一種重組促胰島素分泌素生物學活性測定方法及其應用的製作方法
2023-05-05 09:31:01
專利名稱：一種重組促胰島素分泌素生物學活性測定方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於細胞因子生物活性檢測技術領域，涉及一種重組促胰島素分泌素(即Exendin-4)生物學活性測定方法及其應用。
背景技術：
促胰島素分泌素(Exendin-4)是從大毒蜥Gila monster Heodermasuspectrum口腔分泌物中分離出的一種含有39個胺基酸的多肽(Eng，J.等，J.Biol.Chem.，26520259-62，1990；Eng，J.等，J.Biol.Chem.，2677402-05，1992)。其胺基酸序列與類胰高血糖素(glucagon-likepeptide，GLP-1)有53％的同源性(Coke等，J.Biol.Chem.，26819650-55，1993)。Chen和Drucker克隆了該基因，並得出它是不同於胰高血糖素基因(GLP-1是由胰高血糖素原加工而成)的另外一個基因的表達產物(J.Biol.Chem.，2724108-15，1997)。
大量動物模型實驗顯示，Exendin-4表現出了與GLP-1類似的抗糖尿病藥的作用。包括促進β細胞的增殖和β前細胞的再生；在高血糖條件下，刺激胰島素的分泌，低血糖時則不能，因此，可防止用藥後低血糖的發生；它還能調節胃的排空減慢營養物質進入血液的速度。目前已證實長期皮下給予Exendin-4能減少肥胖動物的食物消耗，減輕體重。更為重要的是，在II型糖尿病動物模型中，Exendin-4可使血糖降到接近正常水平。Exendin-4進入體內後不受二肽酶(DPP-IV)分解的影響，而GLP-1僅1～2分鐘，即被二肽酶分解，相比於GLP-1，Exendin-4的藥效時間更長。在糖尿病動物模型上，無論口服、舌下含服、肺部、氣道還是鼻腔給予Exendin-4均有效。
Exendin-4特異性的與肺膜及胰島瘤細胞的GLP-1受體相互作用，與GLP-1一樣，在分離的大鼠胰島和小鼠胰島瘤細胞β-TC-1中，在葡萄糖的刺激下，其呈劑量依賴的誘導胰島素的分泌；同樣，RdigerGke，Hans-Christoph Fehmann等報導，Exendin-4也刺激RIN-5F細胞胞內cAMP和胰島素的分泌，用不同劑量的Exendin-4和IBMX(3-isobutyl-1-methyl-xanthine，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)同時刺激RIN-5F細胞5min，胞內cAMP迅速升高，裂解的細胞上清中的cAMP含量呈劑量依賴性。IBMX是磷酸二酯酶抑制劑，阻止產生的cAMP的降解。
生物學活性評價是蛋白多肽產品質量最客觀、有效的指標，因此建立蛋白多肽活性檢測方法也成為蛋白多肽研究的重點之一。目前，已報導的Exendin-4生物學活性檢測方法有利用Exendin-4刺激胰島β細胞胰島素分泌測定胰島素含量變化；利用放射免疫法(RIA)測定cAMP水平變化，如中國專利CN1384755A公布了一種通過放射免疫法測定化學合成的新型Exendin激動劑生物活性的方法；通過皮下注射測定小鼠血糖水平效應量的變化；前兩種方法方法都是採用同位素標記，試驗操作有一定危險，廢物不易處理，而後一種方法由於動物本身個體差異，產生的誤差較大，應用性差。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術中存在的上述不足，提供了一種簡便、快速、準確度高、安全性好的重組促胰島素分泌素生物活性檢測方法及其應用。
解決本發明技術問題所採用的技術方案是該重促胰島素分泌素(Exendin-4)的生物學活性測定方法，包括如下步驟(1)用Exendin-4刺激細胞，使胞內cAMP分泌，(2)將步驟(1)的細胞裂解，收集裂解上清液；(3)用酶聯免疫方法測定步驟(2)所收集的細胞上清中的cAMP含量，以及(4)根據步驟(3)測得cAMP含量計算出所述Exendin-4的生物活性。
本發明技術方案優選的是所述用Exendin-4刺激的細胞為RIN-5F細胞。
進一步優選的是用不同劑量的Exendin-4和一定劑量的IBMX同時刺激RIN-5F細胞3-12min，使胞內cAMP分泌。
本發明重組促胰島素分泌素Exendin-4的生物學活性測定方法的應用是重組促胰島素分泌素Exendin-4的生物學活性測定方法在重組促胰島素分泌素Exendin-4質控中應用。重組產品生物學活性是質控中重要的檢測指標，以確保產品具有穩定的生物活性。
本發明是根據Exendin-4刺激RIN-5F細胞使胞內cAMP呈劑量依賴分泌的原理，用不同劑量的Exendin-4和和一定劑量如1mM的IBMX同時刺激RIN-5F細胞5min，胞內cAMP迅速升高，用酶聯免疫方法測定各劑量刺激後裂解的細胞上清中的cAMP含量，進而計算出Exendin-4的生物活性。
本發明採用酶聯免疫方法測定重組促胰島素分泌素(Exendin-4)的生物學活性具有步驟簡便、廢物少並且易於處理、簡便、快速、準確度高、安全性好等優點。
圖1.重組Exendin-4與合成Exendin-4的活性劑量反應曲線圖2.酶聯免疫法測定重組Exendin-4活性的計算結果圖3.放射免疫法測定重組Exendin-4活性的計算結果具體實施方式
以下是本發明的非限定實施例，將有利於本領域的普通技術人員進一步理解本發明。
實施例1 Exendin-4活性測定方法採用RIN-5F細胞(購自ATCC，貨號CRL-2058)測定Exendin-4活性的方法包括如下步驟(1)取對數生長期的RIN-5F細胞，用含血清的細胞培養液RPMI1640如10％胎牛血清的RPMI1640製成細胞懸液，調整細胞密度為(1.6-2.4)×104個/孔，接種細胞於培養板，培養至細胞匯合率達到70％以上；(2)除去上述含血清的細胞培養液，加入無血清細胞培養液，培養箱中孵育1-4小時，此步的目的是除去血清並讓細胞預先適應刺激反應條件體系，血清本身含較高的cAMP含量，其會影響刺激產生的cAMP，從而影響測定結果。
(3)用含0.2～1mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和無血清細胞培養液作為稀釋液，將Exendin-4預稀釋到100～400ng/ml，然後作2-6倍稀釋，每個樣本6-10個稀釋梯度；(4)除去無血清培養上清，將稀釋好的各梯度Exendin-4按每孔140-220μl加入細胞培養板的對應孔中，置培養箱孵育3-12分鐘，即刺激3-12分鐘；(5)除去刺激細胞的上清，加入細胞裂解劑如0.1N HCl在35-40℃孵育20-50min，提取細胞中的cAMP，取裂解上清用於檢測；(6)取上清，採用cAMP檢測試劑盒，酶聯免疫法測定，按要求操作測定cAMP含量；(7)結果計算根據測定的cAMP含量數據，算出重組促胰島素分泌素Exendin-4的生物學活性。
優選的是步驟(1)中調整細胞密度為1×105個/ml，接種細胞於96孔的培養板中，接種量為200μl/孔，置培養板於37℃、5％CO2培養箱中，連續培養3天；步驟(2)中除去細胞培養上清，加入200μl無血清細胞培養基，CO2培養箱孵育2小時。
進一步優選的是，步驟(3)中是用含1mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和0.1％BSA的無血清細胞培養液作為稀釋液，將樣本預稀釋至200ng/ml，然後作4倍稀釋，每個樣本8個稀釋度，每個稀釋梯度做雙復孔。
進一步優選的是，步驟(4)中除去無血清培養上清，將稀釋好的各梯度樣本180μl加入細胞培養板對應孔中，置37℃，5％CO2培養箱孵育5分鐘，即刺激5分鐘。
進一步優選的是，步驟(5)是如下完成的將用於刺激細胞的上清液除去，每孔加入200μl 0.1N的HCl在37℃孵育30min，離心收集上清液用於檢測；步驟(6)是如下完成的取步驟(5)得到的上清液100μl，採用cAMP酶聯免疫檢測試劑盒，測定cAMP含量。如採用RD公司的cAMP檢測試劑盒，酶聯免疫法測定，按說明書要求操作測定cAMP含量；進一步優選的是，步驟(7)中包括利用ORIGIN軟體進行四參數(Logistic)運算處理，求出Exendin-4的半效濃度EC50，即以該值表示為1個活性單位(AU)。
實施例2 Exendin-4活性測定方法的可重複性利用實施例1的方法測定重組Exendin-4活性，10次重複試驗的半效反應劑量(EC50)及相關轉換數據見表1表1 10次重複試驗的半效反應劑量(EC50)及相關轉換數據
對上述試驗數據統計分析，自由度f＝n-1＝9，查t值表得t(9)0.05＝2.262，10次Log(X±SD)為5.6195±0.09083，各實驗數據在LogX上下呈正態分布，10X＝105.6195＝416389.7AU/mg；95％可信區間＝105.52867～105.71033＝337808.0～513251.2AU/mg，95％可信區間為均數的81.1％～123.3％，平均可信限率為1.1％。以上結果表明用該方法測定重組Exendin-4生物學活性穩定可靠。
實施例3 重組Exendin-4與合成Exendin-4活性比較採用本發明的方法，對重組Exendin-4和化學合成Exendin-4(購自Bachem，貨號H8730)進行活性分析，試驗數據見表2，回歸運算見表3，活性比較圖譜見圖1。
表2.重組Exendin-4與合成Exendin-4的活性試驗結果
表3.重組Exendin-4和合成Exendin-4活性試驗結果四參數運算
結果表明，合成Exendin-4的活性(EC50)與文獻報導一致，重組Exendin-4與合成Exendin-4劑量反應曲線平行，基本重疊，進一步說明該方法重複性強、準確度高，可作為重組Exendin-4的生物活性測定方法。
實施例4 Exendin-4活性測定中酶聯免疫法(EIA)和放射免疫法(RIA)的比較同時作兩塊96孔板，測定重組Exendin-4樣品活性，一塊用作酶聯免疫法檢測，一塊用作放射免疫法檢測。
酶聯免疫法刺激細胞5min後，除去上清，200μl 0.1N的HCl 37℃孵育30min，取100μl上清到預包被的酶標板中，依次加入50μlcAMP耦聯物和50μlcAMP抗體，室溫孵育2小時，洗滌3次，加入200μl pNPP底物，室溫反應30分鐘，加入50μl 0.2M Na3PO4終止液，檢測OD405/570，換算成cAMP值後計算重組Exendin-4活性(見圖2)放射免疫法刺激細胞5min後，除去上清，200μl 90％正丁醇37℃孵育60min，取150μl提取液N2吹乾，400μl醋酸緩衝液復溶，按照cAMP放免試劑盒(上海第二醫科大學實驗核醫學教研室)依次加入cAMP標準(或樣本50μl)、3H-cAMP 100μl、乙醯化試劑8μl，立即混勻，再加入抗血清100μl混勻，4℃保溫4小時；向反應液中加入1ml淋洗緩衝液後，立即滴加到微孔濾膜上過濾，並用淋洗液洗滌2次，轉移濾膜到EP管中，80℃約30分鐘烘乾濾膜。向置有濾膜的EP管中加入1ml閃爍液(二甲苯中含0.4％PPO和0.01％POPOP)後，置閃爍杯中，用液體閃爍計數器測定2分鐘的cpm值，換算成cAMP值後計算重組Exendin-4活性(見圖3)。
用酶聯免疫法和放射免疫法測定重組Exendin-4活性活性的結果比較表明兩種檢測方法得到的Exendin-4刺激RIN-5F細胞產生cAMP的半效反應劑量一致。但相比放免法，酶聯免疫法具有步驟簡便、廢物少並且易於處理等優點。
權利要求
1.一種促胰島素分泌素(Exendin-4)的生物學活性測定方法，包括如下步驟(1)用Exendin-4刺激細胞，使胞內cAMP分泌，(2)將步驟(1)的細胞裂解，收集裂解上清液；(3)用酶聯免疫方法測定步驟(2)所收集的細胞上清中的cAMP含量，以及(4)根據步驟(3)測得cAMP含量計算出所述Exendin-4的生物活性。
2.根據權利要求1所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於所述用Exendin-4刺激的細胞為RIN-5F細胞。
3.根據權利要求2所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於用不同劑量的Exendin-4和一定劑量的IBMX同時刺激RIN-5F細胞3-12min，使胞內cAMP分泌。
4.根據權利要求3所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於所述步驟(1)是如下完成的(a)取對數生長期的RIN-5F細胞，用含血清的細胞培養液RPMI1640製成細胞懸液，調整細胞密度為(1.6-2.4)×104個/孔接種於細胞培養板，培養至細胞匯合率達到70％以上；(b)除去上述含血清的細胞培養液，加入無血清細胞培養液，培養箱中孵育1-4小時；(c)用含0.2-1mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和無血清細胞培養液作為稀釋液，將Exendin-4預稀釋到100至400ng/ml，然後作3-6倍稀釋，稀釋6-10個梯度；(d)除去無血清培養上清，將稀釋好的各稀釋梯度Exendin-4按每孔140-220μl加入細胞培養板的對應孔中，置培養箱孵育3-12分鐘。
5.根據權利要求4所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於步驟(a)中調整細胞密度為1×105個/ml，接種細胞於96孔的培養板中，接種量為200μl/孔，置培養板於37℃、5％CO2培養箱中，連續培養3天；步驟(b)中除去細胞培養上清，加入200μl無血清細胞培養基，CO2培養箱孵育2小時。
6.根據權利要求4所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於步驟(c)中是用含1mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和含0.1％BSA的無血清細胞培養液作為稀釋液，將Exendin-4預稀釋至200ng/ml，然後作4倍稀釋，作8個稀釋梯度，每個稀釋梯度做雙復孔。
7.根據權利要求4所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於步驟(d)中除去無血清培養上清，將稀釋好的各濃度梯度Exendin-4 180μl加入細胞培養板對應孔中，置37℃，5％CO2培養箱孵育5分鐘。
8.根據權利要求1所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於步驟(2)是如下完成的將用於刺激細胞的上清液除去，每孔加入200μl 0.1N的HCl，在37℃孵育30min，離心收集上清液用於檢測；所述步驟(3)是如下完成的取步驟(2)得到的上清液100μl，採用cAMP酶聯免疫檢測試劑盒，測定cAMP含量。
9.根據權利要求1所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，其特徵在於步驟(1)包括利用ORIGIN軟體進行四參數(Logistic)運算處理，求出Exendin-4的半效濃度EC50，即以該值表示為1個活性單位(AU)。
10.權利要求1-9之一所述的促胰島素分泌素的生物學活性測定方法在重組促胰島素分泌素Exendin-4質控中應用。
全文摘要
本發明涉及一種重組促胰島素分泌素(Exendin－4)生物學活性測定方法及其應用。該重組促胰島素分泌素的生物學活性測定方法，是用Exendin－4刺激細胞使胞內cAMP分泌，胞內cAMP量迅速升高，用酶聯免疫方法測定裂解的細胞上清中的cAMP含量，裂解的細胞上清中cAMP含量呈劑量依賴性，進而計算出Exendin－4的生物活性。用Exendin－4刺激的細胞為RIN－5F細胞。所述的測定方法可在重組促胰島素分泌素Exendin－4質控中應用。本發明採用酶聯免疫方法測定重組促胰島素分泌素Exendin－4的生物學活性具有步驟簡便、廢物少並且易於處理、簡便、快速、準確度高、安全性好等優點。
文檔編號C12Q1/00GK1844925SQ200610076398
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月24日 優先權日2006年4月24日
發明者韓為躍, 陽勇, 張仁懷, 楊立明, 劉社際, 何凱, 黃碧蓮, 劉德林 申請人:東莞市博康健醫藥科技有限公司