一種中藥荊芥抗肺癌活性成分的質量控制方法與流程

2023-05-05 08:10:21

本發明屬於中藥領域，尤其涉及一種中藥荊芥抗肺癌活性成分的質量控制方法。

背景技術：

肺癌是目前發病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌中80%是非小細胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC），病理上以鱗癌、腺癌和大細胞癌為主。近年來，肺癌的發病率和死亡率正在迅速上升，雖然手術治療、放射治療、化學治療、免疫治療及綜合治療等都取得了長足發展，但肺癌患者5年的生存率僅為15%，因此尋找有效的抗肺癌藥物與方法，徹底攻克肺癌，一直是世界醫學界重要的研究課題之一。

在我國，中藥擁有幾千年研究和應用歷史，以其獨特的療效和巨大的開發潛能引起了廣泛的關注。荊芥，為常用中藥之一。又名「假蘇」，土名「姜芥」，《神農本草經》中列為中品，屬於唇形科植物植物荊芥的乾燥地上部分，具有解表、透疹等藥理作用。臨床文獻調研發現：其主要化學成分大體可以分為黃酮、多糖、揮髮油、酚酸等幾大類，其中黃酮類化合物具有顯著的抗腫瘤活性。

中藥作為一個複雜而多元化的體系，對其進行全方位的質量控制一直屬於一個技術性難題。而指紋圖譜的出現，從整體上對藥材質量提供了有效的控制手段。目前，中藥指紋圖譜已成為國內外廣泛接受的全面評價多維組分複雜樣品質量模式的一種方法，美國FDA在植物藥製品指導原則中允許申報者提供產品的色譜指紋圖譜資料，德國藥用植物學會、英國草藥典、印度草藥典以及加拿大藥用級芳香植物協會也都把指紋圖譜作為質量控制標準的內容之一。指紋圖譜反映的是藥材提取物的整體特徵，所以在保證整體的前提下，針對其色譜峰與藥效之間建立聯繫具有一定的實際意義。

在荊芥研究過程中，發現了一種製備高純度荊芥總黃酮的方法，並且在抗腫瘤方面藥效良好（專利號201410397261.1），具有較好的開發價值。為了更好地控制其在抗肺癌方面的質量，保證臨床用藥的安全性和有效性，亟需開發一種全面、合理、系統和有效的控制中藥荊芥抗肺癌活性成分質量的方法。

技術實現要素：

為了解決上述技術問題，本發明提供一種中藥荊芥抗肺癌活性成分的質量控制方法。該方法可以全面、合理、系統和有效的控制中藥荊芥抗肺癌活性成分的質量。

為實現上述目的，本發明提供一種以藥效學為導向的中藥荊芥抗肺癌活性成分多指標成分的質量控制方法，包括步驟如下。

（1）供試品溶液的製備。

分別稱取9批不同產地荊芥藥材粉末（過四號篩），置圓底燒瓶中，精密加入75 %乙醇溶液，回流提取，每次1 h，合併3次濾液（絹布過濾），用水稀釋成生藥所需的藥液，過HPD-400型大孔吸附樹脂，上樣濃度0.8 g/mL（生藥和溼樹脂比），用2倍柱體積（BV）水洗除雜，用70%乙醇洗脫，重複上柱二次，收集洗脫液，搖勻，經濾膜濾過，即得供試品溶液。

（2）高效液相色譜條件。

Agilent poroshell SB-C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流動相：體積分數為0.02%的甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），程序梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；檢測器：二極體陣列檢測器（DAD）；檢測波長：330 nm。

（3）特徵色譜峰的提取。

根據對照指紋圖譜（R）中峰面積滿足定性及定量要求的色譜峰進行提取，保留時間分別為：8.4 min， 9.7 min，12.7 min，13.2 min，17.1 min，20.2 min，25.6 min，26.3 min，29.8 min，31.5 min，33.9 min，38.1 min，42.5 min，46.6 min，47.0 min，51.0 min，53.2 min，62.2 min，68.9 min。

（4）灰色關聯分析。

將提取得到的特徵色譜峰峰面積作為子序列，肺癌細胞的凋亡壞死率（%）作為母序列進行灰色關聯軟體分析，得到不同色譜峰抗肺癌作用的關聯繫數。

（5）對照品溶液的製備。

分別精密稱取香葉木素對照品、木犀草苷對照品、槲皮苷對照品、橙皮苷對照品、木犀草素對照品、芹菜素對照品、迷迭香酸甲酯對照品2.47 mg、1.48 mg、11.08 mg、17.84 mg、2.91 mg、2.68 mg、8.73 mg，置於10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻製成儲備液，精密吸取儲備液1 mL置於10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻，即得香葉木素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、迷迭香酸甲酯濃度分別為0.0247 mg·mL-1、0.0148 mg·mL-1、0.1108 mg·mL-1、0.1784 mg·mL-1、0.0291 mg·mL-1、0.0268 mg·mL-1、0.0873 mg·mL-1的混合對照品溶液。

（6）色譜峰指認。

利用UPLC-Q-TOF/MS技術手段對特徵峰進行色譜峰歸屬，並通過質譜中保留時間、分子離子峰、碎片離子峰的分子量匹配得出以下信息：6號峰為木犀草苷，10號峰為槲皮苷，11號峰為橙皮苷，12號峰為迷迭香酸甲酯，16號峰為木犀草素，18號峰為芹菜素，19號峰為香葉木素。

以上色譜峰構成了荊芥醇提物的指紋圖譜特徵，可以對荊芥中所含主要黃酮類成分做出色譜鑑定。

（7）中藥荊芥醇提物中抗肺癌活性成分的含量測定。

分別稱取9種不同來源荊芥藥材粉末約2.0 g，精密稱定（按藥典規定稱取重量應準確至所取重量的千分之一），按上述製備供試品溶液及色譜條件測定峰面積，採用外標法計算樣品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、香葉木素及迷迭香酸甲酯的含量。

本發明具備的有益效果。

本發明是在前期研究的基礎上作進一步的研究。首先，以肺癌細胞A549的凋亡壞死率為評價指標，對9批不同來源的荊芥藥材醇提物進行體外藥效試驗研究；其次，採用高效液相色譜儀，梯度洗脫的方式，建立了荊芥醇提物的HPLC指紋圖譜，並採用灰色關聯分析軟體將藥效指標與提取的色譜峰峰面積進行相關性分析篩選出關聯繫數較大的色譜峰；並採用液質聯用的技術(UPLC-Q-TOF/MS)對荊芥醇提物HPLC標準指紋圖譜中抗肺癌活性關聯度較大的7種色譜峰進行成分指認，並採用高效液相色譜法對7種化學成分進行含量檢測，為其發揮更好抗肺癌的效果提供實驗依據。為抗肺癌藥效方向上的質量控制提供了更全面、更系統的信息。

利用高效液相色譜技術，梯度洗脫，得到荊芥醇提物HPLC指紋圖譜。一方面，指紋圖譜所提供的化學信息豐富，能夠表達該產品的特徵，具有良好的專屬性，以荊芥醇提物中所含成分的指紋圖譜作為一個整體看待避免了只測定單一成分而判定荊芥整體質量的片面性；另一方面，採用UPLC-Q-TOF/MS串聯技術，對荊芥醇提物HPLC標準指紋圖譜中抗肺癌關聯度較大的7種成分進行了指認，有利於對中藥荊芥質量的全方面監控，並一次性測定所指認的7種成分含量，方法簡單、穩定、精密度高、重現性好、易於掌握。

綜上所述，本發明製作該指紋圖譜的方法簡單、準確可靠、能更全面地反映荊芥醇提物的質量，適用於荊芥醇提物在抗肺癌作用方面的質量控制，其測定方法也具有一定的穩定性以及準確性，適用於進一步的質量研究，具有良好的實用性。

附圖說明

圖1 9批不同來源荊芥藥材醇提物的指紋圖譜。

圖2 橙皮苷二級質譜圖。

圖3木犀草素二級質譜圖。

圖4芹菜素二級質譜圖。

圖5 木犀草苷二級質譜圖。

圖6香葉木素二級質譜圖。

圖7槲皮苷二級質譜圖。

圖8 迷迭香酸甲酯二級質譜圖。

圖9混合對照品的液相色譜圖（其中：1-木犀草苷；2-槲皮苷；3-橙皮苷；4-迷迭香酸甲酯；5-木犀草素；6-芹菜素；7-香葉木素）。

圖10供試品溶液的液相色譜圖（其中：1-木犀草苷；2-槲皮苷；3-橙皮苷；4-迷迭香酸甲酯；5-木犀草素；6-芹菜素；7-香葉木素）。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發明作進一步說明。

實施例1。

中藥荊芥抗肺癌活性成分的質量控制方法，具體為荊芥醇提物HPLC指紋圖譜的構建方法。

1.儀器與試藥。

1.1 儀器：NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養箱（德國NUAIRE公司）；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒（Hoechst 33342和PI，碧雲天生物技術研究所，批號：C1056-3）；Nikon ECLIPSE TI倒置螢光顯微鏡（日本Nikon公司）；Agilent 1290 型快速高效液相色譜儀（安捷倫公司）；Agilent 6550 iFunnel Q-TOF質譜（安捷倫公司）。

1.2 試藥：荊芥藥材來源於不同地區的藥房，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑑定本品為才唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的乾燥地上部分。實驗中液相色譜和質譜所用試劑為色譜純和質譜純，其餘所用試劑均為分析純，水為超純水。

2. 方法與結果。

2.1供試品溶液製備。

稱取荊芥藥材粉末40.0g（誤差範圍39.95-40.05 g），精密加入600 mL 75 %乙醇溶液回流提取3次（誤差±0.5 mL），合併濾液，稀釋成生藥濃度為0.1 g·mL-1的藥液，過HPD-400型大孔吸附樹脂，上樣濃度0.8 g·mL-1（生藥和溼樹脂比），用2 倍柱體積（BV）水洗除雜，用9 BV 70%乙醇洗脫，重複上柱二次，收集洗脫液，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2 體外藥效評價試驗。

人肺癌細胞 A549，常規培養於含10 %胎牛血清的DMEM培養液中，在37℃，5 % CO2培養箱內常規傳代培養，取對數生長期的細胞接種於晶片，待細胞貼壁後，根據前期研究的相關數據結果IC50值，用10%胎牛牛血清的DMEM培養液將9種不同來源的荊芥醇提取物分別配製成1.0 mg·mL-1的濃度，以0.2 µL·min-1的流速經蠕動泵灌注入晶片作用24 h，檢測不同來源藥材的藥效差異，結果見表1。

表1 為9個不同來源的荊芥醇提取物的藥效差異。

註：細胞凋亡壞死率%=（凋亡細胞數+壞死細胞數）/全部細胞數×100%。

2.3 指紋圖譜的建立。

高效液相色譜條件：精密吸取供試品溶液2 μL，採用Agilent poroshell SB-C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；流動相：體積分數為0.02%的甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），進行程序梯度洗脫，如下表2。

表2 為程序梯度洗脫對應表。

2.3.1精密度試驗。

密吸取同一供試品溶液2 μL，按上述色譜條件連續進樣6次，測定峰面積值。結果表明，本方法精密度良好，相對保留時間的RSD在0.18~0.23%之間，相對峰面積的RSD在1.28~2.93%之間，RSD均小於5%，說明儀器性能良好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.2穩定性試驗。

製備供試品溶液一份，於室溫放置0，3，6，12，24，48 h，按上述色譜條件，以峰面積為指標進樣分析，記錄指紋圖譜，計算各色譜峰的相對峰面積的RSD。各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.13~0.22%之間，相對峰面積的RSD在2.28~3.91 %之間，結果表明，RSD均小於5%，樣品製備方法穩定性較好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.3重複性試驗。

取同一批藥材粉末6份，精密稱定（按藥典規定稱取重量應準確至所取重量的千分之一），製備供試品溶液，按上述色譜條件進行分析。記錄指紋圖譜，計算各色譜峰的相對峰面積的RSD。各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.58~0.93%之間，相對峰面積的RSD在2.86~3.37%之間結果表明，RSD均小於5%，樣品製備方法重複性較好，符合指紋圖譜的要求。

取供試品溶液按「2.3」項下色譜條件，進行分析檢測，得到 9 個不同來源荊芥藥材的指紋圖譜，如圖1所示。

2.4 特徵色譜峰的提取。

根據對照指紋圖譜（R）中峰面積滿足定性及定量要求的色譜峰進行提取，保留時間分別為：8.4 min， 9.7 min，12.7 min，13.2 min，17.1 min，20.2 min，25.6 min，26.3 min，29.8 min，31.5 min，33.9 min，38.1 min，42.5 min，46.6 min，47.0 min，51.0 min，53.2 min，62.2 min，68.9 min。

2.5 灰色關聯分析。

將提取得到的特徵色譜峰峰面積作為子序列，肺癌細胞的凋亡壞死率（%）作為母序列進行灰色關聯軟體分析。具體的將藥效指標與 19 個色譜峰的峰面積進行灰色關聯分析，得到其對應的關聯繫數，如表3所示。

表3為19 個色譜峰面積的灰色關聯繫數。

在此基礎上，對關聯繫數較大的色譜峰進行成分指認及含量測定。

2.6 對照品溶液製備。

分別精密稱取香葉木素對照品、木犀草苷對照品、槲皮苷對照品、橙皮苷對照品、木犀草素對照品、芹菜素對照品、迷迭香酸甲酯對照品2.47 mg、1.48 mg、11.08 mg、17.84 mg、2.91 mg、2.68 mg、8.73 mg，置於10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻製成儲備液，精密吸取儲備液1 mL置於10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻，即得香葉木素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、迷迭香酸甲酯濃度分別為0.0247 mg·mL-1、0.0148 mg·mL-1、0.1108 mg·mL-1、0.1784 mg·mL-1、0.0291 mg·mL-1、0.0268 mg·mL-1、0.0873 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.7色譜峰的指認。

通過UPLC-Q-TOF-MS質譜獲得的二級數據與對照品相比對進行化學成分的快速鑑定，最終確定了荊芥醇提取物中對抗肺癌藥效貢獻較大（關聯繫數不小于于0.6623）的7種化學成分其中6、10、11、12、16、18、19號色譜峰的碎片離子與對照品碎裂方式一致，如圖2至圖8所示。其鑑定結果如表4所示。

表4 為色譜峰指認結果。

2.8 色譜峰的含量測定。

分別取9種不同來源荊芥藥材粉末約2.0 g，精密稱定（按藥典規定稱取重量應準確至所取重量的千分之一），按供試品溶液的製備方法及色譜條件測定峰面積，供試品溶液及混合對照品溶液的液相色譜圖分別如圖9和圖10所示。並用外標法計算樣品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、迷迭香酸甲酯、木犀草素、芹菜素、香葉木素的含量，結果見表5。

表5 為不同產地荊芥藥材含量測定結果（mg/g）。

綜上所述，分別稱取9種不同來源荊芥藥材粉末，按上述製備供試品溶液及色譜條件測定峰面積，並用外標法計算樣品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、迷迭香酸甲酯、木犀草素、芹菜素、香葉木素的含量，9批來自不同來源的荊芥藥材的醇提物中7種成分含量差異較大，並且藥效差異顯著。在此基礎上，本發明創建了一套完整的荊芥醇提物在發揮抗肺癌活性的應用研究領域的質量控制方法，對於荊芥藥材抗肺癌作用作用上的質量控制尤為重要，具有潛在的應用價值。