一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2‑1蛋白細胞株及其構建方法與流程

2023-05-05 10:46:42 2

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株及其構建方法。

背景技術：

呼吸道傳染病是人類感染性疾病中最主要疾病之一，近30年新發傳染病中，約60%都是由呼吸道病毒感染引起，急性呼吸道病毒感染是各年齡段人群重要發病和病死原因。病毒分離培養是鑑定病毒感染的「金標準」，也是病毒後續深入研究中必不可少的一環。M2-1是由呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）基因組中M2基因第一個開放閱讀框編碼的蛋白，是一種重要的轉錄抗終止因子，有提高轉錄效率，增加全長mRNA產量，並促進細胞增值的作用，且體外實驗證實其對RNA序列沒有特異性要求。

技術實現要素：

為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在於提供一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株，該細胞株可以為臨床病毒分離培養提供快速、靈敏、穩定的平臺，並為研究M2-1的轉錄延長因子的特性奠定了工作基礎。

本發明的另一目的在於提供一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株的構建方法，該構建方法成功構建了穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白的細胞株，操作簡便。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株，該細胞株整合了呼吸道合胞病毒M2-1基因，能穩定高效的表達呼吸道合胞病毒M2-1基因。

本發明的另一目的通過下述技術方案實現：一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株的構建方法，包括如下步驟：

（1）利用基因重組技術將呼吸道合胞病毒M2-1基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表達載體中，得到重組表達載體pcDNA-M2-1；

（2）將構建好的重組表達載體pcDNA-M2-1轉染Hep-2細胞，通過G418篩選出陽性細胞株；

（3）對陽性細胞株進行RT-qPCR和Western blot鑑定，得到穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株。

優選的，所述步驟（1）具體為：先根據呼吸道合胞病毒M2-1基因，設計帶有BamHI和XbaI雙酶切位點及保護鹼基的呼吸道合胞病毒M2-1特異引物，再通過RT-PCR反應擴增呼吸道合胞病毒M2-1基因，然後在pcDNA3.1(+)載體的BamHI和XbaI多克隆位點插入呼吸道合胞病毒M2-1基因，得到重組表達載體pcDNA-M2-1。

優選的，所述特異引物的序列為：

上遊引物F：5』-AAAGGATCCATGTCACGAAGGAATCCTTGCA-3』

下遊引物R：5』-AAATCTAGATCAGGTAGTATCATTATTTTTGGCATG-3』。

優選的，所述RT-PCR的反應體系為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL、2×1 Step Buffer 25μL、RSV-LONG 基因組RNA 0.5μg、上遊引物F 0.4μL和下遊引物R 0.4μL，ddH2O補齊至20μL。

優選的，所述步驟（2）具體為：將構建好的重組表達載體pcDNA-M2-1先通過脂質體轉染的方式轉染Hep-2細胞，再通過含G418的培養基篩選出陽性細胞株。

優選的，所述步驟（3）中，得到穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株凍存於液氮中。

優選的，所述步驟（3）中，RT-qPCR的鑑定引物為：

上遊引物F：5』-GCAGAGTTGGACAGAACAGAAGAGTAT-3』

下遊引物R：5』-ACTATTGAGTTCAGTGAGGAGTTTGCT-3』。

本發明的有益效果在於：本發明的細胞株可以為臨床病毒分離培養提供快速、靈敏、穩定的平臺，並為研究M2-1的轉錄延長因子的特性奠定了工作基礎。

本發明的構建方法成功構建了穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白的細胞株，操作簡便。

附圖說明

圖1是呼吸道合胞病毒M2-1的擴增電泳圖。

圖2是重組表達載體pcDNA-M2-1的構建電泳圖。

圖3是重組表達載體pcDNA-M2-1的構建圖譜。

圖4是重組表達載體pcDNA-M2-1的測序圖。

圖5是穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株的RT-qPCR鑑定圖。

圖6是穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株的Western blot鑑定圖。

圖7是Hep-2-2F5細胞增殖分析圖。

具體實施方式

為了便於本領域技術人員的理解，下面結合實施例及附圖1-7對本發明作進一步的說明，實施方式提及的內容並非對本發明的限定。實施例中未註明具體條件的，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商的，均為可以通過市售獲得的常規產品。

見圖1-7，一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株，該細胞株整合了呼吸道合胞病毒M2-1基因，能穩定高效的表達呼吸道合胞病毒M2-1基因。

一種穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株的構建方法，包括如下步驟：

（1）利用基因重組技術將呼吸道合胞病毒M2-1基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表達載體中，得到重組表達載體pcDNA-M2-1；

（2）將構建好的重組表達載體pcDNA-M2-1轉染Hep-2細胞，通過G418篩選出陽性細胞株；

（3）對陽性細胞株進行RT-qPCR和Western blot鑑定，得到穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株。

所述步驟（1）具體為：先根據呼吸道合胞病毒M2-1基因，設計帶有BamHI和XbaI雙酶切位點及保護鹼基的呼吸道合胞病毒M2-1特異引物，再通過RT-PCR反應擴增呼吸道合胞病毒M2-1基因，然後在pcDNA3.1(+)載體的BamHI和XbaI多克隆位點插入呼吸道合胞病毒M2-1基因，得到重組表達載體pcDNA-M2-1。

所述步驟（1）具體包括如下步驟：

1、RT-PCR擴增呼吸道合胞病毒M2-1基因

根據呼吸道合胞病毒M2-1基因，設計帶有BamHI和XbaI雙酶切位點及保護鹼基的RSV M2-1特異引物，再通過RT-PCR反應擴增呼吸道合胞病毒M2-1基因。

所述M2-1的基因序列為：

ATGTCACGAAGGAATCCTTGCAAATTTGAAATTCGAGGTCATTGCTTGAATGGTAAGAGATGTCATTTTAGTCATAATTATTTTGAATGGCCACCCCATGCACTGCTCGTAAGACAAAACTTTATGTTAAACAGAATACTTAAGTCTATGGATAAAAGTATAGATACCTTATCAGAAATAAGTGGAGCTGCAGAGTTGGACAGAACAGAAGAGTATGCTCTTGGTGTAGTTGGAGTGCTAGAGAGTTATATAGGATCAATAAATAATATAACTAAACAATCAGCATGTGTTGCCATGAGCAAACTCCTCACTGAACTCAATAGTGATGATATCAAAAAACTGAGAGACAATGAAGAGCTAAATTCACCCAAGATAAGAGTGTACAATACTGTCATATCATATATTGAAAGCAACAGGAAAAACAATAAACAAACTATCCATCTGTTAAAAAGATTGCCAGCAGACGTATTGAAGAAAACCATCAAAAACACATTGGATATCCACAAGAGCATAACCATCAACAACCCAAAAGAATTAACTGTTAGTGATACAAATGACCATGCCAAAAATAATGATACTACCTGA。

所述特異引物的序列為：

上遊引物F：5』-AAAGGATCCATGTCACGAAGGAATCCTTGCA-3』

下遊引物R：5』-AAATCTAGATCAGGTAGTATCATTATTTTTGGCATG-3』。

所述RT-PCR的反應體系為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL、2×1 Step Buffer 25μL、RSV-LONG 基因組RNA 0.5μg、上遊引物F 0.4μL和下遊引物R 0.4μL，ddH2O補齊至20μL。

RT-PCR的反應程序按照常規條件或製造商建議的條件進行。

2、DNA瓊脂糖凝膠電泳

配置1%的瓊脂糖，微波爐加熱使瓊脂糖顆粒完全溶解；將洗淨、乾燥的制膠板水平放置在工作檯上；混勻，灌膠，插入梳子，避免產生氣泡；待凝膠凝固夠，小心拔去梳子；將膠放入電泳槽中，加入電泳緩衝液；將PCR產物上樣，經100V電泳30min，呼吸道合胞病毒M2-1的擴增電泳圖如圖1所示。

3、PCR產物純化（TaKaRa DNA Fragment purification Kit 4.0）

呼吸道合胞病毒M2-1基因PCR產物與3倍體積Buffer DC混勻，轉移至製備管中，12,000×g離心1min，棄濾液。加入700μL Buffer WB，12,000×g離心1min，棄濾液（重複一次）。向製備管中加30μL Elution Buffer，室溫靜置1min，12,000×g離心1min 洗脫DNA。

4、呼吸道合胞病毒M2-1和pcDNA3.1(+)載體雙酶切

將呼吸道合胞病毒M2-1 PCR回收產物與pcDNA3.1(+)載體分別進行BamHI和XbaI雙酶切。酶切體系於37oC水浴4h，電泳，回收。酶切體系如下：10× buffer 5μL、DNA 1μg、BamHI酶1μL和XbaI酶1μL，ddH2O補齊至50μL。

5、RSV M2-1基因和pcDNA3.1(+)載體連接（TaKaRa Ligation Kit Ver2.1）

將回收後的酶切產物RSV M2-1基因和pcDNA3.1(+)載體在16oC連接1h，得到重組表達載體pcDNA-M2-1。連接體系如下：Solution I 5μL、RSV M2-1 3μL和pcDNA3.1(+) 2μL。重組表達載體pcDNA-M2-1的構建電泳圖如圖2所示，重組表達載體pcDNA-M2-1的構建圖譜如圖3所示。

6、pcDNA3.1-RSVlong M2-1表達載體轉化大腸桿菌TOP10

大腸桿菌TOP10感受態細胞與連接體系混合，冰上孵育30min，熱激90sec，加入無抗LB培養基200μL，37oC震蕩培養1h，塗布於氨苄青黴素LB瓊脂培養基，37oC培養過夜。

7、測序鑑定

挑取單克隆，LB液體培養基37oC震蕩培養10h，抽提質粒，送華大基因測序，重組表達載體pcDNA-M2-1的測序結果見圖4。

所述步驟（2）具體為：將構建好的重組表達載體pcDNA-M2-1先通過脂質體轉染的方式轉染Hep-2細胞，再通過含G418的培養基篩選出陽性細胞株。

所述步驟（2）具體包括如下步驟：

1、重組質粒轉染Hep-2細胞

1)當24孔板中Hep-2細胞密度達90％時，準備轉染，將無血清培養基、Opti-MEM取出復溫並注意平衡好；

2)取出細胞，將培養基換成無血清培養基，放回孵箱培養；

3)取滅菌的EP管，按要求混好質粒（BglII酶切線性化580ng/管），每管加50μL Opti-MEM，混勻；

4)另取EP管，加入lipofectamine 2000（1.5μL/孔）和Opti-MEM（50μL/孔），輕輕混勻後室溫靜置5min；

5)將4中的混合液加入3的EP管中，50μL/孔，混勻；

6)室溫靜置20min，將lipofectamine 2000-質粒混合液滴到24孔板中，100μL/孔；

7)將細胞放回孵箱培養，24h後換回含血清的完全培養基。

2、RSV M2-1蛋白穩定表達細胞株篩選

轉染48h後，加入含有200μg/mLG418的新鮮培養基篩選穩定轉染的細胞。根據需要每隔三天更換含有200μg/mLG418的培養基，篩選14天左右，24孔板中可見陽性細胞簇。挑取陽性細胞簇，稀釋後接種在96孔板中，確保每孔中有一個細胞，繼續用含G418的培養基篩選陽性細胞株。

所述步驟（3）具體為：用Trizol提取陽性細胞簇中的總RNA，進行RT-qPCR鑑定（結果如圖5所示）。對陽性細胞進行擴大培養後提取總蛋白，用M2-1單克隆抗體作為一抗，進行Western Blot鑑定（結果如圖6所示）。最後獲得穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1基因的Hep-2細胞株，命名為Hep-2-2F5。

所述步驟（3）中，得到穩定表達呼吸道合胞病毒M2-1蛋白細胞株凍存於液氮中。

所述步驟（3）中，RT-qPCR的鑑定引物為：

上遊引物F：5』-GCAGAGTTGGACAGAACAGAAGAGTAT-3』

下遊引物R：5』-ACTATTGAGTTCAGTGAGGAGTTTGCT-3』。

RT-qPCR的反應體系和反應程序按照常規條件或製造商建議的條件進行。

本發明進一步通過MTT法分析了M2-1穩定表達細胞株的增殖特性：2×104個細胞/孔接種24孔板，共接種3平行×7天共21孔。每天中午12時每孔加入5mg/mL MTT溶液100μL，37oC度孵育4小時，加入200μL DMSO，室溫震蕩裂解10分鐘。取50μL×3加入96孔板，於OD490測定吸光值（結果如圖7所示）。

上述實施例為本發明較佳的實現方案，除此之外，本發明還可以其它方式實現，在不脫離本發明構思的前提下任何顯而易見的替換均在本發明的保護範圍之內。