一種豬糞樣總dna的提取方法
2023-05-05 15:26:11
專利名稱：一種豬糞樣總dna的提取方法
一種豬糞樣總DNA的提取方法
技術領域：
本發明屬於微生物學和分子生物學技術領域，具體涉及從豬糞便樣品中提取總DNA的 方法。 [背景技術]
哺乳動物腸道中存在約30個屬500多種不同的細菌，約lxlO"個活細菌，形成了複雜 而動態平衡的微生態系統，對宿主營養物質的消化、吸收及免疫機制激活、生長發育等都起 著十分重要的作用。若這種微生態平衡失調，則動物機體正常的生理功能就會發生紊亂，導 致疾病的發生、流行，對畜牧養殖業尤其是規模化養殖產生了極大的潛在威脅。因而，近年 來對腸道微生物區繫結構及其多樣性研究成為當前的熱點，但由於腸道的特殊生存環境，使 得腸道中有60%-80%的微生物是目前無法用傳統的分離培養技術進行研究，從而阻礙了人 們對腸道微生物結構及其多樣性的客觀認識。
隨著現代分子生物學技術的發展及其在微生態學研究中的應用，人們能避開了傳統菌的 群分離培養過程，直接從DNA水平上對這些腸道菌群進行相關研究，因此，獲得高質量、 具有代表性的腸道菌群總DNA就成為這些研究的前提和重要技術手段。但由於糞便不但組 成成分複雜(含有多聚糖、膽酸、膽鹽、膽色素等PCR的強抑制物)，而且糞便中細菌類 型數目繁多，而不同細菌因其各自獨特的細胞壁成分和結構，又對不同的提取方法的敏感程 度有所差異，從而導致了不同方法的提取效率不盡相同，進而使得腸道菌群多樣性分析結果 不盡如人意，甚至造成偏差(參見劉健華等人.腸道菌群多樣性梯度凝膠電泳分析法的建 立，中國獸醫科技，2005， 35 (6): 445-449)。目前糞便樣品總DNA並沒有標準、統--的 提取方法，因而，選擇較好的DNA提取方法對腸道微生態研究非常關鍵。
目前，國內外常用的DNA提取方法主要包括機械法，如矽珠法、凍融法等(參見-SchuurmanT， Richard de Boer， Rachfel Patty， etal. Journal of Microbiological Methods, 2007， 71: 238-245;劉健華等人.腸道菌群多樣性梯度凝膠電泳分析法的建立，中國獸醫科技，2005， 35( 6): 445-449);化學法，如SDS法、苯酚法等(參見Chris M， Denys B， Dietmar S. Analytical Biochemistry ， 2006， 348: 160~162; BurtscherMM， K611nerKE， SommerR， etal. Journal of Microbiological Methods, 2006， 67: 281-293);酶法如溶菌酶、蛋白酶K等(參見Joyce MS， Vance JM.， Bryan AW， etal. Journal of Microbiological Methods, 1999， 36: 167—179) 和商業試劑盒法，如FastDNA kit， Bio 101; Nucleospin C+T kit, Macherey-Nagal; Quantum Prep Aquapure Genomic DNA isolation kit, Bio-Rad; QIAamp DNA stool mini kit， Qiagen等(參見Alexandra LM， Michelle J， Anthony R.B. Journal of MicrobiologicalMethods, 2002， 50: 131— 139; PluskeJR， Durmic Z， Payne HG et al. Livestock Science, 2007， 108: 113-116)。這幾種類型的DNA提取方法中，機械法、化學法及酶或其組合方法 是實驗室常規提取方法。 一般都是先用蛋白酶K、 SDS、溶菌酶、超聲波或反覆凍融來裂 解細胞釋放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化矽等進行DNA的抽提，最後無水乙醇沉 澱。這幾種常規的提取方法的優點是原理清楚，便於分析及查找實驗中出現的問題，而 .不足在於所提取的DNA純度不高或者得率較低，常含有大量的PCR抑制物，需要進一步 純化處理才能用於後續的實驗操作，如Savill等(參見SavillMG， Murray S R， ScholesP， etal. Journal of Microbiological Methods, 2001， 47(3) : 355-368)用蛋白酶K裂解糞便 的同時還另外用十六垸基三甲基溴化銨來除去PCR反應抑制物，並且還用酚-氯仿進行了 多次的抽提才得到較高純度的總DNA; Ernest等(參見Ernest HB， Penedo MC， May BP， etal . Molecular Ecology, 2000， 9: 433-441)在用蛋白酶K提取糞便樣品總DNA後， 再以聚丙烯醯胺葡聚糖柱子來純化所得到的總DNA。試劑盒法雖然操作簡單，但所提總 DNA濃度、得率低，價格較昂貴、缺乏實驗室通用性，不適於用於大規模糞便樣品總DNA 提取。另外由於專利等其它原因，試劑盒中具體成分及其含量不是很清楚，如果發生操作 失敗，很難分析找出實驗失敗原因(參見哩申劍，張寶讓，魏華等.三種糞便總DNA提 取方法的比較.中國微生態學雜誌，2008， 20 (1): 28-35)。
針對上述問題，國內外許多研究者提出了各種不同的提取糞便總DNA的方法。如Walsh 等(參見:Walsh PS， MetzgerDA， Higuchi R. Bio Techniques, 1991， 10(4): 506-513) 利用Chelex-100煮沸法成功地提取了人類DNA，該方法簡便易行，其還能利用Chelex-lOO 鹼性多價金屬離子螯合劑能與多種金屬離子(包括維持DNA酶活性所必需的金屬離子)結 合的能力來有效地抑制DNA酶的活性，防止DNA進一步降解；但在提取過程中卻會導致 DNA分子的變性；而目前廣泛應用的磁珠吸附法雖無需使用蛋白酶或有機萃取試劑，就能 直接利用磁珠吸附來DNA，但從磁珠上洗脫DNA時，會損失大量的DNA，導致DNA產量相 當地低(參見FlagstadO， Roed K， Stacy JE， etal. Mol Ecol， 1999， 8 (5): 879-883)。 另外，楊德君等(參見楊德君，吳襟，劉毅等. 一種快速提取腸道微生物總DNA的方法， 中國微生態學雜誌，2006 ， 18(2): 91-93)利用玻璃濾器與試劑盒法相結合來提取兔糞便樣 品中的DNA，該方法所提取DNA純度很高，但卻由於動物糞便組成成分相當複雜，要針對 不同動物糞便選擇出合適孔徑大小的玻璃濾器卻非常地困難，因此，該方法很難推廣，並因
要用到試劑盒，而使提取成本較高，不適於大規模實驗提取。
綜上所述，常規的方法及其改良方法，獲得糞便總DNA需要進一步純化處理才能用於 後續實驗操作，耗時較長，不利於大規模實驗提取。而近年來發展的新方法雖然能克服常規方法的缺點，提高了所得DNA的純度，但卻帶來了如DNA變性，操作繁瑣等問題。因此， 需要找到一種新得能快速、高質、高效、廉價及無害提取具有代表性的腸道菌群總DNA的 方法。 [發明內容]
本發明目的在於克服現有方法存在的缺陷，建立一種操作簡單、快速、高效、高質且價 格經濟能適於實驗室大規模提取的新方法。本發明主要包括糞便樣品的預處理、樣品DNA 提取、PCR及電泳。以採集新鮮糞便樣品或凍存的糞便樣品為材料，先用PBS緩衝液、多 聚甲醛溶液、無水乙醇等對糞便樣品進行預處理，以獲得糞便樣品菌懸液，再以CTAB溶 液、p-巰基乙醇、PVP-40等共同裂解細胞釋放DNA。該發明己進行了廣泛的比較研究，通 過分析所得糞便總DNA的濃度、純度、得率及16SrDNA全長擴增結果表朋，本發明所得 的DNA片段較完整、大小約為23kb，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴 增的模板，以及糞便微生態學等方面的研究。
本發明通過以下技術方案實現
本申請人發明了一種新的糞樣總DNA提取方法，該方法以採集新鮮糞便樣品或凍存的 糞便樣品為材料，先以PBS緩衝液、多聚甲醛溶液及無水乙醇等對糞便樣品進行預處理， 獲得菌體沉澱後，再採用化學方法裂解細胞釋放DNA(即十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、 P-巰基乙醇、PVP-40等聯用)。所得總DNA無需純化處理即可進行後續實驗。
本發明的具體步驟如下
(1) 稱取適量的糞便樣於一無菌的50ml離心管A中，加入10~20 ml PBS緩衝液及無菌 的玻璃珠一起渦漩混勻；
(2) 在200~400xg下離心2~8min後，儘可能多的取出上層懸液於另一無菌的50ml離心 管B中；
(3) 將步驟(2)所得的沉澱再用適量的PBS緩衝液重洗一次，並於200~400xg下離心 2~8min，取出上層懸液合併於離心管B中；
(4) 加適量體積一定濃度的多聚甲醛溶液於離心管B中，並將其置於4'C孵育l~2h;
(5) 然後，6000~10000xg離心5~10min，棄上清，所得菌體沉澱用適量的PBS緩衝液 及無水乙醇重懸，混勻後，於-2(TC下保存30min以上；
(6) 在6000~10000xg離心5~10min後，棄上清，再用適量的PBS緩衝液對所得菌體沉 澱重新洗滌，之後再離心，棄上清，收集菌體沉澱；
(7) 所得的菌體沉澱用適量的TE緩衝液重懸，混勻後即得經預處理的糞便樣品菌懸液;
(8) 取適量上述預處理的糞便樣品菌懸液於1.5或2ml離心管中，12， OOOrpm離心
65-10min，棄上清；
(9) 加入0.8 1.5ml經60 7(TC預熱的裂解液及適量的1%~3%(v/v) p-巰基乙醇，混勻後 60-70'C水浴0.5~lh，每隔幾分鐘取出搖勻一次；
(10) 12， OOOrpm離心5min，離心後，移出上清於另一 1.5或2ml離心管中，棄沉澱；
(11) 向上清中加入等體積的氯仿異戊醇(24: 1)，混勻後，10， 000rpm離心10min， 取上清至另一 1.5或2ml離心管中；
(12) 加入等體積的氯仿，混勻後於IO， OOOrpm離心10min，再取上清；
(13) 向上清中加入0.1倍體積的3M NaAC，混勻後再加入2倍體積預冷的無水乙醇， 充分混勻後-20。C放置30 min以上；
(14) 12， OOOrpm離心5min，棄上清，所得DNA沉澱在室溫下晾乾；
(15) 用75免的乙醇對DNA沉澱進行洗滌，乾燥後沉澱溶於lOOpilTE中，加RNaseA 至終濃度為20 [xg/ml， 37。C消化30min，之後於-2(TC保存，備用；
(16) 以步驟(15)所得的DNA為模板，以16S rDNA特異性引物PO: 5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，和1492r: 5，-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3，
(參見； Di Cello F, Bevivino A, Chiarini L， Fani R， Paffetti D， Tabacchioni S， and Dalmastri C. Applied and Environmental Microbiology, 1997， 63(11》4485-4493; Hayashi H， Sakamoto M， BennoY.. Microbiol Immunol, 2002， 46(8): 535-548)擴增出糞便 16S rDNA特異性條帶並進行電泳檢測。 [
]
圖1:本發明提取的DNA電泳檢測圖。圖中編號1-8為重複8次平行提取的糞便總DNA， 上樣量為5jxl。其中M為人DNA-HindIII marker ，分子量標準從上至下依次為23kb， 94kb， 6.5kb， 4.3kb， 2.3kb， 2.0kb (注lkb=1000bp， bp為鹼基對)。
圖2: 3種不同方法提取樣品糞便總DNA的電泳檢測圖。圖中編號l-3; 4-6; 7-9依次 分別為本發明方法，常規方法和試劑盒方法提取DNA電泳圖，上樣量為8jxl。其中M為XDNA -HindIII marker ，分子量標準從上至下依次為23kb， 94kb， 6.5kb， 4.3kb， 2.3kb， 2.0kb (注: lkb=1000bp， bp為鹼基對)。
圖3:以3種不同方法提取糞便總DNA為模板進行PCR擴增產物的電泳檢測圖。1-3; 4-6; 7-9分別依次為本發明方法，常規方法和試劑盒法的16Sr DNA的PCR擴增圖。上樣 量為8 ja1。其中M為DNAMarkerIII，分子量標準從上至下依次為4500bp， 3000bp， 2000bp， 1200bp， 800bp， 500bp, 200bp (bp:鹼基對)；C為陰性對照(即不加DNA模板)。本發明的積極效果(表l):
表l:本發明方法與常規提取方法、試劑盒提取方法實施效果比較_
方 法_優 點_缺 點
得到的總DNA片段相對較大； 費時，所提取的總DNA
常規方法 濃度相對較高；格價較便宜。 純度不高，需純化；提取時要
用到強腐蝕性酚等毒性有
_機溶劑。__
簡單、省時(約2小時)方便， 價格昂貴，做1次需36
試劑盒法 所提DNA純度較高，不使用苯酚元，提取DNA濃度及得率低，
等有毒有機溶劑。 量少，不適宜實驗大規模操
__^_
簡單、方便，提取的總DNA 費時比試劑盒要長一些， 本發明方法 純度及產量均高於常規方法和試約3個小時
劑盒法，且價格便宜，做l次不超
_^_過3元，未使用強腐蝕有機溶劑酚。_
實施例l:本發明方法提取豬糞便樣品總DNA。
實驗所用樣品為採集的榮昌豬的糞便，所採集的糞便樣品於-2(TC下保存，備用。具體 步驟如下
(1) 稱取適量的糞便樣於一無菌的50ml離心管A中，加入10~20 ml PBS緩衝液及無菌 的玻璃珠一起渦漩混勻；
(2) 在200~400xg下離心2~8min後，儘可能多的取出上層懸液於另一無菌的50ml離心 管B中；
(3) 將步驟(2)所得的沉澱再用適量的PBS緩衝液重洗一次，並於200~400xg下離心 2~8min，取出上層懸液合併於離心管B中；
(4) 加適量體積一定濃度的多聚甲醛溶液於離心管B中，並將其置於4'C孵育l 2h;
(5) 然後，6000~10000xg離心5~10min，棄上清，所得菌體沉澱用適量的PBS緩衝液 及無水乙醇重懸，混勻後，於-2(TC下保存30min以上；
(6) 在6000~10000xg離心5~10min後，棄上清，再用適量的PBS緩衝液對所得菌體沉 澱重新洗滌，之後再離心，棄上清，收集菌體沉澱；
(7) 所得的菌體沉澱用適量的TE緩衝液重懸，混勻後即得經預處理的糞便樣品菌懸液；(8) 取適量上述預處理的糞便樣品菌懸液於1.5或2ml離心管中，12， 000rpm離心 5~10min，棄上清；
(9) 加入0.8 1.5ml經6(K7(TC預熱的裂解液及適量的1%~3%(v/v) p-巰基乙醇，混勻後 60-70'C水浴0.5~lh，每隔幾分鐘取出搖勻一次；
(10) 12， OOOrpm離心5min，離心後，移出上清於另一 1.5或2ml離心管中，棄沉澱；
(11) 向上清中加入等體積的氯仿異戊醇(24: 1)，混勻後，10， 000rpm離心10min， 取上清至另一 1.5或2ml離心管中；
(12) 加入等體積的氯仿，混勻後於IO， OOOrpm離心10min，再取上清；
(13) 向上清中加入0.1倍體積的3M NaAC，混勻後再加入2倍體積預冷的無水乙醇， 充分混勻後-20'C放置30min以上；
(14) 12， OOOrpm離心5min，棄上清，所得DNA沉澱在室溫下晾乾；
(15) 用75%的乙醇對DNA沉澱進行洗漆，乾燥後沉澱溶於100nl TE中，加RNase A 至終濃度為20 fxg/ml， 37。C消化30min，之後於-20。C保存，備用； 申請人:用本發明對同一豬糞便樣品進行了多達8次的重複提取實驗，如圖1所示，結果
表明本^;明方法的多次重複提取的實驗效果基本一致，這說明該發明方法非常地穩定，適用
於豬糞便總DNA的大規模提取。
實施例2:本發明與常規方法、試劑盒法提取糞便總DNA的比較。 為了比較本發明與現有的常規方法和商業試劑盒提取法的平行效果，申請人同時進行了 利用本發明方法、常規方法和試劑盒法提取的比較實驗，利用常規法從糞便中提取總DNA: 按照Rousselon等(參見RousselonN， Delgen&JP， GodonJJ. J Microbiol Methods, 2004， 59(1): 15-22)報導的方法進行。利用試劑盒法從糞便中提取總DNA:所用試劑盒購自QiaGen 公司，試劑盒的商品名稱為QIAamp DNAStool Mini Kit。上述兩種方法使用的糞便樣品同 本發明相同，所提取的DNA溶於100ml的TE緩衝液中。
採用本發明方法，常規法和試劑盒法分別從糞便中提取的總DNA結果有較大差別，如 圖2所示，本發明方法所提得的總DNA產量高，是常規方法的23倍、是試劑盒方法的17 倍。
實施例3:對實施例2提取的DNA進行16S rDNA的PCR擴增檢測。
應用本實施例2提取的DNA作為模板，以設計的引物正向引物P0為 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 禾B 反 向 弓| 物 1492r 為 5，-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3'，擴增糞便微生物16S rDNA (16S核糖核蛋白體RNA 基因)。利用常規方法、試劑盒法和本發明的方法製備的糞便總DNA lpl作PCR反應的模板分別擴增糞便微生物的16S rDNA。PCR反應體系如下(20nl): 10xPCR buffer, 2jil; 2.0 mM MgCl2; 200nMdNTP; 0.5jiM引物；1 U Taq酶(TaKaRa); DNA模板，lpl;加ddH20至 20(Xl; PCR程序如下預變性95°C 5 min;變性95°C 30 s;退火58°C 30 s;延 伸72°C 1.5min;最後延伸72°C 8 min; 30個循環。
擴增後，取8(xl在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，擴增的目的DNA片段大小為 1560bp，如圖3所示。1-3、 4-6、 7-9分別本發明方法、常規方法及試劑盒法，擴增結果表 明，本發明方法PCR擴增的特異性條帶完整，明亮，且較常規方法、試劑盒法更為清晰。
權利要求
1.一種豬糞樣總DNA的提取方法，其方法特徵在於按如下步驟操作(1)取適量經過預處理的糞便樣品菌懸液於1.5或2ml離心管中，12,000rpm離心5min，棄上清；(2)加入0.8～1.5ml經60～70℃預熱的裂解液及適量濃度的β-巰基乙醇溶液，混勻後60～70℃水浴0.5～1h，每隔幾分鐘取出搖勻一次；(3)12,000rpm離心5min，離心後，移出上清於另一無菌1.5或2ml離心管中，棄沉澱；(4)向上清中加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻後，10,000rpm離心10min，取上清至另一無菌1.5或2ml離心管中；(5)加入等體積的氯仿，混勻後於10,000rpm離心10min，再取上清；(6)向上清中加入0.1倍體積的3M NaAC，混勻後再加入2倍體積預冷的無水乙醇，充分混勻後-20℃放置30min以上；(7)12,000rpm離心5min，棄上清，所得DNA沉澱在室溫下晾乾；(8)用75％的乙醇對DNA沉澱進行洗滌，乾燥後沉澱溶於100μl TE中，加RNaseA至終濃度為20μg/ml，37℃消化30min，之後於-20℃保存，備用；(9)以步驟(8)所得的DNA為模板，以16S rDNA特異性引物P05』-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』，和1492r5』-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3』擴增出糞便16S rDNA特異性條帶並進行電泳檢測。
2. 權利要求1所述的糞樣總DNA提取方法中，所述的裂解液的特徵在於按以下配 方配製100mMTris-HCl、 1.4MNaCl、 20mMEDTA、 2% CTAB、 1% ~4% PVP-40，使用前須在60 7(TC下預熱。
3. 權利要求1所述的糞樣總DNA提取方法中，所述的p-巰基乙醇溶液的特徵在於其用裂解菌體時的濃度(v/v)範圍為1%~3%，且需單獨添加於菌懸液中。
4. 權利要求1所述的糞樣總DNA提取方法中，其所述的糞樣預處理的特徵在於按 如下步驟操作(1) 稱取適量的糞便樣於一無菌的50ml離心管A中，加入10 20ml PBS緩衝液及無菌的玻璃珠一起渦漩混勻；(2) 在200 400xg下離心2 8min後，儘可能多的取出上層懸液於另一無菌的 50ml離心管B中；(3) 將步驟(2)所得的沉澱再用適量的PBS緩衝液重洗一次，並於200 400xg下 離心2 8min，取出上層懸液合併於離心管B中；(4) 加適量體積的一定濃度的多聚甲醛溶液溶液於離心管B中，並將其置於4'C 孵育l 2h;(5) 然後，6000 10000xg離心5 10min，棄上清，所得菌體沉澱用適量的預冷 的P溶液重懸，混勻後，於-20。C下保存30min以上；(6) 在6000 10000xg離心5 10min後，棄上清，再用適量的PBS緩衝液對所得 菌體沉澱重新洗漆，之後再離心，棄上清，收集菌體沉澱；(7) 所得的菌體沉澱用適量的TE緩衝液重懸，混勻後即得經預處理的糞便樣 品菌懸液，可用於總DNA的提取。
5. 權利要求2所述的糞便樣品預處理中，所述的多聚甲醛溶液的特徵在於其按以 下配方製備取多聚甲醛l 6g，置於燒杯中，加入80ml0.01mol/LPBS溶液 後，55 65'C下磁力攪拌，使其完全溶解，並加入少許NaOH溶液至溶液清亮， 用0.01mol/LPBS定容至100ml，於室溫放置。
6. 權利要求2所述的糞便樣品預處理中，所述的P溶液的特徵在於按以下方式配 制用等體積的PBS緩衝液及無水乙醇混合，並置於-2(TC下保存，備用。
全文摘要
本發明涉及微生物學和分子生物學技術領域，是一種豬糞樣總DNA的提取方法，本發明主要包括糞便樣品的預處理、樣品總DNA提取。以採集新鮮糞便樣品或凍存的糞便樣品為材料，先用PBS緩衝液、多聚甲醛溶液、無水乙醇等進行糞便樣品的預處理，獲得糞樣菌懸液；再以CTAB溶液、β-巰基乙醇等共同裂解細胞釋放DNA。本發明具有操作簡單、快捷、高效、重複性好以及經濟等特點，所提DNA濃度、純度及得率高，無需純化就能直接用於PCR擴增等後續分子生物學實驗研究。
文檔編號C12N15/10GK101307311SQ20081004553
公開日2008年11月19日 申請日期2008年7月14日 優先權日2008年7月14日
發明者唐俊妮, 曾志光, 曾瑜虹, 鑫 楊, 樊汶樵, 王紅寧, 波 謝 申請人:四川大學