一種無創高通量甲基化結腸癌診斷、研究和治療方法與流程

2023-05-05 22:50:41

本發明涉及生物技術基因甲基化檢測，具體是一種無創高通量甲基化結腸癌診斷、研究和治療方法。

背景技術：

近年來,表觀遺傳學研究已經成為癌症研究的一個新方向。1983年,科學家們首次發現dna甲基化與癌症之間存在著密切的關係。riggs和jones發現,相對於正常細胞而言,癌細胞基因組呈現出低甲基化。基因組dna上各cpg位點甲基化狀態的差異構成基因組dna甲基化譜，基因組dna異常甲基化會導致人類多種疾病的發生和發展。大量研究結果顯示,表觀遺傳修飾的異常改變與癌症有著十分密切的聯繫,全基因組範圍內的表觀遺傳修飾改變已經成為癌症的新標記。最新的觀點認為,癌症的發生發展不僅僅與遺傳改變相關,表觀遺傳修飾的異常改變也貫穿於癌症的各個階段。因此,這就意味著癌症在一定程度上是一種表觀遺傳疾病。dna甲基化作為表觀遺傳修飾的重要組成部分,其在癌症的早期診斷、治療、預後以及預防等方面的研究也取得了相應的成果。世界衛生組織指出，三分之一的癌症可以預防，三分之一的癌症可以治療，要想預防和治療，就必須要早期診斷，早期診斷、早期治療不但可以節省大量花費，更重要的的是大大提高病人的生存率。現在多數腫瘤檢測是針對基因突變或者重組的，對用藥有指導意義(比較簡單)但不能檢測早期腫瘤。

結腸直腸癌(crc)是常見的消化道惡性腫瘤，發生率僅次於胃癌和食道癌。在我國常見惡性腫瘤死亡中，結直腸癌患者在男性佔第五位，女性佔第六位。近二十年來結直腸癌的發病率在逐漸增加，同時，其發病年齡趨向老齡化。在美國是第四大最常見的癌症，但是，它是癌症相關死亡的第二大原因。高死亡可能是由於下列事實：1)5年生存率顯著下降，從約90％的患者診斷為局部疾病到70％和12％的患者分別被診斷為區域和遠期階段疾病；2)只有約40％的患者在早期階段被診斷。3)只有約一半的50歲及以上的成年人已被篩選。表觀遺傳改變，包括甲基化，在crc的發病機制中發揮作用。循環甲基化dna參與細胞分裂和細胞周期控制，已被鑑定可作為這樣的標記物。

直到目前為止技術上的限制，科學家和實驗室裡還只能對單一類腫瘤進行早期篩查，實現這種高靈敏度高準確的一次檢測早期診斷所有腫瘤的技術，目前仍有許多技術難點。尤其目標甲基化位點的富集，現在市場上沒有甲基化下一代測序的完整解決方案。對於具有臨床意義的甲基化位點的解讀需要通過大量臨床研究獲得，這些位點對於檢測的準確性至關重要。目前還沒有成熟的方法和可靠的數據解讀這些測序資料。有兩個問題涵待解決，一是測序後得到大量信息如何分析，二是分析得出結果，與臨床是否符合，與病情是否符合。總之，雖然dna甲基化檢測是公認的早期癌症檢測方法，但是因為目前技術在靈敏度和準確性上都達不到臨床使用的地步。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種無創高通量甲基化結腸癌診斷、研究和治療方法，基於高通量基因甲基化的下一代測序技術，鑑定與特定結腸癌症相關的基因中甲基化模式，能夠早期發現人體內結腸器官的腫瘤。

一種無創高通量甲基化結腸癌診斷、研究和治療方法，包括但不限於癌症標誌物，提供所用組合物來自受試者的生物樣品及包含的基因組dna，其特徵在於基於大通量平行甲基化檢測組合測序m-ngs同時加上血液中的cfrna信息：鑑定與結腸癌症相關的基因中甲基化的變化，檢測受試者的生物樣品一個或多個基因中dna甲基化的存在與否，以產生受試者的甲基化譜，包括建立sept9，mlh1，dkk2，apc基因含有的特異性cpg島位點，使用特異性的抗甲基胞嘧啶抗體識別並結合到發生甲基化的dna片段，利用免疫沉澱技術達到富集的效果，來實現甲基化二代測序文庫的建立和靶標位點的富集，並將受試者的甲基化譜與一個或多個標準甲基化譜進行比較,對甲基化位點測序生物信息利用「瀑布」機理分析得出結論受試者是否有癌症,進而結合來自無細胞核糖核酸cfrna的基因信息和甲基化位點的綜合分析，確定癌症的發生以及定位。

本發明突出貢獻：

本發明方法發展了基於基因甲基化的下一代測序技術的應用，通過cfrna和甲基化譜的結合來實下一代測序文庫的建立和靶標位點的富集，能夠早期發現人體內特定器官或部位的腫瘤。現在美國做早期腫瘤血檢的只有比爾蓋茲投資的grail，但是本發明方法與他們不完全一樣，另外，grail也沒有同時檢測cfrna，不知道基因表達情況，因此其結論與臨床準確性符合程度受到影響。並且他們的資料庫建立因為病人數量不充足的影響，基礎樣本數目規模也會受到限制，因此與比爾蓋茲投資的grail的競爭對手可以忽略不計。本發明的技術是基於大通量平行甲基化檢測組合測序，在本行業裡處於領先地位，同時加上cfrna信息分析方法，從而更準確的確定早期發現癌變的部位，在腸癌上已經有83％的準確率，對廣譜腫瘤診斷如虎添翼。眾所周知，基因的開關必須由rna來判斷，dna甲基化只是上遊信息。只有把這兩個方面信息結合起來，敏感度和準確度才能都達到非常好的程度。

簡言之，該基因甲基化技術具有獨特性和前瞻性，能夠預測早期結腸腫瘤的發生。市場上還沒有專門針對早期腫瘤篩查的基於甲基化的廣譜腫瘤下一代測序方案，本發明方法證實已經找到突破口，並取得了成功。

附圖說明

圖1為在結腸中sept9，mlh1，dkk2，apc的總體甲基化百分比示意圖。

具體實施方式

本發明的無創高通量甲基化結腸癌診斷、研究和治療方法，包括但不限於癌症標誌物，提供來自受試者的生物樣品及包含的基因組dna，其特徵在於基於大通量平行甲基化檢測組合測序同時加上血液中的cfrna信息：鑑定與特定癌症相關的基因中甲基化的變化，檢測生物樣品的一個或多個基因中dna甲基化的存在與否，以產生受試者的甲基化譜，以及將受試者的甲基化譜與一個或多個標準甲基化譜進行比較，其中標準甲基化譜選自於非癌性樣品的甲基化譜和癌性樣品的甲基化譜，進而結合來自無細胞核糖核酸cfrna的基因信息和甲基化位點的綜合分析，確定癌症的發生以及定位。

本發明的cfrna信息技術：利用血液中游離的腫瘤細胞釋放的rna，能夠強力抵抗血液中的核糖核酸酶的降解，並且存在足夠的水平以便進行定量分析這個特性，並且這些循環的rna在結腸癌症患者的血清和血漿中與健康人的相比明顯上升，通過它們獲得的基因信息，結合受試者的甲基化圖譜的結果，進而給出確切的診斷結果。

本發明所述無創高通量甲基化結腸癌症的診斷方法，提供來自診斷為癌症的受試者的生物樣品，包含的基因組dna，其特徵在於把鑑定該基因在啟動子區域的cgi島和cpg島中的甲基化水平作為結腸癌的診斷標誌物和臨床靶標，當存在甲基化水平增加時，對應的就是所述基因的表達降低。為篩選受試者中結腸癌的存在的具體方法：包括(a)從來自受試者的生物樣品中提取基因組dna,隨後對其進行亞硫酸氫鹽轉化；和(b)檢測基因甲基化是在基因的5`非翻譯區中，使用體外測定法高通量二代測序儀檢測所述基因sept9，mlh1，dkk2，apc的甲基化狀態，在所述受試者的受試樣品中，上述基因的甲基化程度相對於正常結腸細胞比照，指示結果顯示甲基化水平升高的則是結腸癌。

本發明還提供了進一步的一種診斷結腸癌症的方法，癌症的表徵包括確定疾病存在或不存在的機會。圖1顯示了在結腸中sept9，mlh1，dkk2，apc的總體甲基化百分比。檢測的結果顯示，為分數20/22也就是圖1中90.9％，結腸癌血液樣品顯示四個基因組啟動子區域的高甲基化，而在正常0/3沒有甲基化發生，良性鄰近組織5/7，只有兩例有些微的低甲基化中沒有檢測到高甲基化。

在更進一步的實施方案中，癌症的表徵包括確定發生轉移性疾病的風險。在其它實施方案中，癌症的表徵還包括監測所述受試者的疾病進展情形。把上述檢測方法得到的檢測結果，用下面診斷方法算法計算之後，得到癌症的表徵風險評價，從而給出受試者的癌症發生的準確結論。

本發明提供了表徵定性結腸癌症的方法，包括提供來自診斷為癌症的受試者的生物樣品及包含的基因組dna，其特徵在於基於大通量平行甲基化檢測組合測序同時加上血液中的cfrna信息，建立sept9，mlh1，dkk2，apc基因含有的特異性cpg島位點，檢測sept9，mlh1，dkk2，apc基因中dna甲基化的存在與否，從而表徵受試者是否有癌症。

本檢測的適用對象是50歲以上的高風險男性，檢測的平臺是二代測序儀，檢測這四個基因為sept9，mlh1，dkk2，apc。10毫升血液離心後取上清抽提游離dna。然後利用亞硫酸氫鹽轉化把甲基化的cpg島轉化為cc的序列，然後建構測序文庫進行大通量平行測序。通過對測序結果的分析讀取基因特定區域甲基化的密度來判斷是否病人已經患有結腸癌。經檢測血液中4個基因特定區域的甲基化水平符合下述診斷算法，診斷為早期的結腸癌。在進一步的實施方案中，本檢測的陰性準確率達到96.3％可以有效排除檢驗對象患結腸癌的可能性。

在一些實施方案中，生物樣品是活組織檢查樣品。在其他實施方案中，生物樣品是血液樣品。在一些實施方案中，dna甲基化包括cpg甲基化。在一些優選的實施方案中，檢測dna甲基化的存在或不存在，包括用甲基化敏感性限制酶消化所述基因組dna，隨後對含有cpg島的特異性dna片段進行多基因擴增。在一些實施方案中，甲基化敏感性限制酶包括hin61.在其它實施方案中，甲基化敏感性限制酶包含hpah。

本發明還提供了一種診斷癌症的方法，包括提供來自受試者的生物樣品，所述生物樣品包含的基因組dna；並檢測sept9,mlh1,dkk2,apc基因中dna甲基化的存在與否，從而診斷受試者的癌症。在一些實施方案中，所述方法還包括檢測一種或多種基因中存在或不存在dna甲基化的可能性，包括si00,srbc,ralgds,hdsfl,sy,cyclind2,tms1,hic-1,hmlhl,rab6c,e-cadherin,14-3-3sigma,igf2,sfrp5和mdgi基因。在一些實施方案中，通過下面診斷方法算法得知受試者處於發展為癌症的高風險中。

甲基化二代測序方法

a.將5微克從lncap細胞分離的基因組dna超聲處理至範圍，並使用購買的qiagenpcr純化試劑盒進行純化。b.使用標準的illumina方案修復末端，將polya尾部和銜接子加入到片段dna中。c.然後將dna在95℃熱變性10分鐘，並在冰上快速冷卻。d.將dna與ip緩衝液中的5微克抗甲基胞嘧啶抗體在振蕩器中4℃溫育過夜，ip緩衝液含有140mm氯化鈉和0.05％tritonx-100的10mm磷酸鈉緩衝液。e.通過與100微升蛋白a樹脂珠粒在4℃下孵育2小時收集甲基化片段。f.將蛋白a樹脂珠粒在4℃下在ip緩衝液中洗滌4次，並重懸於200微升含有0.25％sds和5μg蛋白酶k的te緩衝液中，並在55℃下孵育2小時。g.使用dnaclean和concentrator-5試劑盒純化樣品，按照illuminachip-seq方案製備文庫。h.使用bio-analyzer量化該文庫，並使用每個文庫10nm的濃度為其製備每泳道約30,000簇的流通池。

診斷方法算法：sept9,mlh1,dkk2,apc的dna甲基化模式將用下式計算：

診斷危險因素＝4個基因中的總甲基化cpg島/4個基因中的總cpg島。

診斷方法：如果這個數字小於0.15，患者就沒有任何結腸癌風險。

如果這個數字在0.15-0.3之間，患者被診斷為早期癌症的風險很高。

如果這個數字超過0.3，那麼患者被診斷為t2期或以上的風險很高。

解釋技術名詞：高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，因此稱其為下一代或二代測序技術(nextgenerationsequencing)，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細緻全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。

蛋白a樹脂珠粒即invitrogen，carlsbad，california。

所述試劑盒zymoresearch，orange，california是購買的。

bio-analyzer即是agilenttechnologies，santaclara，california。