一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法
2023-05-05 18:47:31 1
一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法。在體視顯微鏡下，用特製的挑針挑取單個分生孢子轉移到離體葉段上。葉段置於含有苯並咪唑（50ppm）保鮮基質的培養皿中，(17±1)℃下，光暗交替培養7d後形成一至多根孢子鏈，17d後形成直徑約0.5cm的粉黴堆。這種一次性得到純一菌株的技術流程，比普通純化技術減少了至少3個循環，節約20-30d，且這種方法得到的菌株是完全遺傳同質的，為有關小麥白粉病菌的後續研究提供了材料保障。
【專利說明】一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物病理學【技術領域】，涉及一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)的快捷方法,除該種真菌外，也可用於其它白粉菌的純化。
【背景技術】
[0002]1.目前主要採用的技術規程
[0003]普通純化技術為採用單孢子堆純化菌種。將從各地採集的小麥白粉病標樣在隔離條件下抖落接種在新的小麥幼苗上，接種後4~6d檢查麥葉上可見的侵染點，用剪刀剪下具有尚未產孢的單個侵染點的葉段，將其置於含有苯並咪唑保鮮基質的培養皿中，在(17±1) °〇的光照培養箱中(80001x光照，14h/d)培養，待長出分生孢子後，再次接於新的置有小麥葉段的培養皿中，4~6d後再檢查麥葉上可見的侵染點，用剪刀剪下具有尚未產孢的單個侵染點的葉段，再將其置於含有苯並咪唑保鮮基質的培養皿中。此過程需重複3次，然後擴大繁殖，獲得所謂「純化」的單孢子堆菌株。若採回的是單孢子堆，此過程可減少I次。
[0004]用上述單個孢子堆抖落接種後，立即在光學顯微鏡或體視顯微鏡下檢查，發現在同一位點上，既有單個孢子，也有2個或3個呈鏈的孢子，也有多個聚集成團的孢子堆。可見，用上述過程得到的所謂「純化」菌株，實際上並非完全遺傳同質。另外，上述純化程序耗時較長，大約需要45d。這期間需要不斷培養小麥幼苗，一般一個年度往往需要純化的菌株可能達100個以上，這樣一來涉及的工作量很大，佔用的空間很多。由於純化菌株的時間拖得較長，很多材料在不斷轉純的過程中死掉了。
[0005]在此背景下，本發明採用在體視鏡下直接挑取單孢子進行純化的方法，此法大大縮短了純化過程，簡化了程序，而且能獲得完全遺傳同質的菌株。本發明的純化方法，還可適用於其它白粉菌的純化。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種能獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷技術，以便為白粉病菌的相關研究提供遺傳背景一致的菌株。
[0007]基於這一目的，本發明的技術方案為:
[0008]一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法，在體視顯微鏡下，用特製的挑針挑取單個分生孢子轉移到離體葉段上；葉段置於含有苯並咪唑50ppm保鮮基質的培養皿中，(17±1)°C下，光暗交替培養7d後形成一至多根孢子鏈，17d後形成直徑約0.5cm的粉黴堆。
[0009]具體流程:
[0010](1)製作挑針取長約13釐米的竹籤，粗細如牙籤或棉籤，修為光滑的圓柱形，一端削尖後從中剖開一細縫(約1_)，將較粗直的眉毛基部插入縫隙內，留出大約2_的尖端，用萬能膠或透明膠帶固定眉毛基部於竹籤內。[0011](2)保溼小麥白粉病標樣取新鮮小麥白粉病標樣，輕輕抖落老熟的分生孢子一置於保溼器內一(17±1) °C培養24h(80001x光照，12h/d)，待長出新鮮的分生孢子備用。
[0012](3)準備離體葉段將大約2cm長的健康葉段正面向上放置在載玻片的一端，用Marker筆在中間輕劃一個記號,也可不用作記號。
[0013](4)挑取單個分生孢子從新鮮粉黴堆上挑取少量分生孢子抖落在載玻片的另一端上，置於體視顯微鏡載物臺上，在40~60倍下用挑針的毛尖輕輕粘取玻片上的單個孢子，然後再將帶有單個孢子的毛尖輕輕接觸葉片1-2次(解剖鏡下檢查針尖上沒有孢子後，即可確認孢子被挑到葉片上了 ；如果不放心，可在體視顯微鏡下把針尖上的孢子放於葉段的記號旁，此法比前者耗時)。用同樣的方法，也可直接從新鮮粉黴堆上挑取，用針尖輕輕觸碰略彎曲的孢子鏈頂端，將單個孢子粘於針尖，然後把單個孢子放於葉段上。
[0014](5)培養轉移葉段於含苯並咪唑(50ppm)保鮮基質培養皿內一在(17±1)°C的光照培養箱中(80001x光照，14h/d)培養，大約6~7d可見侵染點，將單個葉段轉移於另一培養皿培養，直到出現粉黴堆(其上的孢子即為遺傳同質的後代)。
[0015](6)擴繁將帶此粉黴堆的葉段放置在無菌的載玻片上，再次置於體視顯微鏡下一用挑針從此粉黴堆上挑取任意多的分生孢子一在體視顯微鏡下將分生孢子抖落在健康葉段上，可在一個葉段上多次重複接種，以後一個葉段上可繁殖很多粉黴堆。用此方法只要獲得一個純的粉黴堆，就可繁殖大量的分生孢子。
【具體實施方式】
[0016]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，本發明用以下具體實例進行說明，本發明主要針對小 麥白粉病菌進行快速純化，但本發明不局限於這些具體實施例。具體實施方法如下:
[0017]1、健康麥苗的培育
[0018]選用感病的小麥品種「川農26」或其它感病品種，用75%乙醇浸種3min，無菌水衝洗3次，放入保溼容器內，在22°C下催芽I~2d。在2.5cm直徑、20cm長的大試管中盛入3cm厚的無菌細泥土，再把已催芽的小麥種子播入試管中，每支試管播5-7粒，套上5層紗布或I層過濾膜。(17±1) °C光照培養箱(12h光-暗交替)培養至3葉時備用。
[0019]2、離體葉段的準備
[0020]待小麥葉片中部寬度達到大約5mm時可用於剪取離體葉段。將中部比較平展的葉段剪為長約2cm的葉段備用。
[0021]3、標樣的米集和保存
[0022]於小麥白粉病盛發時期，赴各地採集新鮮小麥白粉菌標樣，抖落上面的老孢子，樣品裝於潔淨的自封袋中，儘快帶回實驗室純化。如果樣品多，可暫時貯存於5°C冰箱中或接種於事先培養好的無菌麥苗上待純化。
[0023]4.保鮮基質的製備
[0024]在無菌培養皿內墊一層濾紙，加入含50ppm苯並咪唑的溶液浸溼。
[0025]5.挑針的製備
[0026]取長約13釐米的竹籤，粗細如牙籤或棉籤，修為光滑的圓柱形，一端削尖後從中剖開約一細縫，將較粗直的眉毛基部插入縫隙內，留出大約2_的尖端，用萬能膠或透明膠帶固定眉毛基部於竹籤內。
[0027]6.單個分生孢子的獲得
[0028]在載玻片的一端放置約2cm長的健康葉段5片，為了便於觀察，可在葉段上用Marker筆做上標記。從新鮮粉黴堆上挑取少量分生孢子抖落在載玻片的另一端，置於體視顯微鏡載物臺上，在40~60倍下用挑針的毛尖輕輕粘取玻片上的單個孢子，然後再將帶有單個孢子的毛尖輕輕接觸葉片1-2次(解剖鏡下檢查針尖上沒有孢子後，即可確認孢子被挑到葉片上了 ；如果不放心，可在體視顯微鏡下把針尖上的孢子放於葉段的記號旁，此法比前者耗時)。用同樣的方法，也可直接從新鮮粉黴堆上挑取，用針尖輕輕觸碰略彎曲的孢子鏈頂端，將單個孢子粘於針尖，然後把單個孢子放於葉段上。受孢子萌發率的影響，一般一個樣品至少做5個重複葉段。將已經獲得單孢子的葉段轉移於含苯並咪唑保鮮基質培養皿內。
[0029]7.培養和觀察
[0030]帶有單孢子的葉段在(17±1) °〇的光照培養箱中(80001x光照，14h/d)培養，大約6~7d可見侵染點，將帶有單個侵染點的葉段轉移單獨培養，避免長出的分生孢子互相擴散，直到侵染點出現粉黴堆(其上的孢子即為遺傳背景一致的後代)。
[0031]8..擴繁
[0032]將單個粉黴堆的葉段放置在無菌的載玻片上，再次置於體視顯微鏡下一用針從此粉黴堆上挑取任意多的分生孢子一在體視顯微鏡下將分生孢子抖落在健康葉段上，可在一個葉段上多次重複接種，以後一個葉段上可繁殖很多粉黴堆。用此方法只要獲得一個純的粉黴堆，就可繁殖大量的分生孢子。
[0033]不同處理的試驗結果
[0034]從表1看出，用自製的眉毛挑針通過挑取單孢子，完成1個樣品5個接種點大約需要5~8min，出現侵染點的時間6~7d，形成粉黴堆大約10~12d。用眉毛挑針比用解剖針所需時間短，主要原因是由於解剖針比眉毛硬，不易粘附孢子，且將孢子移到葉段時容易刺傷葉表皮，不利於白粉菌的侵入；出現粉黴堆的時間比抖落法(對照)約推遲2d，但用抖落法至少還要2~3個循環才能純化菌種，且不能確定繁殖的孢子是遺傳同質的材料。
[0035]從表2看出，用解剖針挑取單孢子成功率較低，主要原因是容易刺傷葉表皮，不利於白粉菌的侵入；用自製的眉毛挑針挑取單孢子成功率較高，達70%以上，如果用單孢子鏈成功率更高，可達85%以上，比用單個粉黴堆抖落接種的成功率更高，由於單個粉黴堆在葉段上端抖落時難以保證孢子能到達葉段上。因此，當材料上孢子量較少時，採用本發明更能提高成功率。
[0036]表1不同純化方法所需時間
[0037]
【權利要求】
1.一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法，其特徵在於，在體視顯微鏡下，用特製的挑針挑取單個分生孢子轉移到離體葉段上；葉段置於含有50ppm苯並咪唑保鮮基質的培養皿中，(17±1)。(^下，光暗交替培養7d後形成一至多根孢子鏈,17d後形成直徑約0.5cm的粉黴堆。
2.根據權利要求1所述的快捷方法，其特徵在於，所述的特製的挑針製作方法為:取長約13釐米的竹籤，粗細如牙籤或棉籤，修為光滑的圓柱形，一端削尖後從中剖開一細縫，將較粗直的眉毛基部插入縫隙內，留出2mm的尖端，用萬能膠或透明膠帶固定眉毛基部於竹籤內。
【文檔編號】C12R1/645GK103805521SQ201410053966
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月17日 優先權日:2014年2月17日
【發明者】龔國淑, 張敏, 陳華保, 梁銀萍, 祁小波, 雷雨, 楊繼芝, 楊春平 申請人:四川農業大學