一種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的混合菌劑及其製備方法

2023-05-05 06:45:56 1

一種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的混合菌劑及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的混合菌劑及其製備方法。該菌劑的活性成分為克雷伯氏菌、氣單胞菌、叢毛單胞菌、寡養單胞菌、不動桿菌、微桿菌和希瓦氏菌的一株或幾株菌的組合，每株菌10-100份。本發明的菌劑可以應用於地表水、地下水、水源水和微汙染水中可生物降解有機物的測定，以及用於預測微生物汙染，在環境水質監測中具有重要的作用。
【專利說明】-種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的 混合菌劑及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的混合菌劑 及其製備方法，特別涉及該混合菌劑作為測試菌劑用於測定水源水和飲用水中的可生物降 解有機物，能夠對水質微生物汙染起到監測作用，屬於微生物學和環境監測領域。

【背景技術】
[0002] 近年來，由於汙染事故頻發和水源水的常態汙染，我國的水源水和飲用水安全正 面臨著嚴峻挑戰。在此形勢下，水源水和飲用水微生物汙染的風險預警就顯得尤為重要。當 水體中可供微生物利用的有機物超過一定濃度時，就會導致微生物過度生長，從而引發微 生物汙染事故。
[0003] 水源水和飲用水中有機物種類繁多，其中能夠被異養菌無機化的部分稱為可生物 降解有機物。可生物降解有機物與異養細菌在水體中的生長密切相關，是研究水源水和飲 用水生物穩定性所要關注的重要的指標。目前，國內外對可生物降解有機物的測定主要有 兩個方法：一類是在待測水樣中接入特殊細菌，通過平板計數法，測定結果被稱為可同化有 機碳（A0C);另一類方法通過測定水樣培養前後溶解性有機碳（D0C)的差值來確定水樣中可 生物降解溶解性有機碳（BD0C)的值。這兩種方法從接種液的準備到整個測定過程的完成， 需要花費20-30天，耗時較長，使得測定結果缺乏時效性，對水質微生物汙染爆發的預警作 用不大。
[0004] 因此，很有必要開發一種新的測定方法和相應的菌劑替代現有的測定方法，提高 測定結果的時效性，加強對水質微生物汙染的監測。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的 混合菌劑，適用於對地表水、地下水、水源水和微汙染水中含有的可生物降解有機物進行測 定，進而預警水源水和飲用水微生物汙染事故爆發的可能性。
[0006] 本發明提供了 一種混合菌劑，該菌劑的活性成分為克雷伯氏菌（ sp.)、氣單胞菌drofflmas sp.)、叢毛單胞菌sp.)、寡養單胞菌 (Stenotrophomonas sp. )> ^ If |if iAcinetobacter sp. ^ |if iExiguobacterium sp.)和希瓦氏菌sp.)的一株或幾株細菌的組合，每株細菌10-100份。
[0007] 該發明的混合菌劑的所有菌株均是由發明人將某生活汙水處理廠二次沉澱池 的活性汙泥通過馴化培養後分離篩選獲得的。這些菌株的具體信息如下：克雷伯氏菌 sp.)的保藏號為CCTCC M 2014600,氣單胞菌（Jerofflmas sp.)的保藏號為 CCTCC M 2014601，叢毛單胞菌（Cbfflaffioaas sp.)的保藏號為CCTCC M 2014602,寡養單胞菌 sp.)的保藏號為 CCTCC M 2014603,不動桿菌（JcifletoAacter sp.)的 保藏號為 CCTCC M 2014604,微桿菌應 sp.)的保藏號為 CCTCC M 2014605， 希瓦氏菌sp.)的保藏號為 CCTCC M 2014606。
[0008] 該混合菌劑可用於快速測定水樣中的可生物降解有機物濃度，其檢測的基本原 理：通過微生物利用水體中的可生物降解有機物時消耗的溶解氧濃度與可生物降解有機物 濃度成正相關的關係。通過測定已知濃度的標準碳溶液(常用乙酸碳溶液)加入一定量微生 物後溶解氧濃度的變化，就可以繪製出溶解氧消耗速率與乙酸碳濃度相關的標準曲線。再 將待測水樣加入同等量微生物後的溶解氧消耗速率代入標準曲線擬合的方程，就可以計算 出待測水樣的可生物降解有機物濃度。
[0009] 該混合菌劑製備的簡要過程如下：（1)分別培養每株細菌；（2)離心收集菌體； (3)反覆離心清洗菌體；（4)按一定比例混合菌體；（5)按比例加入凍幹保護劑；（6)冷凍幹 燥處理（7)低溫保存混合凍幹菌劑。
[0010] 該混合菌劑未使用時，可保存於4°C或-20°c的低溫冰箱內。使用時，將其取出，力口 入一定體積無碳水配製的磷酸鹽緩衝溶液，置於25-28°C的恆溫箱1-2小時，使菌體復甦後 使用。
[0011] 本發明所述的混合菌劑具有以下特定優點：（1)菌種種類較多，可廣泛地利用天 然水體中所含的可生物降解有機物，因此可用於測定地表水、地下水、水源水和微汙染水中 可生物降解有機物的濃度（2)該混合菌劑可直接用於測定水樣中可生物降解有機物濃度， 耗時短，大大提高檢測結果的時效性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1，標準曲線及擬合方程： 圖中，是標準碳溶液（乙酸碳溶液）加入一定量微生物後的溶解氧消耗速率（V)和乙酸 碳濃度（S)的標準曲線，及由標準曲線擬合的方程。 實施例
[0013] 以下結合具體的實施例對本發明的混合菌劑的應用，進行進一步詳細描述。
[0014] 實驗步驟： 1.混合凍幹菌劑的製備： 從克雷伯氏菌（We/wid/a sp.)、氣單胞菌（Jerofflmas sp.)、叢毛單胞菌（Cbffiaffioaas sp.)、寡養單胞菌（sp.)、不動桿菌（Jci/? <9 (oAac ter sp.)、微桿菌 講oAacteria? sp.)和希瓦氏菌（sp.)的斜面上各取一環，分別接種在LB 培養液中，28°C培養15小時後，按等體積將7種菌體的培養液混合。通過離心收集菌體，並 使用超純水配製的磷酸鹽緩衝溶液重懸菌體，離心，重複6遍，徹底清洗盡殘留的培養液。 將離心的菌體與保護劑按體積比1:3混合，通過冷凍乾燥處理製成凍幹菌劑。將製備的凍 幹菌劑，存於4°C備用。保護劑配方為10ml/L甘油，lg/L L-穀氨酸，lg/L抗壞血酸。
[0015] 2.測定水樣可生物降解有機物的過程： (1) 復甦菌體：將凍幹菌劑加入凍幹前等體積3mM磷酸鹽緩衝溶液，置於28°C恆溫箱2 小時，使菌體復甦活化； (2) 配製 300mM 磷酸緩衝液（PH=7. 2):稱取 700mg K2HP04,10mg MgS04 ? 7H20,100mg (NH4)2S04, lOmg NaCl和lOOug FeS04,力口超純水定容於1L容量瓶； (3) 配製礦物質鹽溶液：稱取171 mg K2HP04,767 mg NH4C1和1.44 g KN03，加超純水 定容於1L容量瓶； (4) 配製標準乙酸碳溶液：配製lg C/L乙酸碳母液，加入礦物質鹽溶液(按0. 5%體積 力口)和磷酸緩衝溶液(按1%體積加)並稀釋出系列標準乙酸碳溶液，濃度分別為〇 U g C/L， 20iig C/L，40 iig C/L，60 iig C/L，80 iig C/L，100 iig C/L。巴氏消毒，冷卻後備用； (5) 準備待測水樣：按傳統AOC檢測方法取水樣、過濾，用超純水將水樣進行不同梯度 的稀釋，稀釋的同時加入礦物質鹽溶液(按〇. 5%體積加)和磷酸緩衝溶液(按1%體積加)，以 得到與體系中生物量、溶解氧等相適宜的有機物量，巴氏消毒，冷卻後備用； (6) 曝氣：將標準樣和待測水樣，使用無菌空氣曝氣30min-lh，使水樣的溶解氧濃度達 到飽和； (7) 溶解氧測定：將曝氣後的標準乙酸碳溶液和待測水樣，依次分別加入10%體積的復 蘇菌液，使用溶解氧測定儀每隔10 s記錄一次溶解氧值，連續lOmin ; (8) 分析數據：根據記錄的數據，求出乙酸碳溶液的溶解氧消耗速率（V)(見表1)，繪 制溶解氧消耗速率（V)和乙酸碳濃度（S)的標準曲線(見圖1)，將待測水樣溶解氧消耗速率 (V)(見表2)代入標準曲線的擬合方程，從而求出待測水樣的可生物降解有機物濃度(見表 3)。
[0016] 表1標準樣反應速率

【權利要求】
1. 一種可應用於水中可生物降解有機物和微生物汙染監測的混合菌劑，其特徵在於， 該菌劑的活性成分為克雷伯氏菌sp.)、氣單胞菌Weroffioftas sp.)、叢毛單 胞菌 sp.)、寡養單胞菌 6%(9/7〇tro/7Ao?(mas sp.)、不動桿菌 sp.)、微桿菌r&rigwoAacteritt? sp.)和希瓦氏菌6SXe?a/76^a sp.)的一株或幾株菌的組 合，每株細菌10-100份。
2. 根據權利要求1所述的混合菌劑，其特徵在，所述克雷伯氏菌（sp.) 的保藏號為CCTCC M 2014600，所述氣單胞菌sp.)的保藏號為CCTCC M 2014601，所述叢毛單胞菌sp.)的保藏號為CCTCC M 2014602,所述寡養單胞 菌（5^<9/7〇tro/7A〇fflmas sp.)的保藏號為 CCTCC M 2014603,所述不動桿菌（Jci/?<9(oAacter sp.)的保藏號為CCTCC M 2014604,所述微桿菌（位i濟/〇如cteri應sp.)的保藏號為CCTCC M 2014605,所述希瓦氏菌sp.)的保藏號為 CCTCC M 2014606。
3. 根據權利要求1或2所述的混合菌劑，其特徵在於：所述菌劑為固態的凍幹菌劑。
4. 根據權利要求3所述的混合菌劑，製備方法是克雷伯氏菌（Z/e/wieWa sp.)、氣 單胞菌sp.)、叢毛單胞菌（sp.)、寡養單胞菌 sp.)、不動桿菌（sp.)、微桿菌（iki講oAacteria? sp.)和希瓦氏菌 sp.)的一株或幾株細菌的組合接種於液態培養液中，每株取10-100份，在 25-30°C下，培養15-24小時，通過離心收集菌體，重複使用無碳水配製的磷酸鹽緩衝溶液 重懸菌體，離心處理，徹底去除殘留的培養液後，將菌體與保護劑一定比例混合，經過冷凍 乾燥處理後製成凍幹菌劑。
5. 根據權利要求5所述的混合菌劑，其特徵在於：菌體和保護劑混合後，菌體佔總體積 的比例為25%-50%。
6. 根據權利要求5所述的混合菌劑，其特徵在於：所述保護劑的主要成分為5-20ml/L 甘油，0. 2-lg/L L-穀氨酸，0. 2-lg/L抗壞血酸。
【文檔編號】C12R1/01GK104450587SQ201410801866
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】於鑫, 李晶晶, 葉成松, 鞏松, 李帥 申請人:中國科學院城市環境研究所