用於蕈菌液體深層發酵控制的方法

2023-05-05 05:41:36 1

專利名稱：用於蕈菌液體深層發酵控制的方法
靈芝(包括紅芝、紫芝等)是我國分布廣、醫學價值高的一類藥用蕈菌。《神農本草經》、《本草綱目》中早有靈芝的記載，它是民間用之已久的中草藥及滋補品。近代化學分析研究表明，它含有許多種功能成份，對中樞神經、循環系統、呼吸系統、肝臟等有重要的扶正培本」作用。近年來，關於靈芝的藥理與生理作用有了更深入的研究及臨床結果，以靈芝為原料所製備的具有藥療或輔療作用的管養藥劑Nutriceutical」愈益受到人們的重視和關注。
靈芝子實體栽培工藝難以實現工業化生產，加之子實體的木質化使其有效成份又很難完全提取而被利用。不斷的研究結果又表明，液體深層培養的菌絲培養物與子實體有相同的臨床效果。而且液體培養過程中胞外代謝產物的有效成份可分泌與保留在培養液中，但是栽培工藝中子實體細胞的有效代謝成份的一部份卻散失到不能被利用的固體栽培基質中。由於上述種種原因，國內外(如日本、東南亞，包括一些西方國家)加強對靈芝類液體深層發酵工藝的研究開發。但是至今其液體發酵工藝仍沿用子實體栽培工藝中菌絲種液搖瓶培養方法放大的分批發酵技術，存在工藝不完善、生產效率低的弊病。
藥用蕈菌(大型絲狀真菌)細胞在液體深層培養體系中的形態學特徵明顯不同於細菌或放線菌，易形成不同分支程度的纖長菌絲，進而菌絲間又發生不同緊密度及空間度的纏繞。培養體系中液流的物理因子與化學因子(液流類型、剪切力、黏度、固相物特性、氣相物特性、基質濃度、酸度等)的幹擾作用可引起菌絲的斷裂、分支特徵的改變，導致細胞生長比速率(單位細胞量的細胞生成速率)的下降；以及由於細胞菌絲自身纏繞成絮團，引起細胞集合顆粒內部的物質傳遞阻力增大，而使內部細胞缺少溶解氧及營養，也導致細胞生長比速率的下降。所以，蕈菌細胞在液體深層培養體系中，生長比速率的控制顯得更為重要。針對蕈菌類絲狀細胞的生理生化、形態及代謝特徵，採用本發明的工藝手段，可以調整蕈菌細胞在液體深層培養體系中生長比速率值在優化控制的範圍內，以提高大型絲狀真菌液體深層培養的細胞生成濃度、細胞生成效率，從而改善發酵水平。絲狀真菌靈芝含有許多種功能蛋白、多糖、有機酸、生物鹼、香豆素、甾麥醇以及甙類等有效生物活性物質，成份複雜，藥效廣泛。取其單一成份，則藥效降低。所以，從藥理學觀點看，藥用絲狀真菌發酵液是一種綜合抗病因子製劑，對於這種複雜的活性因子培養體系，常用菌體生長作為發酵及其代謝過程優劣的相關指標。發酵生產中，由於產品目標不同，有的以細胞生成濃度(即單位體積發酵液中的細胞量)為指標；有的以細胞生成效率(即單位時間內單位體積發酵液中的細胞量)為指標。本發明的實施過程如下。
從發酵工程學觀點，分批發酵是一類封閉式培養體系(即培養過程中無料液的輸入和輸出)。細胞菌絲進入新鮮營養基後的生長比速率在逐步達到最大值後，即隨著培養液中營養基質濃度的下降而明顯降低。採用單元反饋補料控制方法對培養體系輸入新鮮營養基可以不斷改善細胞的基質環境，使細胞菌絲生長比速率保持在一個較佳範圍而持續一段較長培養時間，達到優化目的。採用的方法步驟是按如下給出的培養基。靈芝液體深層發酵以蔗糖為碳源的發酵培養基的組成中，初始蔗糖濃度為0.8-1.5％。培養基中其他組成(％)玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接種培養，培養溫度28℃，pH控制在4.8-5.5。發酵體系中的還原糖濃度降為0.3-0.5％時，開始往發酵體系內流加濃度為15％的蔗糖溶液。發酵過程中每隔4小時(每4小時作為一個單元時間)，取樣離線檢測還原糖濃度，並計算發酵體系該單元時間的平均耗糖速率。據體系中糖濃度的變化速率，反饋調整下一單元時間的補糖速度，使發酵體系中的還原糖維持濃度始終保持在0.6-0.8％範圍內。發酵體系中單元時間平均耗糖速率的計算方法如下由上次取樣時間到這次取樣時間之間的單元時間為4小時。該4小時的平均耗糖速率記為M[克/小時]，
則 M＝(V1)(s1)(1/4)－(V2)(s2)(1/4)＋(d)(v)，設定V1 上次取樣時間的培養液體積[立升]s1 上次取樣時間測得的還原糖濃度[克/立升]V2 這次取樣時間的培養液體積[立升]s2 這次取樣時間測得的還原糖濃度[克/立升]d 流加蔗糖溶液的還原糖濃度[克/立升]v 該單元時間的流加速度[立升/小時]v*下一單元時間的流加速度[立升/小時](其中培養液體積是時間變量，等於初始培養液體積與已補料液體積之和[立升])，然而，調整下一單元時間的流加速度v*＝(M)/(d)。該補料操作持續3-4天，在這培養期間，細胞菌絲生長比速率的變化區間可始終被控制在0.030-0.060(l/h)較佳範圍內。從工藝學觀點，這是一種半開放、變體積的補料發酵操作體系。目前有關靈芝液體深層發酵報導用的都是分批發酵技術，其發酵液中細胞終濃度(純細胞絕對乾重計)為6-10克/立升左右。用上述工藝技術，細胞濃度可較分批發酵的報導值最高增加到2倍以上，細胞生成效率也可較分批發酵提高到1.5倍以上。另外，在目前缺乏即允許在線滅菌、又質量可靠的還原糖測定電極的情況下，該方法更為實用有效。
當然，我們進一步也可以控制細胞菌絲生長比速率維持在一個相同的較佳值，即採用恆定連續液流控制方法，對培養體系以選定速度連續輸入新鮮營養基、同時以相同速度連續輸出發酵液，則可以提供一個基本相同的、良好的細胞生長基質環境，使細胞菌絲生長比速率保持一個相同的較佳值、並持續整個培養時間，達到優化目的。採用的方法步驟是按如下給出的培養基。靈芝液體深層發酵在以工業葡萄糖為碳源的發酵培養基組成中，葡萄糖的初始濃度為0.8-1.2％。培養基中其他組成(％)玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。培養溫度28℃，pH控制在4.8-5.5。接種培養14小時後，開始從培養體系的進料口連續地以恆定速度(料液流動速率)輸入新鮮培養基(配方與初始培養基組成相同)，與此同時以相同恆定速度、連續地由發酵體系向外輸出並收集發酵液，維持發酵體系的恆定體積。料液流動速率值的選擇應滿足如下條件，選用的某一料液流動速率值使相應的某一稀釋率」參數值應在0.030-0.060(l/h)範圍內。
它們的定量關係為[料液流動速率]/[發酵液恆定體積]＝[稀釋率]。
其中，料液流動速率的單位[立升/小時]，發酵液恆定體積的單位[立升]，稀釋率的單位[l/小時]。其結果，細胞菌絲的生長比速率[單位l/小時]可以始終以一個較佳值持續整個培養時間，數值上應等於所選定的稀釋率參數值。這樣，細胞生長比速率被控制在0.030-0.060(l/h)範圍中的一個選擇值上。發酵體系的排出液(即產物)的細胞生成效率可較分批發酵的報導值提高到2倍以上，而分批發酵細胞生成效率值常為0.06-0.08克/立升/小時(以純細胞絕對乾重計)。從工藝學觀點，這是一種全開放、恆體積的連續發酵操作體系。這樣的操作體系，可使生產周期明顯延長，並節約單批生產時的反應器前期處理、種子培養等相應步驟。
本技術的方法特別適用於對靈芝(如赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma sinense)以及姬松茸Agaricus blazei類的工業化生產。為了能達到滿意的結果，使用ALR/ff生物反應器(專利申請號99121894.9)進行上述發酵過程的效果可以更好。
實施例一在2.5立升生物反應器中，培養基初始體積1200ml。發酵培養基組成(％)食用蔗糖1.0，玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB10.0015，自然pH。用PDA培養基培養3天的靈芝(Ganoderma sinense)菌絲搖瓶種液120ml接入反應器中進行培養。當還原糖濃度降至0.5％時，開始用15ml/h的補料速率往生物反應器內連續流加經滅菌的15％食用蔗糖溶液。每4小時作為一個單元時間取樣分析培養體系內的還原糖濃度(常用的DNS測定法)，並計算該單元時間內發酵體系平均耗糖速率值，以此值為依據確定下一單元時間的補料速率，使培養體系內的還原糖濃度始終維持在0.6-0.8％之間。發酵體系中單元時間平均耗糖速率計算及其調整方法見上述「實施過程」的敘述部分。補完800ml補料液後，繼續培養10小時，使還原糖濃度降至0.3％。整個過程可用10％NaHCO3溶液調整pH值，pH控制在4.8-5.5。培養溫度28℃。補料期間細胞菌絲生長比速率可維持在0.032-0.042(l/h)範圍內。發酵周期共5天。發酵液的純細胞絕對乾重濃度可達13.9克/立升。同時，細胞的生成效率為0.111克/立升/小時。
實施例二在2.5立升ALR/ff生物反應器中，裝有發酵培養基1800ml。接種靈芝(Ganoderma sinense)菌絲搖瓶種液200ml(靈芝菌絲搖瓶種液的製備同實施例一)，總體積定為2000ml。發酵培養基組成(％)工業葡萄糖0.8，玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接種培養14小時後用蠕動泵由生物反應器的進料口恆速流加進料(料液組成與初始培養基相同)。與此同時，以相同速率進行排料。保持發酵體系的恆等體積及均勻性。控制進料速率96ml/h，稀釋率即等於0.048(l/h)。經過24-36小時培養後發酵體系逐步達到細胞濃度相對穩定狀態(純細胞絕對乾重維持約3.1克/立升)，收集排出的發酵液(產物)。這樣，穩定連續地維持0.048(l/h)稀釋率的動態物料流，即控制細胞菌絲生長比速率基本恆定為0.048(l/h)、連續培養15天以上。培養溫度及pH控制要求同實施例一。所獲發酵液的細胞生成效率值為0.149克/立升/小時(以純細胞絕對乾重計)。參考文獻1)應建淅等《中國藥用真菌圖鑑》，科學出版社，1987。2)林志彬等《藥學學報》，pP.183-192，Vol.14，No.3，1979.3)趙繼鼎《中國靈芝新編》，科學出版社，1989。4)洪震等《食用藥用菌實驗技術及發酵生產》，中國農業科學出版社，1992。5)閩三弟《食用菌學報》，3(1)21-26，1996。6)高大維等《食品與發酵工業》，23(2)47，1997。7)何來英等《中國食品衛生雜誌》，P.41-44，Vol，9，No，3，1997。8)賀新生等《食用菌學報》，4(2)54-64，1997。9)汪維雲等《中國食用菌》，17(2)1，1998。10)吉田等《發酵工學雜誌》，46125,119(1968)。11)Takuma Sasaki，et al.Chem.Pharm.Bull，19(4)821-826，1971.12)Shoichi Nakashima，et al.Microbiol.Immunol，23(6)501-513,1979.
權利要求
1.一種用於蕈菌液體深層發酵的控制方法，其特徵在於，發酵過程採用控制細胞菌絲生長比速率在0.030-0.060(l/h)的範圍內。
2.根據權利要求1所述的方法，可以用15％濃度的蔗糖溶液對發酵體系連續進行流加補料，使發酵體系的還原糖濃度始終維持在0.6-0.8％之間，達到控制發酵過程細胞菌絲生長比速率在權利要求1規定的範圍內。
3.根據權利要求1所述的方法，可以對同時發生連續進料與連續排料的發酵體系進行液流稀釋率值的控制，達到控制發酵過程細胞菌絲生長比速率在權利要求1規定的範圍內。
4.根據權利要求3所述的方法，是使進料速率恆等於排料速率，發酵液體積保持恆定，
5.根據權利要求1，2，3，4所述的方法，可以在紅芝、紫芝、姬松茸類蕈菌(大型絲狀真菌)的液體深層發酵工藝中使用。
全文摘要
為了克服現今蕈菌類液體深層發酵工藝不完善、生產效率低的弊病。本發明針對蕈菌類絲狀細胞的生理生化、形態及代謝特徵,首先採用控制蕈菌細胞生長比速率的反饋控制補料培養、液流控制連續培養手段,用於藥用蕈菌靈芝類液體深層發酵,以優化大型絲狀真菌液體深層培養的細胞生成濃度、細胞生成效率,從而提高發酵水平。
文檔編號C12N1/14GK1327046SQ00109088
公開日2001年12月19日 申請日期2000年6月6日 優先權日2000年6月6日
發明者龔建華, 王義軍, 杜遵義 申請人:中國科學院微生物研究所