DNA擴增的擴增工序；和使對應所述多個多態性位點配製而成的侵入試劑作用於在所述擴增工序中擴增的基因組DNA，辨別所述多個多態性位點的鹼基的分型工序。
2.根據權利要求1所述的基因多態性檢測方法，其中，成為檢測對象的多態性，是單鹼基多態性。
3.根據權利要求1或2所述的基因多態性檢測方法，其中，所述擴增工序使用PCR法。
4.根據權利要求1或2所述的基因多態性檢測方法，其中，所述分型工序使用侵入法或Taqman PCR法。
5.一種診斷方法，其中，準備針對特定的多態性或多個多態性的組合的診斷值，作為資料庫，基於利用權利要求1所述的方法檢測出的多態性的結果，從所述資料庫讀取診斷值。
6.一種基因多態性檢測裝置，其中，具備設置未實施核酸提取操作的生物體樣品的樣品設置部；保持含有將多個多態性位點分別夾在中間並結合的多個引物的基因擴增反應液的擴增試劑保持部；保持對應所述多個多態性位點配製而成的分型試劑的分型試劑保持部；為了使添加到所述基因擴增反應液中的所述生物體樣品在反應液內擴增基因組DNA而控制該反應液的溫度的擴增部；具有對分別對應所述多個多態性位點而發出螢光的探針進行保持的探針固定部，為了使在所述擴增部擴增的基因組DNA和所述分型試劑的反應液與各探針發生反應而控制反應液的溫度的分型反應部；可以移動到所述樣品設置部、所述擴增試劑保持部、所述分型試劑保持部、所述擴增部及所述分型反應部的位置，將樣品、擴增試劑、分型試劑及樣品與這些試劑的反應液分注到規定位置的分注裝置；向所述分型反應部的各探針固定部照射激發光來檢測螢光的螢光檢測裝置；和對所述擴增部及分型反應部的溫度控制、所述分注裝置的分注動作以及所述螢光檢測裝置的檢測動作進行控制的控制部。
7.根據權利要求6所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述分型反應部在每個所述探針固定部具備上部開口並供給反應液的凹部。
8.根據權利要求7所述的基因多態性檢測裝置，其中，進一步具有保持防止反應液蒸發的油的油保持部，所述分注裝置在向所述凹部分注反應液之前或之後，可以向所述凹部分注所述油。
9.根據權利要求6所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述分型反應部在每個所述探針固定部具備供給反應液的流道。
10.根據權利要求9所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述流道在每個所述探針固定部具備反應液的供給用入口和排出用出口。
11.根據權利要求9所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述流道與反應液的供給用共用入口和排出用共用出口連接。
12.根據權利要求9～11中任意一項所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述探針固定部為在所述流道內一部分變寬的部分。
13.根據權利要求6所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述分型反應部具備在內部形成有多個所述探針固定部的流道。
14.根據權利要求6～13中任意一項所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述樣品設置部與所述擴增部共用溫度調節部。
15.一種檢驗試劑盒，其中，其是如下所述的結構形成為一體的試劑盒，這些結構包括收容含有分別將多個多態性位點夾在中間並結合的多個引物的基因擴增反應液的擴增試劑收容部；收容有對應所述多個多態性位點配製而成的分型試劑的分型試劑收容部；以及將分別對應所述多個多態性位點並發出螢光的探針個別保持的多個探針固定部。
16.根據權利要求15所述的檢驗試劑盒，其中，進一步將收容稀釋樣品的稀釋液的稀釋液收容部形成為一體
17.根據權利要求15或16所述的檢驗試劑盒，其中，所述各收容部由軟質材料形成。
18.一種基因多態性檢測裝置，其中，具備安裝權利要求15～17中任意一項所述的檢驗試劑盒的檢驗試劑盒安裝部；為了在所述擴增試劑收容部內、在所述基因擴增反應液與生物體樣品的反應液內使基因組DNA擴增，而控制該反應液的溫度的擴增部；為了使在所述擴增部擴增的基因組DNA和所述分型試劑的反應液與所述探針固定部的探針發生反應而控制該反應液的溫度的分型反應部；從所述擴增試劑收容部向所述分型試劑收容部移送液體及從所述分型試劑收容部向所述各探針固定部移送液體的送液裝置；向所述各探針固定部照射激發光來檢測螢光的螢光檢測裝置；和對所述擴增部及分型反應部的溫度控制、所述送液裝置的送液動作以及所述螢光檢測裝置的檢測動作進行控制的控制部。
19.根據權利要求18所述的基因多態性檢測裝置，其中，所述送液裝置是被設置成具備分注噴嘴並可以向必要的場所移動的分注裝置。
20.根據權利要求18所述的基因多態性檢測裝置，其中，作為所述檢驗試劑盒，使用權利要求17所述的檢驗試劑盒，所述送液裝置是通過擠壓所述各收容部並使其變形來送液的擠壓裝置。
21.一種診斷裝置，其中，具備權利要求6～14及18～20中任意一項所述的基因多態性檢測裝置；存儲關於特定的多態性或多個多態性的組合的診斷值的資料庫；基於利用所述基因多態性檢測裝置檢測出的多態性結果，從所述資料庫讀取診斷值並進行顯示的顯示裝置。
全文摘要
本發明提供一種可以從樣品製備階段開始自動進行多SNP位點的分型(typing)的基因多態性檢測方法。其特徵在於，按照規定的溫度循環，使樣品(2)與PCR反應液(4)的混合液進行PCR反應。在PCR反應結束後，添加侵入試劑(6)。隨後，已添加侵入試劑(6)的反應液被添加到分型反應部的探針固定部(8)，使其反應。分別對應多SNP位點的各位點、發出螢光的侵入探針，被個別保持在探針固定部(8)的各位點，反應液與侵入探針反應，只要與該侵入探針對應的SNP存在，就可以發出螢光。
文檔編號G01N33/53GK101061223SQ20058003942
公開日2007年10月24日 申請日期2005年11月18日 優先權日2004年11月19日
發明者中村祐輔, 田中敏博, 大西洋三, 花房信博, 緒方是嗣, 四方田聰 申請人:株式會社島津製作所, 獨立行政法人理化學研究所