一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法

2023-05-05 17:29:46 1

一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法。本發明採用高效液相製備色譜法，色譜條件為：聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色譜柱：MKF-EP-RP，5～12μm，(150～600)×(7.0～20.0)mm(I.D.)，流動相組成為：乙腈∶水＝45～60∶55～40(體積比)，流速為：1.0～3mL／min，檢測波長：229nm；進樣量：20～100μL；本發明克服了矽膠等介質的不可逆吸附以及工藝流程複雜的缺點，經一步分離即可得到98％以上的紫杉醇純品。
【專利說明】一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法
(—)

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效液相製備色譜(HPLC)分離方法，具體涉及一種以聚苯乙烯凝膠色譜介質為載體的分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法。
(二)

【背景技術】
[0002]紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離得到的並且具有廣譜抗癌活性的二萜類化合物。它具有獨特的抗癌機制，對治療卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等多種癌症均有良好的療效。近年來，它已成為天然植物藥物領域中最熱門的新藥，需求量與日俱增。由於紫杉醇主要來源於紅豆杉的樹皮，資源匱乏、含量低微，且臨床應用中對紫杉醇的純度要求較高，因此分離提取得到高純度的紫杉醇將是一個浩大而複雜的工程。在對紫杉醇進行分離純化時常會碰到的一個問題就是紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離。由於這兩種物質的結構非常相似，只有C-13側鏈末端結構不同，因而兩者的色譜行為差別很小，用常規的柱色譜和薄層色譜很難將這二者分開。
[0003]針對紫杉醇與三尖杉寧鹼類紫杉烷類化合物的分析分離，國內外已做了大量研究，並取得了一定的效果，但大多數都採用的是以矽膠基質為色譜柱的高效液相色譜法(HPLC)[參見:田桂蓮，張志強，蘇志國.苯基-矽膠色譜介質的合成及其在紫杉醇提純中的應用.色譜.2001，19(1):47-50]。雖然該色譜柱經過兩步修飾即胺基功能化及苯環衍生化，但仍需經多步分離也僅得到純度不到80%的紫杉醇純品。隨著色譜介質的發展，大孔樹脂[李勇超，楊靖，職明星，等.D4020大孔樹脂提純發酵液中的紫杉醇的研究[J].食品與生物技術學報.2009，29 (5) =710-714]成為了焦點，它是一種有機高分子聚合物吸附劑，且在天然產物的分離純化方面有著廣泛的應用。李勇超等人使用該樹脂提純發酵液中紫杉醇，回收率可達到87%，說明該樹脂能較好的吸附-解吸附紫杉醇，但該工藝過程中使用不同濃度的甲醇和乙醇水溶液分別對樹脂進行吸附和解吸附處理，且僅說明了該方法對去除色素類雜質有明顯效果，未具體指出紫杉醇與其類似的紫杉烷類化合物的分離及純度。中國專利CN1054382C(申請號96102442.9)公開了一種以大孔樹脂分離紫杉醇的方法，即先將紫杉烷類化合物富集在固體吸附劑上，再使用有機溶劑的水溶液進行洗脫，分步收集餾分，濃縮後再次進行柱分離。該方法工藝過程繁瑣，且分離條件未進行優化。為此尋找一種操作簡單且分離條件完善的提取紫杉醇的方法，對於紫杉醇的製備及工業生產具有深遠的意義。
[0004]因此，本發明採用均勻、耐壓和耐酸鹼的聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微球為填料，優化流動相種類和比例，可經一步色譜法使紫杉醇與三尖杉寧鹼達到分離，操作方法簡便、聞效。
(三)


【發明內容】

本發明的目的是克服現有技術的工藝複雜等缺點，介紹了一種簡單的分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法。 本發明的技術方案如下，即一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法，其特點在於採用一種均勻、耐壓、多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為固定相的高聚物製備色譜柱，高效液相製備色譜操作條件為:
a.聚苯乙烯凝膠色譜柱=MKF-EP-RP,5?12 μ m，柱長:150?600，柱徑7.0?20mm(1.D.)；
b.流動相:乙腈/水=40?75/60?25(體積比);乙醇/水=50?75/50?25 ；
c.流速:1.0?3.0mL/min，進樣量:10?200 μ L，柱溫:室溫；
d.採用UV檢測器，檢測波長為229nm。
與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下:
1、整個分析周期短，色譜分離全過程僅約40min。
2、經一步分離即可得到99.1 %純度的紫杉醇，且操作方法簡單。
3、本發明同樣能在常規高效液相色譜儀上進行操作，不限於昂貴的中、低壓製備色譜，因此對儀器的要求低，方法普及性好。
4、在AKTAexplorerlOO製備型色譜儀器上放大製備紫杉醇，可得到98%以上純度的紫杉醇，方法穩定性好。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發明的舉例方法效果圖之一，即具體條件:紫杉醇與三尖杉寧鹼在聚苯乙烯凝膠色譜柱=MKF-EP-RP型製備色譜柱(8 μ m, 300 X 7.8m (1.D.))中的HPLC圖，流動相:乙腈/水=60:40(體積比);流速:lmL/min ;進樣物質分別為供試品_1,_3和4,圖1中1、2分別代表三尖杉寧鹼和紫杉醇。圖1為本發明的舉例方法效果圖之一，其它舉例方法圖不
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圖1液相色譜圖
(五)

【具體實施方式】
實驗器材及試劑:
(1)實驗儀器:
戴安Summit型高效液相色譜系統(美國戴安公司)；AB SCIEXAPI2000LC-MS/MS液質儀；AKTA explorerlOO製備型色譜系統(通用電器醫療集團)；
(2)色譜柱:
MKF-EP-RP 型製備柱:300mmX7.8mm(1.d.)，8ym，兩隻；200mmX8.0mm(1.d.)，8 μ m ;150mmX20mm(i.d.), 10 μ m ;300mmX7.8mm(1.d.), 12 μ m,兩隻；300mmX7.8mm(1.d.), 10 μ m ；MKF-DK-RP 製備柱:150mmX 10mm (i.d.), 12 μ m ；300mmX 10mm (i.d.)，12 μ m ;150mmX 20mm(1.d.), 8 μ m ;300mmX 20mm(1.d.), 12 μ m ;150mmX20mm(i.d.), 12 μ m。(南京麥科菲高效分離載體有限公司)
(3)實驗試劑:
紫杉醇標樣(純度為93.6% );三尖杉寧鹼標樣(純度82.9% );發酵液(紫杉醇含量為33.9% ;三尖杉寧鹼含量為33.3% );色譜純乙醇；色譜純乙腈；高效液相去離子水。供試品的配製: 供試品-1:取發酵液0.5ml至20ml的容量瓶中，用甲醇定容至20ml，待測(現用現配)
供試品-2:取紫杉醇標準品約10mg，精密稱定，用甲醇溶劑定容至10ml，待測(現用現配)
供試品-3:取三尖杉寧鹼標準品約10mg，精密稱定，用甲醇溶劑定容至10ml，待測(現用現配)
供試品-4:取發酵液Iml至20ml的容量瓶中，用甲醇定容至20ml，待測(現用現配)
實施例1
色譜條件:檢測機器:戴安Summit型高效液相色譜系統；
色譜柱:MKF-EP-RP(300mmX7.8mm，8ym);流動相:乙腈(B)/水(A) = 75:25(體積比，以下同上);流速:lmL/min ;檢測波長:229nm ;進樣量:20 μ L ;進樣物質:供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為0.84。
實施例2
色譜條件:檢測機器:戴安Summit型高效液相色譜系統；
色譜柱:MKF-EP_RP(200mmX8.0mm,8 μ m);流動相:乙腈(B)/水(A) = 60:40(體積比，以下同上);流速:lmL/min ;檢測波長:229nm ;進樣量:20 μ L ;進樣物質:供試品_2，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.04。
實施例3
色譜條件:檢測機器:戴安Summit型高效液相色譜系統；
色譜柱=MKF-EP-RP (600mm X 7.8mm, 12 μ m)；流動相:乙腈(B) / 水(A) = 50:50 (體積比，以下同上)；流速:1.5mL/min ;檢測波長:229nm ;進樣量:20 μ L ;進樣物質:供試品-3，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.27。
實施例4
色譜條件:檢測機器:戴安Summit型高效液相色譜系統；
色譜柱:MKF-EP-RP (300mmX 7.8mm, 10 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 40:60 ;流速:1.5mL/min ;檢測波長:254nm ;進樣量:10μ L ;進樣物質:供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.52。
實施例5
色譜條件:檢測機器:戴安Summit型高效液相色譜系統；
色譜柱=MKF-EP-RP (600mmX 7.8mm, 8 μ m);流動相:乙醇(B)/ 水(A) = 75:25 ;流速:1.0mL/min ;檢測波長:254nm ;進樣量:10μ L ;進樣物質:供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為0.92。
實施例6
色譜條件:檢測機器:戴安Summit型高效液相色譜系統；
色譜柱:MKF-EP-RP(300mmX7.8mm，8ym);流動相:乙醇(B)/水(A) = 55:45 ;流速:1.0mL/min ;檢測波長:254nm ;進樣量:10μ L ;進樣物質:供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.36。
實施例7
色譜條件:檢測機器:AKTA explorerlOO製備型色譜系統；
色譜柱:MKF-DK-RP (150mmX 20mm, 8 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 60:40 ;流速:lmL/min ;檢測波長:229nm ;進樣量:10y L ;進樣物質:供試品_4，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.45。
實施例8
色譜條件:檢測機器:AKTA explorerlOO製備型色譜系統；
色譜柱:MKF-DK-RP (450mmX 10mm, 12 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 65:35 ;流速:2mL/min ;檢測波長:229nm ;進樣量:100μ L ;進樣物質:供試品_4，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.17。
實施例9
色譜條件:檢測機器:AKTA explorerlOO製備型色譜系統；
色譜柱:MKF-DK-RP (450mmX 20mm, 12 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 60:40 ;流速:3mL/min ;檢測波長:254nm ;進樣量:200 μ L ;進樣物質:供試品_4，測得紫杉醇與三尖杉寧鹼的分離度R為1.32。
【權利要求】
1.一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法，其特徵在於使用高效液相製備色譜，高效液相製備色譜條件為: ￡1.高聚物色譜柱的選用:聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，粒徑:5?129111，柱長:150?600臟，柱內徑7.0?20麵； 匕流動相:乙腈/水的體積比為40?75 / 60?25 ；或乙醇/水的體積比為55?75 / 45 ?25 ； 0.流速:1.0?3.011^ /砧!!，進樣量:10?200 9匕柱溫:室溫； (1.採用—檢測器，檢測波長為225咖?254111
2.根據權利要求1所述的一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法，其特徵在於所述的高聚物色譜柱為型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色譜固定相充填。
3.根據權利要求1所述的一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法，其特徵在於該方法使用流動相為:乙醇丨水，其體積比為:55?75 / 45?25或乙腈丨水，其體積比為:40?75 / 60?25，可以用等度洗脫，也可以用梯度洗脫方式。
4.根據權利要求1所述的一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧鹼的製備方法，其特徵在於該高聚物色譜柱的選用:柱長:150?300臟，柱內徑9.0?20.0臟；或200-600臟，柱內徑7.0?9.0臟。
【文檔編號】G01N30/88GK104422749SQ201310395925
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】劉曉寧, 黃豔, 魏榮卿 申請人:南京工業大學