一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體及其在製備磁共振成像對比材料中的應用的製作方法

2023-05-06 02:02:26

一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體及其在製備磁共振成像對比材料中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體及其在製備磁共振成像對比材料中的應用。本發明設計、合成並評價了由錳元素和微量釓組成的雜化「雙金屬」磁共振成像納米粒子膠體。研究表明：本發明納米粒子膠體的高弛豫率來源於納米粒子核心懸浮的高濃度的油酸錳分子，這些小分子可以滲透過磷脂膜層，接觸到水和納米粒子的臨界面。在納米粒子表面整合微量釓螯合物可以提供額外的弛豫率，從而影響周圍質子弛豫效應。本發明的一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體能夠最大限度減少釓劑負荷，降低釓螯合劑的副作用，改善生物安全性，達到提高納米粒子r1順磁性磁共振對比效應的目的。
【專利說明】一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體及其在製備磁共振成像對比材料中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種順磁性納米粒子膠體(Nanocolloid, NC)的製備及其作為磁共振成像對比劑的應用，特別涉及一種錳釓雜合雙金屬順磁性NC製備及其作為磁共振成像對比材料的應用。本發明屬於醫藥【技術領域】。

【背景技術】
[0002]順磁性和超順磁性金屬一直以來被用做磁共振成像(magnetic resonanceimaging,MRI)的對比材料。其中，鑭系金屬禮(Gd)是被最廣泛研究的,而且禮螯合劑一直作為臨床和科研領域最主要的順磁性血池對比劑。最近釓螯合劑在體內發生金屬離子置換及禮離子游離被證實是引發腎源性系統性纖維化(nephrogenic systemic fibrosis, NSF)最主要的原因，這是一種在患有嚴重腎臟或泌尿系統疾病或肝移植的患者中出現的、罕見的但具有非常嚴重的副作用的疾病。引起了人們對注射磁共振對比劑進行增強掃描患者的安全性的廣泛關注，這直接促使美國食品藥品監督管理局(FDA)發布了對釓對比劑的應用警告。從機理上看，與化學性質穩定的大環形禮螯合物(例如，I, 4，7，10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid, I, 4, 7, 10-四氮雜環十二燒-1, 4, 7, 10-四乙酸，簡稱 D0TA)相比，線性非環狀禮螯合物(^Pdiethylenetriamine pentaacetic acid, 二乙烯三胺五乙酸，簡稱DTPA)更容易促使釓離子發生金屬置換。
[0003]以往的研究已經證實，表面負荷高濃度釓螯合劑的全氟化碳NC(30摩爾％，即等同於100000金屬離子/納米粒子)可以用於MRI來敏感的檢測新生血管。急性補體系統激活，是自體免疫反應的一個重要分支，有誘發高血壓甚至猝死的可能。最近的研究結果表明在脂質NC表面修飾某些功能基團(如螯合釓劑等)可以引起補體系統激活，主要是通過IgM抗體引發的經典通路實現的(R.Virmani, F.D.Kolodgie, A.P.Burke, A.V.Finn, H.K.Gold, T.N.Tulenko, S.P.ffrenn, J.Narula Arter1scler Thromb VascB1l.2005, 25，2054-2061.)(見圖1)。在這個事件中，反應強度不僅僅取決於表面電荷，更主要是取決於偶聯在脂質膜上的螯合物的化學結構。為了實現Tl加權MRI，本研究在NC表面偶聯的釓螯合劑量約為臨床批准用於患者釓螯合劑濃度的1/8(100,000金屬離子/NC)。雖然環狀釓螯合物結構穩定，明顯減少了 NSF的風險性，但這類環狀螯合物仍然有引起急性補體激活的可能。因此，目前迫切的需要開發一種實現低NSF、低急性補體激活風險、高Tl弛豫對比效應的新型順磁性NC的化學合成策略。
[0004]以往的研究報導了使用非鑭系金屬元素(如二價錳和二價銅)的敏感性進行MRI。金屬錳(Mn)由於其高效的正性對比增強效果成為最早應用於人體的MRI順磁性對比材料之一。依據類似「軟物質』^NC的概念,本發明探索了油酸猛納米粒子膠體(manganese oleatenanocolloid, MnOL-NC)在MRI中的應用。NC是由磷脂膜包裹(雞蛋卵磷脂氯化二棕櫚酸磷脂醯膽鹼)，設計用於血管內靶向顯像(直徑>120納米)(圖1e)。二價錳完全濃聚在由濃縮劑(聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或紅花油)構成的NC的核心基質中，NC表面具有多重生物靶點特異性靶向配體，用以實現高親和力和高敏感性的靶向MRI (良好的「粘附和滯留」性質)。


【發明內容】

[0005]針對現有技術中存在的問題，本發明的目的之一是通過使用非鑭系金屬作為對比效應金屬來明顯減少鑭系金屬的用量達95%以上，從而開發一種可作為MRI對比劑的高Tl弛豫率的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體。
[0006]本發明的目的之二是提供一種製備所述錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體的方法。
[0007]本發明的目的之三是提供所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體在作為MRI對比材料方面的應用。
[0008]為了達到上述目的，本發明所採用的技術手段為:
[0009]本發明設計、合成並評價了由錳元素和微量釓組成的雜化「雙金屬」MRI納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)。研究表明，該納米粒子膠體的高弛豫率來源於納米粒子核心懸浮在濃縮劑(聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或紅花油)中的高濃度的MnOL分子，這些小分子可以滲透過磷脂膜層，接觸到水和納米粒子的臨界面。在納米粒子表面整合微量釓螯合劑可以提供額外的弛豫率，從而影響質子弛豫效應，通過這種雙順磁性金屬排列來實現協同增強MnOL-NC內在磁偶極子的效應。本發明最終在磷脂膜偶聯釓螯合劑濃度為臨床批准濃度的1/300，體外和活體動物實驗研究結果證實，使用本發明的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)能夠消除急性補體激活，同時明顯改善TlwMRI的能力。
[0010]本發明的一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)，其特徵在於所述的納米粒子膠體中含有複數個錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子，所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子由內核層和外殼層組成，其中內核層包括二價油酸錳MnOL分子以及作為懸浮介質的濃縮劑，外核層由釓螯合物以及磷脂醯膽鹼組成，所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)是通過以下方法製備得到的:
[0011](I)在氮氣氛圍下，將二價油酸錳MnOL懸浮在濃縮劑中，在100-300兆帕和0-25°C條件下加入磷脂表面活性劑，充分混合，其中，所述的磷脂表面活性劑中含有釓螯合物和磷脂醯膽鹼；
[0012](2)步驟(I)得到的混合液在25°C?55°C超聲浴的條件下反應0.5h?24h，反應過程中始終保持氮氣氛圍，反應後的溶液在氮氣吹掃下封裝，即得錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體。
[0013]在本發明中，優選的，所述的二價油酸錳(MnOL)是通過以下方法製備得到的:二價錳化合物同油酸鈉(TCI chemical)在乙醇-水-正己烷混合物中先在75_85°C下反應12-16小時，然後在24-26 °C下反應3-5小時，除去溶劑後，製備得到二價MnOL，所述的乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為3-5:4-6:8-10，更優選的，在乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為4:5:9。
[0014]在本發明中，優選的，所述的二價錳化合物選自氧化錳(MnO)、氯化錳(MnCl2)、二亞乙基三胺五乙酸錳(Mn-DTPA)和二磷酸雙吡哆醛錳(Mn-DTOP)中的一種或多種。
[0015]在本發明中，優選的，所述的濃縮劑為聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或紅花油中的一種或幾種的組合。
[0016]在本發明中，優選的，所述的聚山梨酯為聚山梨酯80。
[0017]在本發明中，優選的，二價油酸錳MnOL的質量(g)與濃縮劑的體積(ml)比為1:1.5-2.5，優選 1:2。
[0018]在本發明中，優選的，所加入的磷脂表面活性劑的終濃度為0.015-0.025g/ml，優選 0.02g/mlo
[0019]在本發明中，優選的，所述的磷脂表面活性劑中含有0.l-50mol %的釓螯合物以及5OmoI % -99.9mol %的磷脂醯膽鹼。
[0020]在本發明中，優選的，所述的釓螯合物包括釓-輪環藤寧四乙酸四乙酸磷脂醯乙醇胺(Gd-DOTA-ΡΕ)、釓-二乙撐三胺五乙酸油酸雙酯(Gd-DTPA-BOA)、釓雙胺(gadodiamide)、馬根維顯(gadopentetate dimeglumine)及禮弗塞胺(gadoversetamide)中的一種或多種。
[0021]其中，Gd-DOTA-ΡΕ以及 Gd-DTPA-BOA 的製備方法可參見文獻:Schmieder, A.H.，P.M.Winter,et al.(2013)."Molecular MR Imaging of Neovascular Progress1n inthe Vx2Tumor with alphavbeta3_Targeted Paramagnetic Nanoparticles."Rad1logy268(2):470-480.
[0022]在本發明中，優選的，混合液在37°C?40°C超聲浴的條件下反應0.5h?24h。
[0023]進一步的，本發明還提出了以上任一項所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)在製備MRI對比粒子中的應用。
[0024]相較於現有技術，本發明的一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-GdNC)能夠實現最大限度減少釓劑的負荷，降低釓螯合劑的副作用(如腎源性系統性纖維化和急性補體激活的發生)，改善的生物安全性，提高rl順磁性MRI對比效應的目的，並且可以在磷脂膜表面偶聯新生血管特異性生物靶點的靶向配體，通過MRI方法檢測表達含量低的新生血管整合素(如ανβ3)，從而用於腫瘤新生血管靶向分子成像。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為線性DTPA(圖a，c)和環狀DOTA(圖b, d)釓對比劑的結構示意圖及其相應副作用；圖(e)為第一代單金屬油酸猛(manganese (II) oleate nanoparticles, MnOL)納米粒子:二價MnOL納米粒子的示意圖；圖c、d顯示出Gd-DTPA-BOA具有短鏈化學結構，Gd-DOTA-ΡΕ有長鏈的化學結構；
[0026]圖2為本發明的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子的示意圖；
[0027]圖2a說明表面整合Gd的MnOL納米粒子膠體(右)較等濃度MnOL納米粒子(左)有增強的rl弛豫率；圖2b說明錳核心和釓放置在磷脂膜表面的兩種方案:釓可以通過不同長度的偶聯配體(或稱短連接物或長連接物)連接到粒子表面；
[0028]圖3為錳-釓納米粒子(MnOL-Gd NC)的物理化學性質表徵；
[0029]圖3a為1.25mol % MnOL-Gd納米粒子的透射電鏡圖像；圖3b為透射電鏡測量粒子尺寸分布；圖3c為原子力顯微鏡測得納米粒子高度；圖3d為固定內核層油酸錳的含量，分別改變表面螯合的Gd-DOTA-ΡΕ和Gd-DTPA-BOA的含量所得到的納米粒子粒徑、多分散係數及表面電荷；圖3e為相同錳濃度，表面不同釓濃度的MnOL-Gd納米粒子rl弛豫率柱形圖比較，磷脂膜包裹的MnOL濃度為10% v/v,粒子表面物質中整合不同濃度Gd-DTPA-BOA或Gd-DOTA-ΡΕ ;金屬含量用摩爾％表示，弛豫率通過回歸直線的斜率土標準誤表示；動態光散射法測得膠體粒徑值，用納米(nm)表示；zeta電位用毫伏(mV)表示；
[0030]圖4a_b虛線箭頭所指曲線代表MnOL-Gd-NC濃度_ /[目號曲線，而空心箭頭所指曲線代表MnOL-NC濃度-信號曲線，圖4c表格列出不同樣本中的金屬離子和NC的弛豫率，單位為(s.mmol)；
[0031 ] 圖5A為體外補體激活CH50法檢測，顯示相對於正常人血清或對照組NC，MnOL-Gd-NC沒有引起補體激活；而陽性對照樣本(例如30mol % Gd-DOTA-ΡΕ或50mol %DOTAP -PE的PFC-NC)明顯激活補體系統；圖5B為C3a酶聯免疫吸附試驗顯示了相似的結果；相對於陰性對照組小鼠，MnOL-Gd NC幾乎不引起補體激活，雖然在表面整合1.25mol%和2.5mol % Gd-DOTA-ΡΕ的MnOL-Gd NC檢測組出現了小的改變，但改變具有統計學意義；這些改變相對於陽性對照組(α νβ3-靶向性20mol%Gd DOTA-PE NC和50mol % DOTAP-PENC)很微小；
[0032]圖6A為1.25mol% Gd-DOTA-ΡΕ MnOL NC的示意圖，說明NC核心是由懸浮在聚山梨酯80中的高濃度MnOL小分子組成，表面由磷脂膜包裹，並偶聯親脂性螯合劑；通過高度特異性靶向內皮細胞表達的整合素α νβ 3的喹諾酮類結構的多肽類似物偶聯到PEG2000上，通過一種修飾後的磷脂錨定在NC表面活性物質上，從而實現NC靶向整合素α ν β 3的功能化；圖68為測定水合粒徑為138 ±10 (Dav)/nm，多分散性係數為0.06 ;圖6(:為NC的掃描電鏡圖像，圖6D為原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)圖像,粒徑測量結果與電鏡結果一致；
[0033]圖7A到E為典型的高脂飲食飼養的兔經靜脈注射α ν β 3-Mn0L-Gd NC對比劑120分鐘後，胸部降主動脈管壁信號強化隨時間逐漸增強(採用3D Tlw脂肪抑制、黑血、自旋迴波的掃描序列)；由於掃描序列的黑血功能，從基線圖像到增強後的圖像，胸部降主動脈管腔中始終沒有血池信號的幹擾，因此血管壁的信號強化特異性更強；從基線到注射對比劑2小時後過程中，新生血管的強化信號的空間分布在血管壁中逐漸範圍增大，且強化信號強度逐漸增強；圖7F顯示在120分鐘時間段內該層面橫截段所有像素平均信號增強程度隨時間呈單指數增加，與胸主動脈Tlw信號增強映像圖相一致；
[0034]圖8為高脂飲食飼養兔注射靶向性或非靶向性MnOL-Gd NC,對比正常飲食飼養兔注射靶向性MnOL-Gd NC ；
[0035]上排圖表顯示新生血管係數，下排圖表顯示動脈壁強化百分比的各組對比情況；定量化數據分析結構顯示比較三組新生血管係數(強化像素數X信號強化百分比)和強化像素百分比，注射整合素α νβ 3靶向性MnOL-Gd NC的高脂飲食兔主動脈新生血管強化明顯高於高脂飲食的非靶向組和正常飲食的靶向組；主要對比強化出現在主動脈壁內半部分(主要是斑塊區域)；
[0036]圖9Α為注射α νβ 3-整合素靶向性MnOL-Gd NC後的圖主動脈的蘇木素伊紅(HE)染色結果，而圖9D圖顯示相鄰層面組織切片的螢光成像(ανβ 3-整合素靶向性MnOL-GdNC上標記有Alexafluor 594螢光染料)，納米粒子出現在外膜、基質及增厚的內膜區；圖9Β和E圖顯示高脂飲食飼養的兔動脈粥樣硬化斑塊模型注射非靶向性MnOL-Gd NC後的主動脈的HE染色及螢光成像結果；納米粒子的螢光分布與圖9D圖相似，但每層主動脈切片上分布的含量遠遠低於高脂飲食的靶向成像組；圖9C和圖9F顯示正常飲食飼養兔的主動脈及其外膜的HE染色及螢光成像結果，在外膜中可以觀察到非常稀疏的AlexaFluor 594標記的ανβ 3-整合素靶向性MnOL-Gd NC，基質和內膜層更少(——200 μ m，——200 μ m)；
[0037]圖10為注射整合素α ν β 3靶向性MnOL-Gd NC 6小時後各種組織內Mn2+和Gd3+的含量。

【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例和附圖來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0039]實施例1錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL- (1.25mol % ) Gd-DOTA-PENC)的製備。
[0040]用兩步法合成猛禮雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)。
[0041]1、將360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入1g四水氯化錳(MnCl2.4H20)以及40g油酸鈉(TCI chemical)，80°C下反應14小時，隨後在25V反應4小時，經水洗、鹽洗、Na2SO4乾燥以及旋轉蒸乾除去溶劑後，製備得到二價MnOL，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為4:5:9 ;
[0042]2、在氮氣氛圍下，將1g 二價MnOL懸浮在20mL作為內在基質的失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesqu1leate)中，在141兆帕和4°C條件下,加入磷脂表面活性劑,充分混合，其中所加入的磷脂表面活性劑的終濃度為0.02g/ml，所述的磷脂表面活性劑中含有
1.25mol %的釓螯合物Gd-DOTA-ΡΕ以及98.75mol %的磷脂醯膽鹼；
[0043]3、混合液在37°C超聲浴的條件下反應10h，反應過程中始終保持氮氣氛圍，反應後的溶液在氮氣吹掃下封裝，即製成雜化MnOL-(1.25mol% ) Gd-DOTA-ΡΕ NC。
[0044]實施例2錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL- (1.25mol % ) Gd-DTPA-BOANC)的製備
[0045]用兩步法合成猛禮雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)。
[0046]1、將360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入1g四水氯化錳(MnCl2.4H20)以及40g油酸鈉(TCI chemical)，80°C下反應14小時，隨後在25 V反應4小時，旋轉蒸發除去溶劑後，製備得到二價MnOL，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為4:5:9 ;
[0047]2、在氮氣氛圍下，將1g 二價MnOL懸浮在20mL作為內在基質的聚山梨酯80中，在141兆帕和4°C條件下，加入磷脂表面活性劑，充分混合，其中所加入的磷脂表面活性劑的終濃度為0.02g/ml，所述的磷脂表面活性劑含有1.25mol%的釓螯合物Gd-DTPA-BOA以及98.75m0l%的磷脂醯膽鹼；
[0048]3、混合液在40°C超聲浴的條件下反應0.5h，反應過程中始終保持氮氣氛圍，反應後的溶液在氮氣吹掃下封裝，即得雜化MnOL-(1.25mol% ) Gd-DTPA-BOA NC。
[0049]實施例3錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-(2.5mol % )Gd-DOTA-PENC)的製備
[0050]用兩步法合成猛禮雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體MnOL-Gd NC。
[0051]1、將360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入1g四水氯化錳(MnCl2.4H20)以及40g油酸鈉(TCI chemical)，75°C下反應16小時，隨後在24V反應5小時，旋轉蒸發除去溶劑後，製備得到二價MnOL，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為5:5:8 ;
[0052]2、在氮氣氛圍下，將1g 二價MnOL懸浮在25mL作為內在基質的聚山梨酯80中，在150兆帕和20°C條件下，加入磷脂表面活性劑，充分混合，其中所加入的磷脂表面活性劑的終濃度為0.025g/ml，所述的磷脂表面活性劑含有2.5mol %的釓螯合物Gd-DOTA-ΡΕ以及97.5m0l%的磷脂醯膽鹼；
[0053]3、混合液在37°C超聲浴的條件下反應5h，反應過程中始終保持氮氣氛圍，反應後的溶液在氮氣吹掃下封裝，即得即得雜化MnOL-(2.5mol% ) Gd-DOTA-ΡΕ納米粒子膠體。
[0054]實施例4錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體(MnOL-Gd NC)在MRI中的應用
[0055]1、磁共振成像參數的優化:
[0056]所有MRI均在飛利浦臨床用3.0T磁共振掃描儀上完成，體外實驗應用標準鳥籠式線圈。按照本發明的方法製備表面偶聯不同濃度及類型釓劑(Gd-DOTA-ΡΕ或Gd-DTPA-BOA)的MnOL-Gd NC，如圖2(a-b)顯示了兩種合成方案。Gd-DTPA-BOA通過配對醯基插入脂質膜表面，將釓原子放置在水和粒子界面附近。而Gd-DOTA-ΡΕ中的Gd原子則超越粒子表面，進一步伸入到周圍介質中。
[0057]實驗選擇和優化了順磁性脂質螯合物，磷脂膜表面活化劑混合滴定濃度為0，0.6，
1.25，2.5，5.0,10.0 和 30 摩爾 % 的 Gd-DOTA-ΡΕ 或 Gd-DTPA-BOA0 在 MnOL 製備程序中，二價MnOL是由四水氯化錳(MnCl2.4H20)同油酸鈉在乙醇-水-正己烷混合物(乙醇、水以及正己烷的體積比為4:5:9)中反應80°C 14小時和常溫下4小時製備而成的。MnOL懸浮在作為內在基質的聚山梨酯80或去水山梨糖醇二油酸酯中，在141兆帕和4°C條件下與磷脂表面活性劑充分混合。磷脂表面活性劑內含有上述不同濃度及類型的釓螯合物和不同濃度的磷脂醯膽鹼(PC)，釓螯合物和磷脂醯膽鹼的摩爾百分數之和為100% (圖3a)。同時也製備表面含有相同濃度釓，核心由杏仁油為粒子核心的NC作為對照試劑。
[0058]NC弛豫時間測量採用Look-Locker翻轉恢復序列(回波時間/重複時間/角度:
1.48ms/3000ms/10° ;採集矩陣:272像素X 270像素；層厚:6mm ;信號平均數:4 ;解析度:0.4mmX 0.4mm)。180°預脈衝後，採集21個梯度回波圖像，相位間距53ms ;所有的測量均重複3次。橫向弛豫時間的測定採用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)序列(潤流自旋迴波參數TSE factor:30 ;回波時間/重複時間/角度:40ms/132ms/90° ;採集矩陣:204像素X 204像素；層厚:6mm ;信號平均數:4 ;解析度:0.8mmX 0.8mm)。金屬離子濃度和NC濃度rl和r2弛豫率均通過線性最小二乘法弛豫率回歸線與錳離子、釓粒子濃度或NC濃度對應函數求得。
[0059]為進行光學成像，示蹤納米粒子膠體(NC)在組織中的位置，在上述製備得到的納米粒子表面的磷脂膜上分別整合0.5m0l%偶聯AlexaFluor 594的己醯基磷脂醯乙醇胺(Life Technologies ；Avanti Polar Lipids),具體方法如下:
[0060]將偶聯AlexaFluor 594的己醯基磷脂醯乙醇胺溶於DMF中，加入溶於氯仿中的磷脂分子羧基化的上述製備得到MnOL-Gd NC，在氬氣氣氛下反應5小時，通過TLC板檢測反應進行程度，所得溶液加入氯仿溶劑進行減壓蒸餾濃縮，獲得的粗產物通過凝膠過濾色譜純化，純化後的產物真空乾燥，得到在粒子表面的磷脂膜上整合0.5mol % AlexaFluor 594的複合NC。
[0061]在上述NC中，經電感偶合等離子體發射光譜儀(ICP-0ES，PerkinElmer, Waltham, MA)測定核心的猛和表面禮濃度。原子力顯微鏡(NanotechnologyResearch Facility, Washington University)測定額定粒子尺寸。Zeta Plus 儀(Brookhaven Instrument Corp., Holtsville, NY)測量粒子 ζ 電位。
[0062]測量結果:
[0063]圖3e顯示MnOL-Gd NC在整合很低濃度Gd-DOTA-PE的情況下即可達到很高的弛豫率。Gd-DTPA-BOA可以達到相似的rl弛豫率，但需要更高的釓螯合劑負荷。整合Gd-DTPA-BOA的NC可以觀察到T2*效應，在表面濃度為30mol %也可以觀察到。Gd-DOTA-PENC在5m0l%濃度時測量rl也早期的預示了 T2*效應引起的弛豫率的下降。超低表面濃度的Gd-DOTA-ΡΕ從0.6至5mol%產生的rl弛豫率相似，均接近峰值。
[0064]因此，作為一種典型代表，選用雜化MnOL-(1.25mol% ) Gd-DOTA-PENC進行進一步研究，其動態光散射測得流體粒子直徑138±10nm，(多分散性指數:0.06)，負性ζ電位(-27±2mV)(圖3)。在這種NC中，經電感偶合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)測得核心的錳濃度為20.2±0.02mM Mn/ml，相對應為每個NC中約含124，000個錳原子。表面釓負荷為0.36±0.02mM Gd/ml，相對應為每個NC中約含1700個釓原子。原子力顯微鏡觀察NC的無水形態證實錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子為球形。
[0065]2、弛豫率的測定
[0066]用反轉恢復序列(如Look - Locker 法:D.C.Look, D.R.Locker, Rev SciInstrum.1970, 41，250-251.)在25°C條件下對樣本進行3.0T MR單層掃描，計算系列濃度稀釋樣本的離子濃度(單位濃度金屬離子)和粒子濃度(單位濃度NC)對應的rl弛豫率；同樣，用多回波自旋迴波法測量r2弛豫率(圖4)。離子濃度和NC濃度弛豫率(rl和r2)通過線性最小二乘法測錳和釓離子濃度或NC濃度對應弛豫率的斜率測得。比較rl和r2弛豫率來確定能實現最優化rl和rl/r2比率的最小釓濃度。3.0T磁場25°C條件下MnOL-GdNC的MR弛豫率，包括錳原子核和釓原子成分對NC弛豫率的各自貢獻，均通過相應金屬等摩爾濃度和相同NC濃度條件下進行測量。雜化MnOL-Gd NC的MR弛豫率比起不含釓的MnOL、只表面含釓(核心不含錳)以及將MnOL NC和只含Gd不含錳的NC按MnOL-Gd NC內Mn與Gd相應濃度比例混合的這三種NC進行比較。(圖4c)。
[0067]MnOL NC與表面僅含釓核心不含錳的NC混合樣本的粒子濃度弛豫率是607，504± 13，578 (s.mmol [MnOL+Gd-only NC])-1),非常接近測得的 MnOL NC 弛豫率同表面僅含釓核心不含錳的NC的弛豫率二者之和，而雜化MnOL-Gd NC的弛豫率為748，199 ±30，464 (s.mmol [ManOL-Gd NC])-1，較上述兩種NC混合後的弛豫率提高25%以上，這表明在雜化MnOL-Gd NC表面偶聯的三價釓離子和核心的二價錳離子之間存在著磁性協同作用，而這種協同作用明顯的受到釓粒子的位置相對於NC表面距離的影響。將三價釓離子的位置向外伸出、略遠離NC表面將在兩種順磁性金屬之間產生增強的磁性相互作用，而將三價釓離子的緊貼近NC與周圍水分子接觸表面時，兩種順磁性金屬之間的磁性相互作用明顯減弱。MnOL-Gd粒子、MnOL粒子和MnOL與僅含Gd的粒子混合樣本的金屬離子濃度和NC濃度下的r2弛豫率相近似。正是基於這個優化實驗，我們選擇表面帶有1.25mole%Gd (Gd-DOTA-ΡΕ)的 MnOL-Gd NC 進行進一步研究。
[0068]3、MnOL-Gd NC的補體激活實驗
[0069]3.1準備抗體敏感的綿羊紅細胞(sheep erythrocytes, EA,方法參照2000年Morgan等人的研究)
[0070]將5ml 阿爾塞弗溶液中的綿羊紅細胞(Colorado Serum Company, catalog#31112)清洗三遍，並懸浮在50ml達爾貝科PBS溶液(DPBS ；Sigma, St.Louis, MO)中，然後等分在兩個離心管中。同時將 100μ1 溶血素(Haemolysin, Cedar Lane Labs, catalog#CL9000)加入50ml DPBS中製備敏感抗體。細胞與抗體分別在37°C孵箱中預先孵育10分鐘，然後將25ml敏感抗體分別加入到每管細胞中，輕輕震蕩。將細胞-抗體混合物放入孵箱中的搖床上在37°C孵育30分鐘，然後將離心細胞在50ml濃度為1mM EDTA緩衝液中洗滌兩次，在含有0.1M鹿糖的明膠佛羅那緩衝液(gelatin veronal buffer, GVB2+)中洗漆兩次。細胞在含有0.1M蔗糖的40ml GVB2+中懸浮，在4°C條件下儲存2周。在正式檢測之前，將敏感細胞洗滌2次，用4°C 3-4倍體積的GVB2+中懸浮。
[0071]3.2補體激活-納米粒子膠體依賴性C活化/50%補體溶血活性(50% complementhemolytic activity, CH50)分析
[0072]用表面偶聯0.6、1.25 和 2.5mol % Gd-DOTA-ΡΕ 的 MnOL-Gd NC 進行 CH50 溶血試驗，以檢測NC對補體激活的影響。為了定量化NC激活人體補體的能力，我們比較了 NC處理過的血清和未處理的對照組血清溶解抗體敏感性綿羊紅細胞的能力。最終NC(10% ν/ν)與加入到含有Mg2+和Ca2+明膠佛羅那緩衝液(GVB2+)中，其內有含量為10%混合人血清(CompTech:Tyler, TX)，總體積為150 μ 1，在37°C條件下孵育30分鐘。然後將反應混合物放入4°C冰箱中冷卻，用GVB2+溶液稀釋至800 μ I。通過一系列反應繪製滴定曲線，每個反應包含150 μ I不同比例稀釋的上清液，其內加入體積為100 μ I的5Χ 17抗體敏感的綿羊紅細胞(sheep erythrocytes, EA)。反應在37°C孵箱中震蕩一小時，再用667 μ I的GVB2+溶液稀釋後進行離心(1000g，5min)。細胞裂解程度通過測量A414來確定。由EA混合水的對照反應測得完全細胞溶解的值。NC處理後血清的殘餘活性與僅用緩衝液處理的血清的殘餘補體活性進行比較。Z值是每個細胞裂解位點的平均數。所用公式為Z =-1n (1-y)，其中I是細胞溶解分數。CH50等於導致50%細胞裂解的血清稀釋因子(Z = 0.69)。
[0073]3.3活體動物C補體激活_C3a酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)。
[0074]採用小鼠尾靜脈注射PBS溶液(對照組)或按體重注射5 μ 1/gMnOL-Gd NC (實驗組)30分鐘後採集血漿進行C3a ELISA。進行C3a ELISA的細胞培養板用抗小鼠C3a (4 μ g/mL)單克隆抗體(BD Pharmingen)覆蓋後在4°C冰箱中過夜。用I %牛血清白蛋白封閉後，細胞培養板與樣品(100 μ I新鮮血漿按1:100稀釋)在室溫下共同孵育2小時，隨後加入生物素化的抗小鼠C3a(250ng/ml)單克隆抗體(BD Pharmingen)。將鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(400ng/ml ;Sigma),過氧化物-色原體溶液(R&D Systems)加入每孔中孵育,用色譜儀 SpectraMax Plus reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif)在 450nm 讀數。小鼠重組C3a(BD Pharmingen)用於建立標準曲線。
[0075]4、結果
[0076]4.1新型雜化金屬MnOL-Gd NC的合成、優化及特化
[0077]通過多種分析技術方法特化MnOL NC。動態光散射法檢測在本實驗中應用的MnOL-Gd NC 粒子水合半徑為 138± 10nm(多分散性指數(polydispersity indexes, PDI)為 0.06) ο 基於 Zeta Plus 儀(Brookhaven Instrument Corp., Holtsville, NY)測量粒子ζ電位，測得的負電勢U)值為(-27mV±2mV)證實粒子穩定性和磷脂膜包裹成功。納米粒子膠體的核心是二價MnOL，濃度是2.93±0.02mM Mn/ml，等同於每個NC含有165718個Mn2+原子，NC的表面是親脂性Gd-DOTA，濃度是0.1lmM Gd/ml，等同於每個納米粒子膠體含有1372個Gd3+原子，體積百分比是1.25mole%0
[0078]能夠反映應用1.25mol % Gd螯合物醯胺偶聯的MnOL NC後，每個結合位點(即單個NC)實現的信號效果，測量及計算得出MnOL-Gd的金屬離子基和NC基弛豫率如下:MnOL-Gd NC rl金屬離子基和NC基弛豫率分別為7.8±0.3 (秒.毫摩爾[Mn+Gd])-1和955148.3±86971.9(秒.毫摩爾[MnOL-Gd NC]);r2金屬離子基和NC基弛豫率分別為85.7±1.2 秒.毫摩爾[Mn+Gd])' 4018318.5±320493.4(秒.毫摩爾[MnOL-Gd NC])'
[0079]4.2人血清中補體激活檢測實驗:
[0080]在體外人血清中用表面整合有0.6、1.25和2.5mole % Gd (Gd-DOTA-ΡΕ)的MnOL-Gd NC分別進行50%補體溶血活性(CH50法)補體激活溶血實驗[K.Whaley, Methodsin complement for clinical immunologists.New York:Churchill Livingstone ；1985，77-139]。在該方法中，強補體激活反應造成完整血清補體C3及其他補體成分的裂解和清除，通過測量血清裂解綿羊抗體敏感性紅細胞(ery throcy te-ant ibody-complement, EA)能力，來判定與納米材料孵育過的血清中殘餘補體的活性。本實驗合成的ManOL-Gd NC與下述的陰性和陽性對照進行比較，未經過納米粒子孵育過的正常人血清以及與表面未經過功能修飾的NC共同孵育的血清作為兩種陰性對照，表面偶聯30mOl%Gd-DOTA-ΡΕ的ανβ3靶向性全氟化碳納米粒子膠體(PFC NC)以及表面偶聯50%陽離子N-[1-(2，3- 二油醯基氧)丙基]-N，N, N-三甲氨甲基硫酸酯NC(簡稱DOTAP)-磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)的PFC NC作為兩種陽性對照。圖5A顯示，在體外，分別與表面帶有0.6,1.25和2.5mole% Gd (Gd-DOTA-ΡΕ)的MnOL-Gd NC共同孵育的血清中存留補體的活性與陰性對照組相比沒有明顯差異(p>0.05)。與之相對照的是，表面攜帶30mol % Gd-DOTA-ΡΕ的PFC NC孵育的血清中補體活性與陰性對照組相比明顯降低(ρ〈0.05)，加入50mol % DOTAP - PE的PFC NC的陽性對照引起的補體激活程度最高(p〈0.01)，實際上血清中補體成分已經完全耗竭。
[0081 ] 4.3活體小鼠補體激活實驗
[0082]為了證實和進一步延伸體外實驗的結果，(共計33隻小鼠，每個實驗組彡5隻)採用C3a酶聯免疫吸附實驗進一步驗證表面整合有0.6,1.25和2.5mole% Gd(Gd-DOTA-PE)的MnOL-Gd NC誘導補體激活的能力，即致敏性。以往的文獻已經證實這種活體動物模型非常適宜檢測材料的補體激活特性。按每公斤體重5μ I的量分別向各組檢測小鼠尾靜脈注射 MnOL-Gd NCs、α ν β 3-靶向性 Gd-DOTA-ΡΕ (20mol% )PFC NC 或者 50 % DOTAP-PE PFC NC。這些臨床前動物注射劑量是臨床患者常規注射劑量(lul/kg)的5倍以上。注射對比劑30分鐘後處死動物，通過測量補體C3a的產生來判斷補體激活情況(見圖SB^Pham C等已經報導了 20moI % Gd-DOTA-ΡΕ PFC NC和50% DOTAP-PE PFC NC可以在小鼠體內引起強烈的補體激活，而本研究中接受表面各種低濃度釓螯合劑(0.6,1.25和2.5mole% Gd-DOTA-ΡΕ)偶聯的MnOL-Gd NCs注射的小鼠引起的補體激活反應與陽性對照組相比都是可以忽略的。與陰性對照組小鼠相比，注射0.6mol% Gd-DOTA-ΡΕ MnOL-Gd NCs組小鼠沒有增加C3的裂解，而1.25和2.5mol% Gd-DOTA-ΡΕ MnOL-Gd NCs組小鼠出現的C3激活出現輕度增加，雖然這種與陰性對照組的差別是有統計學意義的，該結果也說明了這種活體檢查方法的敏感性和準確性。
[0083]綜合上述體外人血清實驗和活體小鼠實驗結果，均表明表面偶聯低濃度Gd-DOTA-ΡΕ以增強MnOL NC弛豫率的方法對補體激活的影響與陰性對照組相比是輕微的，可以忽略不計的，與陽性對照組相比，補體激活的強度明顯減低。
[0084]實施例5整合素α ν β 3靶向性MnOL-Gd NC在新生血管成像中的應用
[0085]1、方法
[0086]在選擇用於活體成像的納米粒子(L 25mol% Gd-DOTA-NH2-PE MnOL-Gd NC，簡稱MnOL-Gd NC)的磷脂膜表面偶聯濃度為0.5mol % AlexaFluor 594標記的己醯基-磷脂醯乙醇胺(Life Technologies ；Avanti Polar Lipids),用於組織突光顯微鏡成像。電感率禹合等離子體光學發射光譜法(ICP 0ES, Perkin Elmer)證實Mn和Gd的濃度。
[0087]為實現靶向性，在粒子表面偶聯0.1摩爾％整合聚乙二醇2000磷脂醯乙醇胺的整合素ανβ3拮抗物(美國密蘇裡州聖路易斯市kereos公司)和98.65摩爾％的磷脂醯膽鹼(PC)，0.1摩爾％喹諾酮衍生的整合素α νβ 3多肽類似物拮抗物通過聚乙二醇2000偶聯到磷脂醯乙醇胺上，見圖6，具體製備方法包括如下步驟:在氮氣氛圍下，將1g 二價MnOL懸浮在20mL作為濃縮劑的失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesqu1leate)中，在141兆帕和4°C條件下，加入磷脂表面活性劑，充分混合，所述的磷脂表面活性劑包括0.1摩爾％甲萘醌二甲嘧啶亞硫酸鹽-聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(MPB-PEG-DSPE)、0.1摩爾％的整合素ανβ3拮抗物(美國密蘇裡州聖路易斯市kereos公司)、1.25摩爾％的釓螯合物Gd-DOTA-ΡΕ和98.55摩爾％的磷脂醯膽鹼。混合液在37°C超聲浴的條件下反應1h,反應過程中始終保持氮氣氛圍，反應後的溶液在用氮氣吹掃下封裝，即得表面偶聯0.1摩爾％整合聚乙二醇2000磷脂醯乙醇胺的整合素α νβ 3拮抗物、1.25摩爾％的釓類螯合物Gd-DOTA-ΡΕ以及98.65摩爾％的磷脂醯膽鹼的整合素α ν β 3靶向性錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體。
[0088]新生血管靶向結合物選用由勃列斯多.邁耶.施貴寶醫學成像公司開發的ανβ3-整合素喹諾酮非肽類拮抗配體(美國專利號6，511，648和相關專利)，最初的研究曾經報導過應用銦111 (111In)-DOTA共軛RP476和靛青染料Cy5.5類似物TA145。每個靶向納米粒子上約含有300個ανβ3-整合素拮抗配體，半抑制濃度(IC50)為50皮摩爾(Kereos, Inc., St.Louis, MO, USA)。以往的研究,利用在血管內全氟化碳納米粒子通過活體競爭性抑制臨床前動物實驗、風溼性關節炎模型及應用基質膠(Matrigel?)嵌入物的RagltmlMom Tg (TIE-2-lacZ) 182-Sato 轉基因鼠(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)中，均研究了這種結合物的靶向特異性。以往的研究也報導了具有這種結合物和表面化學結構的111In-Q νβ 3-整合素靶向性納米粒子的藥代動力學和生物學分布研究結果。
[0089]1.1、高脂飲食飼養紐西蘭大白兔實驗:
[0090]作為可用雜化QvP3-MnOL-Gd NC成像新生血管生成的活體概念佐證，採用0.25%膽固醇含量的高脂飲食飼養12個月的雄性紐西蘭大白兔動脈(Charles RiverLaboratories)粥樣硬化模型中進行斑塊新生血管生成的MR分子成像:其中高脂飲食兔模型16隻，分成兩組，每組8隻，分別通過耳緣靜脈注射整合素α νβ 3靶向性超低濃度(1.25mol % )禮劑偶聯油酸猛納米粒子膠體(α νβ 3_integrin - targetedGd-MnOL-hybrid nanocolloids, α vβ 3-Gd-MnOL_NC)和整合素 ct vβ 3 非革巴向性超低濃度(1.25mol% )禮劑偶聯油酸猛納米粒子膠體(nontargeted(NT)-Gd-MnOL NC);同月齡正常飲食對照組兔模型8隻，通過耳緣靜脈注射α νβ 3-Gd-Mn0L-NC。
[0091]兔經注射基礎麻醉藥後，用2%異氟醚進行維持麻醉。兔胸主動脈斑塊新生血管生成的MR分子成像；各組模型在注射對比劑之前及之後30、60、90和120分鐘用3.0T磁共振(magnetic resonance, MR)採用脂肪抑制、黑血、潤旋自旋迴聲Tlw序列連續成像2小時。掃描參數如下:渦旋迴波係數=30,重複時間/回波時間=380/1 Ims,解析度=250 μ mX250 μ mX4mm, 20層，信號平均數(NSA) = 14，掃描時間約為15.6min。每隻動物的掃描範圍都是從左鎖骨下動脈到膈肌水平的胸主動脈，共20層圖像。流入的血液信號通過放置在成像採集帶上部和下部的預飽和帶屏蔽掉。通過頻率選擇衰減翻轉恢復技術實現脂肪抑制。MR成像後，兔模型經安樂死後，切除主要臟器、主動脈及周圍的外膜進行顯微鏡分析。
[0092]MR圖像處理:採用半自動分段程序處理及平均化所有圖像中胸主動脈的MRI增強信號。簡要的說，採用基於MATLAB (The Mathfforks, Inc., MA)軟體的種子區域生長算法，在每一幅2D圖像中定義主動脈管腔。主動脈壁是由管腔陰影擴張之後通過自動閾值以獲取覆蓋整個主動脈壁的一致和客觀的感興趣區域(ROI)。當經MATLAB算法定義的ROI超出主動脈壁範圍時，通過手動連接R0I，以修正範圍。通常，每隻兔採集圖像組兩端要捨棄2-4幅圖像，主要是由於脂肪抑制不均，或由於線圈位置造成圖像信號衰減。
[0093]每層圖像的信號強度與放在圖像視野內的體外參照物【離心管中密閉的濃度為25mol/l釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)鹽水溶液】相比較後進行標準化處理。注射對比劑2小時後的信號強度和基線信號均與肌肉信號強度相除後進行標準化處理。增強像素的閾值等於基線主動脈壁信號的平均值加2倍的標準差。計算每層圖像增強像素佔ROI總像素的百分比面積，並將最終選定的每隻動物所掃描主動脈的圖像百分比進行平均化。連續增強像素組在平面內或連續平面之間定義為簇。對比強化係數定義為各簇強化像素數乘以該簇內平均強化百分比。將全胸降主動脈對比強化係數相加，作為每隻動物模型的胸降主動脈強化值進行分析。凡是沒有組織病理學結果證實斑塊存在的高脂飲食兔都排除出成像數據統計分析。最終納入成像數據分析的各組動物數分別為:高脂飲食靶向組7隻；高脂飲食非靶向組6隻；正常飲食祀向組8隻。(圖像定量方法可參見文獻:Winter PM, Neubauer AM etal.(2006).^Endothelial alpha(v)beta3integrin-targeted fumagillin nanoparticlesinhibit ang1genesis in atherosclerosis，，.Arter1scler Thromb Vasc B1l26(9):2103-2109.)
[0094]1.2統計分析
[0095]數據統計採用統計分析系統(StatisticalAnalysis System, SAS, Cary, NC)進行方差分析和一般線性模型分析。三組差別p〈0.05認為有統計學意義。定量數據以均數土標準差形式表示。
[0096]1.3通過電感偶合等離子體發射光譜儀體(Inductive Coupled Plasma OpticalEmiss1n Spectrometer, ICP-OES)外定量分析 α v β 3-Gd-MnOL_NC 的生物分布
[0097]在24隻參與實驗的兔模型中隨機抽取9隻動物(每組3隻)，經過量麻醉進行安樂死，切取並稱重主要臟器:肝臟、脾臟、腎臟、肺、心臟、糞便、膽汁、尿液和血液；加熱，並經過1:1:1H20/HF/HN03混合物進行消化，通過ICP-OES檢測各組織中Mn2+和Gd3+濃度，單位用納克金屬/每克組織。
[0098]1.4組織病理和免疫組織化學
[0099]MR成像後，切取對應與MR成像範圍的20cm胸主動脈，等分為5mm每段，在最適切割溫度(Optimal Cutting Temperature, OCT)複合物(Sakura Finetek)中包埋，進行冰凍切片，每層8um，來評價雙模式納米粒子(即偶聯螢光染料的整合素ανβ3靶向性
1.25mol% MnOL-Gd NC)的分布情況。臨近層面切片分別進行蘇木素-伊紅(hematoxylin/eosin, HE)染色用於病理形態學檢測；用LM609 (Chemicon, Temecula, CA)抗體對經丙酮固定的切片進行整合素α νβ 3免疫組織化學染色，這裡需要考慮到注射α νβ 3靶向性MnOL-GdNC的動物血管壁整合素染色會與納米粒子出現競爭性抑制，可能會影響到免疫組織化學染色的準確性。血小板-內皮細胞粘附分子(Platelet-endothelial cell adhes1nmolecule,PECAM)染色採用常規內皮細胞標記物(Clone JC70A, Dako, Carpinteria, CA)。用ABC Elite 試劑盒和 VIP底物試劑盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA)進行染色，並用甲基綠進行對比染色。切片均用Olympus BX61顯微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)進行成像，用Olympus數字圖像軟體進行處理。
[0100]2、結果
[0101]2.1高脂飲食飼養兔模型新生血管生成活體分子成像
[0102]作為活體概念驗證，在高脂飲食飼養12個月的雄性紐西蘭大白兔動脈粥樣硬化模型中評估QvP3-Gd-MnOL-NC檢測和定量新生血管生成的效率。其中高脂肪飲食(飼料脂肪含量達0.25%)雄性紐西蘭大白兔模型16隻，分成兩組，每組8隻，分別通過耳緣靜脈按lml/kg注射整合素ανβ3靶向性超低濃度(1.25m0l% )釓劑偶聯油酸錳納米粒子膠體(α νβ 3-1ntegrin - targeted Gd-MnOL-hybrid nanocolloids, α vβ 3-Gd_Mn0L-NC)和整合素ανβ3非靶向性超低濃度(1.25mol % )釓劑偶聯油酸錳納米粒子膠體(nontargeted (NT)-Gd-MnOL NC)。正常飼料飼養12個月的對照組兔模型8隻,通過耳緣靜脈注射 a J3-Gd-MnOL-NC。
[0103]兔胸主動脈斑塊新生血管生成的MR分子成像；各組模型在在注射對比劑之前及之後30、60、90和120分鐘用3.0T磁共振(magnetic resonance,MR)米用脂肪抑制、黑血、渦旋自旋迴聲Tlw序列連續成像2小時。每隻動物的掃描範圍都是從左鎖骨下動脈到膈肌水平的胸主動脈，共20層圖像。採用以前報導過的特製的半自動分段程序處理及平均化所有圖像中胸主動脈的MRI增強信號。凡是沒有組織病理學結果證實斑塊存在的高脂飲食兔都排除出統計分析組，最終三組實驗動物的數量分別為:高脂飲食靶向組7隻；高脂飲食非靶向組6隻；正常飲食靶向組8隻。
[0104]圖7A-E顯示典型的高脂飲食飼養兔在注射α ν β 3-Mn0L_Gd NC之前和注射後2小時後胸主動脈血管壁對比劑信號漸進性強化。主動脈管腔內對比信號在基線和隨後的時間點都可以忽略不計，表明血管壁信號的改變不會受到循環血池中粒子的幹擾。主動脈壁新生血管Tlw對比強化表現為一種異質性方式，注射後2小時內信號強度及空間分布維度都呈漸進性增加。圖7F顯示在120分鐘時間段內該層面橫截段所有像素平均信號增強程度隨時間呈單指數增加，與胸主動脈Tlw信號增強映像圖相一致。
[0105]在注射ανβ3-ΜηΟΙΧΜ NC的高脂飲食動物組中，各層面整體平均新生血管整體面積百分比(1.8±0.6% )較高脂飲食非靶向組(0.1±0.1% )和正常飲食對照靶向組(0.2±0.1%)相比明顯增高(圖8，p〈0.05)。進一步評估動脈壁內半部新生血管區(即斑塊區)和外半部(即基質和外膜)區信號增強程度，注射CivP3-MnOL-Gd NC的高脂飲食動物組胸主動脈壁外半部新生血管強化程度(0.5±0.2% )較高脂飲食非靶向組(0.0±0.0% )和正常飲食對照靶向組(0.0±0.0% )相比輕度增高(圖8，ρ〈0.05)。而胸主動脈壁內半部新生血管強化程度(4.3±1.9% )較高脂飲食非靶向組(0.6±0.6% )和正常飲食對照靶向組(0.0±0.0% )相比明顯增高了 7倍以上(圖8，ρ〈0.05)。
[0106]新生血管生成指數是信號增強的像素數與所佔主動脈壁的百分比的乘積，使用新生血管生成指數作為評價指標比較實驗室的三組動物，數據顯示注射CivP3-MnOL-GdNC的高脂飲食動物組胸主動脈壁新生血管強化指數(4950±2172)較高脂飲食非靶向組(297±297)和正常飲食對照靶向組(396±138)相比明顯增高(圖9，ρ〈0.05)。主要的強化新生血管生成指數出現在動脈壁內部(a J3-MnOL-Gd NC/高脂飲食組:4248±2172 ；ρ<0.05 ；NT-MnOL-Gd NC/ 高脂飲食組:169 ±169 ； a J3-MnOL-Gd NC/ 正常飲食組:276±123，ρ〈0.05)。動脈壁外部的新生血管生成指數與內膜相比更低，分布方式與內膜相似，但差別沒有統計學意義(α νβ 3-MnOL-Gd NC/高脂飲食組:527±296 ；p<0.05 ；NT-MnOL-Gd NC/ 高脂飲食組:128±128 ; α νβ 3-MnOL_Gd NC/ 正常飲食組:93±68)。高脂飲食非靶向組和正常飲食對照靶向組的血管內外部的新生血管生成指數相似。
[0107]2.2組織病理學
[0108]光學顯微鏡顯示高脂飲食飼養的兔降主動脈血管內膜中度增厚，血管滋養管擴張；而在圖9顯示正常飲食飼養的對照組兔血管未見內膜增厚及血管滋養管擴張的情況。高脂飲食飼養兔的動脈外膜疏鬆，擴張微血管有明顯的血小板-內皮細胞粘附分子染色。對照組兔動脈內膜不厚、基層結構正常、外膜僅見稀疏的血管滋養管。螢光顯微鏡成像顯示Qv^3-MnOL-Gd NC上標記的AlexaFluor 594紅色螢光染料於兔主動脈壁的外膜通過基層分布於斑塊內，而NT-MnOL-Gd的AlexaFluor 594紅色螢光染料在基質和斑塊內累積量不明顯(見圖9)。注射標記AlexaFluor 594的α νβ 3-MnOL_Gd NCs的正常飲食飼養的兔模型動脈壁外膜僅見非常稀疏的螢光信號。在所有高脂飲食飼養兔的組別的主動脈樣本中均可見一些AlexaFluor 594標記的MnOL-Gd納米粒子的表面突光降解物呈塗片樣渾池梯度到達內彈性膜，螢光成像結果與MR對比結果相一致。
[0109]2.3通過電感偶合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)方法體外定量分析Qv^3-Gd-MnOL-NC的生物分布
[0110]為了定量測量a J3-Gd-MnOL-NC的生物分布與清除，我們採用了電感偶合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)方法來定量測定每個器官中Mn2+和Gd3+的含量。如圖10所示，注射MnOL-Gd 6小時後各種組織內Mn2+和GcT的含量。其中糞便中含【Mn2+】達78.63 ±2.28ng/mg(組織)，遠比肝腎濃度含量高(分別為7.03 ± 0.68ng/mg和5.15 + 1.0lng/mg)。
[0111]綜上所述，本發明報導了一種新型的表面整合超低濃度釓螯合劑的軟性MnOLNC結構，可實現高A弛豫率，從而可有效用於快速活體Tlw MR成像血管內皮細胞表達的整合素ανβ3。釓螯合劑增強Γι弛豫率有效性依賴於所用脂質螯合劑的化學結構，以及金屬相對於納米粒子表面積周圍液性環境的相對位置。將濃度僅為1.25mol%的Gd-DOTA-PE偶聯到MnOLNC表面就可以達到遠超過預期的F1弛豫率，表明MnOL NC和Gd-DOTA-PE產生的磁場之間存在協同作用。在活體動物實驗中，這種改進的MR分子成像對比劑可用於在高脂飲食飼養兔動脈粥樣硬化模型中檢測斑塊新生血管生成，信號強化主要出現在兔主動脈血管內部(即斑塊區)，可以通過三維映射圖像直觀顯示新生血管的空間分布。CiJ3-MnOL-GdNC實現活體Tlw對比時使用的釓螯合劑濃度較臨床血管成像批准的濃度減少300倍。除了通過更低的釓螯合劑濃度減少NSF的安全顧慮，在細胞學實驗和活體動物實驗中也證實本發明的一種新型NC實質上消除了補體激活副作用的發生。結合體外細胞學實驗rl高弛豫率、活體對比成像有效性和改善生物安全性表明α νβ 3-MnOL-Gd NC可以作為有效分子對比劑用於定量臨床動脈粥樣硬化斑塊患者新生血管生成成像，特別對於早期篩查有中風風險的中度狹窄頸動脈斑塊患者進行斑塊穩定性預防。
【權利要求】
1.一種錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於所述納米粒子膠體中含有複數個錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子，所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子由內核層和外殼層組成，其中內核層包括二價油酸錳分子以及作為懸浮介質的濃縮劑，外核層由釓螯合物以及磷脂醯膽鹼組成，所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體是通過以下方法製備得到的: (1)在氮氣氛圍下，將二價油酸錳MnOL懸浮在濃縮劑中，在100-300兆帕和0_25°C條件下加入磷脂表面活性劑，充分混合，其中，所述的磷脂表面活性劑中含有釓螯合物和磷脂醯膽鹼； (2)步驟(I)得到的混合液在25°C?55°C超聲浴的條件下反應0.5h?24h，反應過程中始終保持氮氣氛圍，反應後的溶液在氮氣吹掃下封裝，即得錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體。
2.如權利要求1所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於二價油酸錳是通過以下方法製備得到的:二價錳化合物同油酸鈉在乙醇-水-正己烷混合物中先在75-85°C下反應12-16小時，然後在24_26°C下反應3_5小時，除去溶劑後，製備得到二價油酸錳MnOL，所述的乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為3-5:4_6:8-10，優選的，在乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的體積比為4:5:9。
3.如權利要求2所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於所述的二價錳化合物選自氧化錳、氯化錳、二亞乙基三胺五乙酸錳(Mn-DTPA)和二磷酸雙吡哆醛錳(Mn-DPDP)中的一種或多種。
4.如權利要求1所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於所述的濃縮劑為聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或紅花油中的一種或幾種的組合。
5.如權利要求4所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於所述的聚山梨酯為聚山梨酯80。
6.如權利要求1所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於二價油酸錳MnOL的質量(g)與濃縮劑的體積(ml)比為1:1.5-2.5，優選1:2。
7.如權利要求1所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子，其特徵在於所加入的磷脂表面活性劑的終濃度為0.015-0.025g/ml，優選0.02g/ml。
8.如權利要求1所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於所述的磷脂表面活性劑中含有0.l-50mol%的釓螯合物以及50mol% -99.9mol%的磷脂醯膽鹼。
9.如權利要求1或8所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體，其特徵在於所述的釓螯合物包括釓-輪環藤寧四乙酸四乙酸磷脂醯乙醇胺(Gd-DOTA-ΡΕ)、釓-二乙撐三胺五乙酸油酸雙酯(Gd-DTPA-BOA)、禮雙胺(gadodiamide)、馬根維顯(gadopentetatedimeglumine)及禮弗塞胺(gadoversetamide)中的一種或多種。
10.權利要求1-9任一項所述的錳釓雜合雙金屬順磁性納米粒子膠體在製備磁共振成像對比材料中的應用。
【文檔編號】A61K49/18GK104127889SQ201410255471
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】申寶忠, 王可錚, 吳麗娜 申請人:哈爾濱醫科大學