Th1細胞亞群的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用的製作方法

2023-05-05 08:18:36

Th1細胞亞群的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了以CD4+T細胞為主的細胞群和Th1細胞亞群的製備試劑盒和製備方法，以及利用上述方法製得的Th1細胞亞群在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用，屬於生物【技術領域】。本發明採用CD4單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成的培養瓶皿製備以CD4+T細胞為主的細胞群，採用兩種細胞因子組合製備Th1細胞亞群。利用本發明提供的試劑盒和方法，能在單個核細胞中獲得更高比例的CD4+T細胞，獲得的Th1細胞亞群具有很強的免疫活性，能大量分泌細胞顆粒酶B、穿孔素、IFN-γ和TNF-α，具有顯著的抗腫瘤活性。
【專利說明】Thi細胞亞群的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體地，涉及一種Thl細胞亞群的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用。
【背景技術】
[0002]2008年，全球因惡性腫瘤而死亡的人數達760萬(約佔所有死亡人數的13% )，預計2030年全球因惡性腫瘤而死亡的人數將超過1310萬。數據顯示，全世界20%的新發惡性腫瘤病人在中國，24%的惡性腫瘤死亡病人在中國。儘管近年來手術、放療、化療以及其他治療技術來不斷發展，但是惡性腫瘤的復發、轉移或者耐藥等問題一直沒有得到根本解決。隨著腫瘤學和免疫學的不斷進步，對腫瘤的發生發展機理研究的不斷加深，腫瘤的免疫治療越來越受到各國醫學界的重視。單克隆抗體藥物、DC疫苗藥物、細胞信號傳導通路抑制藥物等新型抗腫瘤藥物不斷湧現，自體免疫細胞治療技術在腫瘤的綜合治療中也逐漸發揮著作用，並取得了矚目的成績。
[0003]自體免疫細胞治療技術分為特異性免疫細胞治療，如樹突狀細胞(DC)、腫瘤浸潤性T淋巴細胞(TIL)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)等；和非特異性免疫細胞治療，如細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)和自然殺傷細胞(NK細胞)等。研究表明，在國內進行的24項涉及腫瘤CIK治療的臨床研究中，總體有效率達到51.7%。美國國立衛生研究院(NIH)的Rosenberg應用TIL細胞治療轉移性黑色素瘤，獲得了 58%的客觀有效率。2010年4月，美國食品與藥品監督局(FDA)正式批准了首個用於治療惡性腫瘤的DC疫苗-Pixwenge，該疫苗治療去勢抵抗性前列腺癌患者，延長中位生存期約4.1個月，提高3年生存率約8.7 %。這些自體免疫細胞的臨床應用，極大的改善了惡性腫瘤患者生存質量，延長了生存期。
[0004]Provenge是用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)組成的融合蛋白負載惡性腫瘤患者自體富集的血液DC細胞製備而成。該疫苗不僅可以通過MHCI限制性方式將腫瘤抗原信息傳遞給CTL，還可以通過MHC II限制性方式將腫瘤抗原信息傳遞給Thl細胞。Thl細胞可通過Fas / FasL機制直接殺傷腫瘤細胞，還可通過釋放IFN- Y等細胞因子，改善腫瘤微環境，下調Treg細胞表達，進一步刺激CTL，促進其對腫瘤細胞的特異性殺傷反應。Thl細胞在腫瘤的免疫治療，尤其是腫瘤DC疫苗治療中的作用，越來越得到重視。
[0005]T輔助細胞(Th)以細胞表面標記⑶3、⑶4+和TCRa β為特徵，即⑶4+Τ細胞。據其分泌的細胞因子的不同可分為ThO、Thl、Th2和Th3四個亞型。Thl、Th2和Th3細胞均由前體細胞ThO分化而來。未接觸抗原的T細胞被稱為Th細胞前體(Th cell precursor),他們通過接觸天然免疫細胞攝取的抗原而分化成一種不確定的狀態，稱為ThO細胞。ThO細胞既分泌Thl型細胞因子IL-2和IFN-Y，又分泌Th2型細胞因子IL-4，可在不同信號的刺激下分化為Thl或Th2細 胞。Thl和Th2細胞除分泌不同的細胞因子，發揮不同的免疫作用外，他們各自細胞的表面受體也有許多的不同。IL-12、IFN- Y , IL-2等I型細胞因子促使ThO向Thl分化，並抑制Th2細胞分化；而IL-4、IL-10、IL_5、IL-6等II型細胞因子則促使ThO向Th2分化，同時也抑制Thl細胞增殖。TGF-β亦能抑制Thl細胞的分化生長。
[0006]Thl細胞介導細胞免疫且對於免疫介導的腫瘤根除極為關鍵；而Th2細胞介導體液免疫。研究表明，細胞因子作用於細胞表面受體，可引起Th細胞內一系列信號轉導因子(STF)活化，從而發揮其對基因轉錄的調控作用，這一過程主要與JAK / STAT家族有關。如JAK2 / STAT4被IL-12選擇性激活，從而啟動Thl型細胞因子IFN- Y的表達；IL_4選擇性激活JAKl / STAT6，使ThO向Th2方向極化。另一個調節Thl細胞分化的細胞因子是IFN- Y。IFN- Y除了作為Thl效應細胞的標誌外，它本身在維持Thl表型穩定性方面也有重要作用。分化的Thl細胞正常情況下不能轉型而產生Th2型細胞因子，而IFN-Y缺陷鼠的Thl細胞在Th2極化條件下仍保持產生IL-4的能力。最近的研究提供了 IFN-Y的作用機制=IFN-Y誘導轉錄因子T-bet的表達，而後者反過來誘導IFN-Y位點DNasel表達，使IFN-Y等位基因染色體重組進而轉錄激活IFN-Y基因，形成一個正反饋環路。IL-18與IL-12有協同作用，部分是因為增加IL-12對Thl分化的效能，部分是通過增加已分化的Thl細胞中細胞因子的表達。IL-12和IL-18聯合缺失鼠與缺失二者之一的鼠相比有著更為嚴重的IFN- Y缺乏。有資料表明，IL-12能通過STAT4信號傳導通路，增強Thl細胞的增殖和活化。美國學者發現，IL-7和IL-15可通過介導TCR的敏感性，促進Thl細胞的增殖與活化。這些研究，為本發明提供了堅實的理論基礎。
[0007]惡性腫瘤患者的腫瘤微環境錯綜複雜，比如腫瘤局部高表達IL-10、TGF-β、VEGF、IL-6等免疫負性調節因子，或者通過STAT3信號傳導通路激活Treg細胞，或者通過MDSC的免疫抑制作用， 嚴重幹擾體內免疫細胞治療的臨床療效，甚至導致治療失效。體外培養的效應性淋巴細胞，如CIK、NK、CTL、TIL、DC等細胞，能克服體內種種不利因素，提高其增殖能力和殺傷能力、或提高其抗原遞呈功能等。但是這些細胞亞群中的Thl細胞的含量均很低，Thl細胞並未發揮應有的臨床效果。
[0008]儘管Thl細胞在腫瘤的免疫治療中起著重要的作用，但是對於Thl的製備，國內外相關的研究並不多。國內有學者利用胸腺5肽等免疫調節劑輸入人體，可增加外周血中Thl / Th2的比值。國外Thl樣細胞的製備，主要是提取外周血單個核細胞，然後利用免疫磁珠細胞分選技術對⑶4+細胞進行陽性篩選後，利用⑶3 /⑶28ClinEx Vivo DynalBeads (—種CD3、CD28單克隆抗體結合的免疫磁珠)進行Thl細胞培養，所得的Thl細胞百分比高，並且能分泌顆粒酶B和穿孔素等對靶細胞進行直接殺傷。然而，這種培養方案所用來進行CD4+細胞篩選的免疫磁珠細胞分選操作步驟繁瑣，增加了培養過程中汙染的可能性；免疫磁珠雖然可以自動分解，卻不可避免的會有部分免疫磁珠進入人體，有激發機體的免疫排斥反應的可能。另外，利用⑶3 /⑶28ClinEx Vivo Dynal Beads進行細胞培養，Thl佔細胞總數的百分比很高，CTL數目卻非常少，Thl細胞的直接殺傷腫瘤細胞能力要低於CTL細胞，Thl的促CTL特異性殺傷腫瘤細胞的能力也得不到充分利用。而且免疫磁珠產品費用昂貴，會極大的阻礙Thl細胞臨床應用。

【發明內容】

[0009]為解決上述問題，本發明提出了一種用於製備以CD4+T細胞為主的細胞群的試劑盒和以CD4+T細胞為主的細胞群的製備方法，用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的試劑盒和用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的方法，以及製備得到的Thl細胞亞群在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用。
[0010]本發明涉及一種用於製備以CD4+T細胞為主的細胞群的試劑盒，所述的試劑盒含有如下成分:
[0011]⑶4單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料製成的培養瓶皿。
[0012]其中，
[0013]所述的⑶4單克隆抗體為含⑶4單克隆抗體1-10 μ g / mL的包被液；
[0014]所述的0)4單克隆抗體選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種類型。
[0015]本發明還涉及一種以⑶4+T細胞為主的細胞群的製備方法，所述的方法包括如下步驟:
[0016](I)用⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿；所述的培養瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成；
[0017](2)從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個核細胞；
[0018](3)用培養基將步驟⑵獲得的單個核細胞吹打混勻，按2~5X IO6 / mL的濃度種植於步驟(1)用⑶4單克隆抗體包被好的培養瓶皿中，5% C02、37°C條件下孵育2~6個小時，即獲得以CD4+T細胞為主的細胞群。
[0019]其中，
[0020]步驟(1)中，所述的用⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿的方法為:將含1-10 μ g / mL的CD4單克隆抗體的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯製成的培養瓶皿中，將培養瓶皿用錫箔紙包住以避光，平放，4°C孵育過夜；
[0021]步驟(2)中，所述的外周血為採自正常人或腫瘤患者的外周血，或者臍帶血，正常人或者腫瘤患者骨髓；
[0022]步驟(3)中，所述的培養基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
[0023]本發明還涉及一種用於將以⑶4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的試劑盒，所述的試劑盒含有如下成分:
[0024]I~10 μ g / mL CD3mAb和I~10 μ g / mL CD28mAb以及如下任意一種細胞因子
組合:
[0025]第I種細胞因子組合:
[0026]10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2 ；
[0027]第2種細胞因子組合:
[0028]10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2。
[0029]本發明還涉及一種用於將以⑶4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的方法，所述的方法包括如下步驟:
[0030](I)用含有I~10 μ g / mL CD3mAb和I~10 μ g / mL CD28mAb的包被液包被培
養瓶皿，4°C避光孵育過夜；
[0031](2)將以⑶4+T細胞為主的細胞群用含500~3000U / mL IFN- Y的培養基調節成I~5X IO6 / mL的細胞懸液後轉入步驟⑴中用⑶3mAb和⑶28mAb過夜包被的培養瓶皿中，5% C02、37°C條件下孵育過夜，得到以激活的⑶4+T細胞為主的細胞群；
[0032](3)收集步驟⑵中獲得的以激活的CD4+T細胞為主的細胞群，使用含有下述任一種細胞因子組合的培養基，調節成I~3X IO6 / mL的細胞懸液，種植到培養瓶皿中:
[0033]第I種細胞因子組合如下:
[0034]10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2 ；
[0035]第2種細胞因子組合如下:
[0036]10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2 ；
[0037]每2~3天，加入和之前使用的培養基相同的培養基，維持細胞密度在I~
2X IO6 / mL ;第14天即得到所述的Thl細胞亞群。
[0038]其中，
[0039]步驟(2)中所述的以⑶4+T細胞為主的細胞群優選採用上述的以⑶4+T細胞為主的細胞群的製備方法獲得；
[0040]步驟(2)和步驟(3)中所述的培養基為GT-T551 / AIM V / X-VIV0培養基。
[0041]利用上述方法製備得到的Thl細胞亞群在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0042]本發明的有益效果為:
[0043]利用本發明提供的用於製備以CD4+T細胞為主的細胞群的試劑盒和以CD4+T細胞為主的細胞群的製備方法能在貼壁單個核細胞中獲得更高比例的CD4+T細胞，從而有利於減少雜質細胞對其轉化為Thl細胞亞群的影響；利用本發明提供的用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的試劑盒和用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的方法能獲得的Thl細胞亞群具有很強的免疫活性，能大量分泌細胞顆粒酶B、穿孔素、IFN- Y和TNF- α，具有顯著的抗腫瘤活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1是本發明實施例2中，流式細胞儀檢測的貼壁單個核細胞中CD4+T淋巴細胞所佔百分比；其中，圖1A表示用CD4單克隆抗體包被培養瓶皿法獲得的貼壁的單個核細胞中CD4+T細胞佔比；圖1B為用普通的單個核細胞提取法獲得的單個核細胞中CD4+T淋巴細胞佔比；
[0045]圖2是本發明實施例3中，流式細胞儀檢測的CD4單克隆抗體包被培養瓶皿法結合⑶3mAb和⑶28mAb包被培養瓶皿法以及兩種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群的情況；圖2A表示用第I種細胞因子組合的結果；圖2B為用第2種細胞因子組合的結果；
[0046]圖3是本發明實施例4中，免疫印跡法檢測得到的Thl細胞亞群中Thl細胞顆粒酶B和穿孔素表達情況。
【具體實施方式】
[0047]下面結合附圖和具體的實施例對本發明做進一步的說明:[0048]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0049]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0050]實施例1:⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿法製備以⑶4+T細胞為主的細胞群
[0051](1)將含1-10 μ g / mL的⑶4單克隆抗體的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料製成的培養瓶皿中，將培養瓶皿用錫箔紙包住以避光，平放，4°C孵育過夜；其中，使用的CD4單克隆抗體類型可為IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種；
[0052](2)第I天，無菌條件下抽取健康人或腫瘤患者外周血，或取採血初步分離(即單採)得到的正常人或腫瘤患者的外周血單個核細胞，或採集臍帶血，或採集骨髓，轉入50mL離心管中，加入等體積生理鹽水稀釋，獲得經稀釋的樣品；再按經稀釋的樣品與淋巴細胞分離液的體積比2:1或1:1的比例，將經稀釋的樣品轉至淋巴細胞分離液上方，慢升慢降(升I降O)，2000轉/分離心20-30分鐘；然後小心吸取白膜層，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS洗滌兩次，即得到單個核細胞；
[0053](3)用培養基GT-T551 / AIMV / X-VIV0將步驟⑵獲得的單個核細胞吹打混勻，按2~5X106 / mL的密度種植於步驟(1)用⑶4單克隆抗體包被好的培養瓶皿中，5% C02、37 °C條件下孵育2~6個小時；然後吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS輕柔衝洗培養瓶皿壁3次 ，吸棄上清；
[0054](4)使用0.25%胰酶消化細胞，然後收集細胞，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS洗滌細胞3次，收集沉澱細胞，即為以CD4+T細胞為主的細胞群；或者採用細胞刮等進行細胞收集也可。
[0055]其中，本實施例採用的培養基GT-T551購自TAKARA，AM V購自LIFE，X-VIVO購自LONZA0
[0056]上述利用⑶4單克隆抗體包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料製成的培養瓶皿所獲得的CD4+T細胞的純度與普通單個核細胞提取法獲得的CD4+T細胞相比的優點將通過實施例2來進一步詳細說明。
[0057]實施例2:利用實施例1所述的CD4單克隆抗體包被培養瓶皿法能在單個核細胞中獲得更高比例的CD4+T細胞
[0058](1)將按照實施例1步驟(2)所述的方法製備得到的單個核細胞分成如下兩組:
[0059]第I組:⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿法:
[0060]將單個核細胞按2~5X 1O6 / mL的密度種植於按照實施例1步驟⑴所述的方法製備的用CD4單克隆抗體包被的聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成的培養瓶皿中；5% CO2、37°C條件下孵育2~6小時後，吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS衝洗瓶皿壁，獲得以CD4+T細胞為主的細胞群；
[0061]第2組:普通的單個核細胞提取法:
[0062]直接收集按照實施例1步驟(2)所述的方法製備得到的單個核細胞；
[0063](2)分別將步驟(1)獲得的兩組細胞用⑶4-FITC標記，用流式細胞儀檢測(結果見圖1)。
[0064]從圖1可知，第I組⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿法獲得的貼壁細胞中⑶4+T細胞百分比約為57.6% ±7.3% (如圖1A所示)，而第2組的該比例為32.4% ±8.4% (如圖1B所示);[0065]因此，利用實施例1所述的CD4單克隆抗體包被培養瓶皿法，與普通的單個核細胞提取法相比獲得的單個核細胞中CD4+T淋巴細胞百分比更高。
[0066]本實施例中CD4-FITC抗體購自BD Bioscience。
[0067]實施例3:
[0068](1)用含有I~10 μ g / mL CD3mAb和I~10 μ g / mL CD28mAb的包被液包被培
養瓶皿，4°C避光孵育過夜；
[0069](2)將按照實施例1中的方法製備得到的以⑶4+T細胞為主的細胞群用含500~3000U / mL IFN-Y 的 GT-T551 / AIM V / X-VIV0 培養基調節成 I ~5X106 / mL 的細胞懸液後轉入步驟(1)中用⑶3mAb和⑶28mAb過夜包被的培養瓶皿中，5% C02、37°C條件下孵育過夜，得到以激活的CD4+T細胞為主的細胞群；
[0070](3)收集步驟(2)中獲得的以激活的CD4+T細胞為主的細胞群，使用含有下述任一種細胞因子組合的、含1%~5%自體血漿或AB血漿的GT-T551 / AIM V / X-VIVO培養基，調節成I~3X106 / mL的細胞懸液，種植到培養瓶皿中:
[0071]第I種細胞因子組合如下:
[0072]10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2 ；
[0073]第2種細胞因子組合如下:
[0074]10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2 ；
[0075]每2~3天，加入和之前使用的培養基相同的培養基，維持細胞密度在I~2X IO6 / mL ;第14天，即獲得Thl細胞亞群；分別收集用上述兩種不同的細胞因子組合刺激培養後獲得的Thl細胞亞群，用流式細胞儀進行如下檢測:
[0076]分別使用CD3-FITC、CD8-PE、y -1FN-CYS, IL-4-CYS 或 CD25-PE 和 CD127-FITC 對上述兩組細胞進行染色，然後分別用流式細胞儀檢測。檢測結果見圖2。
[0077]由圖2A1、2A2和圖2B1、2B2可知:採用第I種細胞因子組合(10~IOOng / mLIL-7U0 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2)能獲得Thl細胞百分比85%以上的Thl細胞亞群；採用第2種細胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2)能獲得Thl細胞百分比60%以上的Thl細胞亞群；
[0078]由圖2A3和圖2B3可知:採用第I種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群中，Th2細胞所佔百分比在1%以下；採用第2種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群中，Th2細胞所佔百分比在3%以下；
[0079]由圖2A4和圖2B4可知:採用第I種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群中，Treg細胞所佔百分比為O ;採用第2種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群中，Treg細胞所佔百分比在I 以下；
[0080]綜上，圖2說明了:利用實施例1所述的⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿法結合本實施例的⑶3mAb和⑶28mAb包被培養瓶皿法以及第I種細胞因子組合(10~IOOng / mLIL-7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~100ng/mL IL-12,500 ~1000U / mL IL-2)或第 2 種細胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL-18,500 ~ 1000U / mL IL-2)刺激法，能獲得 Thl 細胞佔比很高、Th2和Treg雜質細胞佔比極低的Thl細胞亞群，且使用第I種細胞因子組合時，Thl細胞佔比更高。
[0081]其中，IL-7、IL-15、IL-18、IL-12和 IFN-Y 購自 PEPROTECH ;IL_2 購自濟南泉港；⑶3單克隆抗體和⑶28單克隆抗體購自Ebioscience。
[0082]實施例4 =Thl細胞亞群中Thl細胞顆粒酶B和穿孔素免疫印跡檢測
[0083](I)收集實施例3步驟(3)中第14天收集的經兩種不同的細胞因子組合刺激培養後獲得的Thl細胞亞群，用帶有CD4標籤的免疫磁珠分選得到Thl細胞；
[0084]同時，用帶有⑶4標籤的免疫磁珠分選使用實施例2步驟(1)第2組實驗所述的普通的單個核細胞提取法獲得的細胞中的Thl細胞；
[0085]免疫印跡法檢測上述兩組Thl細胞的顆粒酶B和穿孔素表達情況。檢測結果見圖3。
[0086]圖3中，第11組為採用實施例3步驟(3)中的第I種細胞因子組合後獲得的Thl細胞的顆粒酶B和穿孔素表達情況結果圖；第12組為採用實施例3步驟(3)中的第2種細胞因子組合後獲得的Thl細胞的顆粒酶B和穿孔素表達情況的結果圖；第21組為採用實施例2步驟(1)第2組實驗所述的普通的單個核細胞提取法獲得的細胞中的Thl細胞的顆粒酶B和穿孔素表達情況的結果圖。
[0087]結果顯示，第11組和第12組的Thl細胞，可以表達顆粒酶B和穿孔素，且第11組比第12組的顆粒酶B和穿孔素的表達量均更高；而第21組基本不表達顆粒酶B和穿孔素。
[0088]因此，使用本發明提供的⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿法結合⑶3mAb和⑶28mAb包被培養瓶皿法以及第I種細胞因子組合(10~IOOng / mL IL-7、10~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2)或第 2 種細胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL-18、500~1000U / mL IL-2)獲得的Thl細胞亞群中的Thl細胞具有更高的活性，同時，使用第I種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群中的Thl細胞活性更高。
[0089]實施例5:Thl細胞亞群中Thl細胞的IFN- Y和TNF- α表達檢測
[0090](I)收集實施例3步驟(3)中第14天收集的經兩種不同的細胞因子組合刺激培養後獲得的Thl細胞亞群，用帶有CD4標籤的免疫磁珠分選得到Thl細胞；
[0091]同時，用帶有⑶4標籤的免疫磁珠分選使用實施例2步驟⑴第2組實驗所述的普通的單個核細胞提取法獲得的細胞中的Thl細胞；
[0092]Elisa法檢測上述兩組Thl細胞的IFN- Y和TNF- α表達情況。檢測結果見表1。
[0093]表1中，第11組為採用實施例3步驟(3)中的第I種細胞因子組合後獲得的Thl細胞的IFN- Y和TNF- α表達情況；第12組為採用實施例3步驟(3)中的第2種細胞因子組合後獲得的Thl細胞的IFN- Y和TNF- α表達情況；第21組為採用實施例2步驟(1)第2組實驗所述的普通的單個核細胞提取法獲得的細胞中的Thl細胞的IFN-Y和TNF-α表達情況。
[0094]結果顯示，第11組和第12組的Thl細胞，表達的IFN-Y和TNF-α顯著高於第21組的Thl細胞，且第11組比第12組的IFN-Y和TNF-α的表達量均更高。
[0095]因此，使用本發明提供的⑶4單克隆抗體包被培養瓶皿法結合⑶3mAb和⑶28mAb包被培養瓶皿法以及第I種細胞因子組合(10~IOOng / mL IL-7、10~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL-18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2)或第 2 種細胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~100ng/mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2)獲得的Thl細胞亞群中的Thl細胞具有更高的活性，同時，使用第I種細胞因子組合獲得的Thl細胞亞群中的Thl細胞活性更高。
[0096]表1
[0097]
【權利要求】
1.一種用於製備以CD4+T細胞為主的細胞群的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒含有如下成分: CD4單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料製成的培養瓶皿。
2.根據權利要求1所述的用於製備以CD4+T細胞為主的細胞群的試劑盒，其特徵在於，所述的⑶4單克隆抗體為含⑶4單克隆抗體1-10 μ g / mL的包被液；所述的⑶4單克隆抗體選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種類型。
3.—種以CD4+T細胞為主的細胞群的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)用CD4單克隆抗體包被培養瓶皿；所述的培養瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成； (2)從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個核細胞； (3)用培養基將步驟(2)獲得的單個核細胞吹打混勻，按2~5XIO6 / mL的濃度種植於步驟(1)用⑶4單克隆抗體包被好的培養瓶皿中，5% C02、37°C條件下孵育2-6個小時，即獲得以CD4+T細胞為主的細胞群。
4.根據權利要求3所述的以CD4+T細胞為主的細胞群的製備方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述的用CD4單克隆抗體包被培養瓶皿的方法為:將含l-ΙΟμ g/mL的CD4單克隆抗體的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯製成的培養瓶皿中，將培養瓶皿用錫箔紙包住以避光，平放，4 °C孵育過夜。
5.根據權利要求3或4所述的以CD4+T細胞為主的細胞群的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的外周血為採自正常人或腫瘤患者的外周血，或者臍帶血，正常人或者腫瘤患者骨髓；步驟(3)中，所述的培養基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
6.一種用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒含有如下成分: 1~10μ g / mL Q)3mAb和I~10 μ g / mL Q)28mAb以及如下任意一種細胞因子組合: 第I種細胞因子組合: .10 ~IOOng/mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~100ng / mL IL-18、10 ~100ng /mL 1L-12、500 ~1000U / mL IL-2 ； 第2種細胞因子組合:
.10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~.1000U / mL IL-2。
7.一種用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)用含有1~10μ g / mL⑶3mAb和1~10 μ g / mL⑶28mAb的包被液包被培養瓶皿，4°C避光孵育過夜； (2)將以⑶4+T細胞為主的細胞群用含500~3000U/ mL IFN- Y的培養基調節成I~.5 X IO6 / mL的細胞懸液後轉入步驟(1)中用⑶3mAb和⑶28mAb過夜包被的培養瓶皿中，.5% C02、37°C條件下孵育過夜，得到以激活的⑶4+T細胞為主的細胞群； (3)收集步驟(2)中獲得的以激活的CD4+T細胞為主的細胞群，使用含有下述任一種細胞因子組合的培養基，調節成I~3X106 / mL的細胞懸液，種植到培養瓶皿中:第1種細胞因子組合如下: . 10 ~100ng/mL IL-7、10 ~100ng / mL IL-15、10 ~100ng / mL IL-18、10 ~100ng /mL IL-12、500 ~1000U / mL IL-2 ； 第2種細胞因子組合如下: .10 ~100ng / mL IL_7、10 ~100ng / mL IL_15、10 ~100ng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2 ； 每2~3天，加入和之前使用的培養基相同的培養基，維持細胞密度在1~2 X IO6 /mL ;第14天即得到所述的Thl細胞亞群。
8.根據權利要求7所述的用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的以CD4+T細胞為主的細胞群採用權利要求3至5中任一項所述的以CD4+T細胞為主的細胞群的製備方法製備得到。
9.根據權利要求7所述的用於將以CD4+T細胞為主的細胞群製備成Thl細胞亞群的方法，其特徵在於，步驟(2)和步驟(3)中所述的培養基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO培養基。
10.利用權利要求7至9中任一項所述的方法製備得到的Thl細胞亞群在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用。
【文檔編號】A61K35/14GK103911341SQ201410036359
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】羅昀, 曾鋼, 張立媛, 王敏傑 申請人:山東迪博生物技術有限公司