水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法
2023-05-05 12:22:41
專利名稱：水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法
技術領域：
本發明屬於分析化學領域，更具體涉及一種水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處
理方法。
背景技術：
硝基呋喃類藥物(Nitrofurans)是人工合成的具有5_硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物，它們作用於微生物酶系統，抑制乙醯輔酶A，幹擾微生物糖類的代謝，對常見的革蘭氏陽性菌、陰性菌均有作用，主要適用於腸道細菌感染及原蟲病。硝基呋喃類對光敏感，在生物體內代謝迅速，由於原藥及其在動物體內殘留的代謝產物有致畸、致突變和致癌的危險，出於安全性考慮，歐美等發達國家及我國先後頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。所以在食品安全的檢測中檢測硝基呋喃代謝物。入世後，動物源性食品中抗生素殘留量的檢出已成為世界肉類貿易中的重要技術指標和技術壁壘之一。我國出口歐盟的水產品，如魚蝦等曾被檢出過含有呋喃唑酮、呋喃西林等獸藥殘留，這已嚴重製約了我國水產品的出口。近年來報導了一系列在魚、蝦、貝類等樣品中檢測硝基呋喃類代謝物的檢測方法，其中以酶聯免疫法的報導最多，並有一些商品化的試劑盒出現。然而，酶聯免疫法的缺點也很明顯,一般一個試劑盒只能檢測一種硝基呋喃類代謝物,並且試劑盒的成本較高。因此，目前對硝基呋喃類代謝物的檢測，國際上通用的方法依舊是經2-硝基苯甲醛衍生化後用液相色譜-串聯質譜法測定，而該方法的關鍵是樣品的前處理技術。
發明內容
本發明的目的在於提供一種水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法，經該方法處理後的待測樣品能夠直接用液相色譜-串聯質譜法進行檢測。該前處理方法與現有國標方法相比，具有操作簡單有效、成本低、重現性好等優點，具有很強的可操作性。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
一種水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法包括以下步驟
(1)稱取2.00 g(精確至O. 01 g)水產品於50 mL離心管中；
(2)往上述離心管中加入O.2 mol/L鹽酸15 mL和O. 2wt%鄰硝基苯甲醛-乙腈溶液O. 5 mL，充分渦旋搖勻，在37°C下恆溫振蕩14 16 h ；
(3)將離心管取出，適當冷卻後用pH緩衝液調節pH至7.O 7. 5 ;
(4)往離心管中加入20mL乙酸乙酯,加蓋振蕩萃取3min,在3500r/min離心5min,用塑料吸管將上清液吸取到150mL雞心瓶中，40°C下減壓旋轉蒸發至幹；
(5)用2mL乙腈水(體積比為I :9)溶液和2 mL乙腈飽和正己烷洗脫，洗脫液於15000r/min高速離心分層，取下層清液用O. 25 μ m微孔濾膜過濾，所得濾液即為待測液。所述的水產品包括魚、蝦、蟹。 所述步驟(3)中的pH緩衝液為磷酸鹽緩衝液。所述步驟(4)中的萃取溶液為乙酸乙酯,萃取次數為I次。
本發明的顯著優點為
(1)在國標方法中的衍生劑用二甲亞碸溶解；本發明則用乙腈溶解，可有效減少樣品中的溶劑成分(因為後面會用到乙腈作為洗脫劑)，有利於提高後續步驟的洗脫效果。(2)在本發明中調pH=7_7. 5時採用磷酸鹽緩衝體系，更有利於調酸；而國標方法直接用NaOH調pH。(3)流程中直接用20 mL乙酸乙酯萃取一遍後高速離心取此層濃縮；而國標方法萃取2次,每次用量40mL,萃取後用NaCl水溶液洗漆，乙酸乙酯層過無水硫酸鈉後濃縮。由於目標物分配比大，流程操作方法簡單可行，可有效減少前處理步驟，縮短分析時間。
圖I是本發明的水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法流程圖。圖2是呋喃唑酮代謝物(AOZ )的衍生產物的MRM譜圖。圖3是呋喃它酮代謝物(AMOZ)的衍生產物的MRM譜圖。圖4是呋喃妥因代謝物(AHD )的衍生產物的MRM譜圖。圖5是呋喃西林代謝物(SEM)的衍生產物的MRM譜圖。
具體實施例方式一種水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法包括以下步驟
(1)稱取2.00 g(精確至O. 01 g)水產品於50 mL離心管中；
(2)往上述離心管中加入O.2 mol/L鹽酸15 mL和O. 2wt%鄰硝基苯甲醛-乙腈溶液O. 5 mL，充分渦旋搖勻，在37°C下恆溫振蕩14 16 h ；
(3)將離心管取出，適當冷卻後用pH緩衝液調節pH至7.O 7. 5 ;
(4)往離心管中加入20mL乙酸乙酯,加蓋振蕩萃取3min,在3500r/min離心5min,用塑料吸管將上清液吸取到150mL雞心瓶中，40°C下減壓旋轉蒸發至幹；
(5)用2mL乙腈水(體積比為I :9)溶液和2 mL乙腈飽和正己烷洗脫，洗脫液於15000r/min高速離心分層，取下層清液用O. 25 μ m微孔濾膜過濾，所得濾液即為待測液。所述的水產品包括魚、蝦、蟹。所述步驟(2)中O. 2wt%的鄰硝基苯甲醛配製方法如下稱取160毫克鄰硝基苯甲醛，用光譜純的乙腈溶解後，用同種類的乙腈定容至10毫升。所述步驟(3)中的pH緩衝液為濃度為I. O摩爾每升、pH為7. 4的磷酸鹽緩衝液。所述步驟(4)中的萃取溶液為乙酸乙酯，萃取次數為I次。步驟(5)中的O. 25 μ m微孔濾膜為有機相濾膜。實施例I
以下實施例結合附圖來敘述本發明的具體工作原理
本發明所說的水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法的具體操作流程如圖I所示。首先是待測樣品的稱取、溶解。然後在37 °C下恆溫振蕩1Γ16 h對樣品的硝基呋喃代謝物進行衍生。接下來用I. O摩爾每升、pH為7. 4的磷酸鹽緩衝液調節衍生後的溶液pH至
7.O 7. 5，然後用乙酸乙酯對經衍生後的硝基呋喃代謝產物進行萃取。這一操作將使樣品中的硝基呋喃代謝產物與複雜的樣品基質進行分離。最後再用製備色譜進一步純化經乙酸乙酯萃取物，得到能夠直接進高效液相色譜柱進行分離檢測的產物。具體步驟
(1)稱取2.00 g(精確至O. 01 g)烤鰻樣品於50 mL離心管中；
(2)往上述離心管中加入O.2 mol/L鹽酸15 mL和O. 2%鄰硝基苯甲醛溶液O. 5 mL,充分渦旋搖勻，在37 °C下恆溫振蕩1Γ16 h ；
(3)將離心管取出，適當冷卻後用pH緩衝液調節pH至7.O 7. 5 ;
(4)往離心管中加入20mL乙酸乙酯,加蓋振蕩萃取3min,在3500r/min離心5min,用塑料吸管將上清液吸取到150mL雞心瓶中，40 °C下減壓旋轉蒸發至幹；
(5)用2mL乙腈水(I 9)溶液和2 mL乙腈飽和正己烷洗脫，洗脫液於15000r/min高速離心分層，取下層清液用O. 25 μ m微孔濾膜過濾，所得濾液即可上機測試。精密度對比數據
權利要求
1.一種水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法，其特徵在於所述的前處理方法包括以下步驟 (1)稱取2.OO g水產品於50 mL離心管中； (2)往上述離心管中加入O.2 mol/L鹽酸15 mL和O. 2wt%鄰硝基苯甲醛-乙腈溶液O.5 mL，充分渦旋搖勻，在37°C下恆溫振蕩14 16 h ； (3)將離心管取出，適當冷卻後用pH緩衝液調節pH至7.O 7. 5 ; (4)往離心管中加入20mL乙酸乙酯,加蓋振蕩萃取3min,在3500r/min離心5min,用塑料吸管將上清液吸取到150mL雞心瓶中，40°C下減壓旋轉蒸發至幹； (5)用2mL乙腈與水的體積比為I :9的混合溶液和2 mL乙腈飽和正己烷洗脫，洗脫液於15000r/min高速離心分層，取下層清液用O. 25 μ m微孔濾膜過濾，所得濾液即為待測液。
2.根據權利要求I所述的水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法，其特徵在於所述的水產品包括魚、蝦、蟹。
3.根據權利要求I所述的水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法，其特徵在於所述步驟(3)中的pH緩衝液為磷酸鹽緩衝液。
4.根據權利要求I所述的水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法，其特徵在於所述步驟(4)中的萃取溶液為乙酸乙酯，萃取次數為I次。
全文摘要
本發明公開了一種水產品中硝基呋喃代謝物檢測的前處理方法，該方法包括待測樣品的稱量、溶解、衍生、萃取和層析分離步驟；所用儀器包括恆溫振蕩器、減壓旋轉蒸發儀、矽膠層析柱和高速冷凍離心機；用本方法製備出的樣品溶液可以直接用液相色譜-串聯質譜法進行檢測。該前處理方法與現有國標方法相比,具有操作簡單有效、成本低、重現性好等優點，具有很強的可操作性，有望在環保、商檢及出入境檢驗檢疫等行業大規模推廣應用，具有顯著的經濟和社會效益。
文檔編號G01N30/06GK102621252SQ201210070890
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月19日 優先權日2012年3月19日
發明者陳勁星 申請人:福建中檢華日食品安全檢測有限公司