一種解澱粉芽孢桿菌及其應用的製作方法
2023-05-09 04:24:46
一種解澱粉芽孢桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種解澱粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）SZ-60，其特徵在於，其保藏號為CGMCC?No.8277。所述菌株在牛肉膏蛋白腖（NB）培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落不規則、乳白色、中心稍隆起、表面溼潤、半透明；鏡檢呈杆狀，大小為0.3～0.4×3.2～3.3μm，具鞭毛，G﹣，有芽孢在含有2%～5%的NaCl的牛肉膏蛋白腖（NB）培養基上均能生長；所述的牛肉膏蛋白腖（NB）培養基的配方為：牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g，NaCl5.0g，瓊脂17g，水1000ml，pH?6.8～7.2。解澱粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）SZ-60對引起人參根腐病、疫病、菌核病、鏽腐病、黑斑病和立枯病的主要病原菌具有顯著拮抗作用。本發明還提供解澱粉芽孢桿菌SZ-60在防治植物真菌病害中的應用，或在製備防治植物真菌病害的微生物製劑中的應用。
【專利說明】一種解澱粉芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種解澱粉芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002]人參(Panax ginseng C.A.Mey)為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是我國的名貴藥材，有「百草之王」的美譽。人參在中國、韓國、朝鮮、俄羅斯等國家有大面積種植，其中，中國東北是人參的主產區，已成為當地的重要支柱產業之一。人參的長期人工種植和品種選育難度大導致人參種質退化、病害嚴重、質量差、產量低。化學農藥的大量使用，導致農藥殘留和環境汙染，降低了人參藥材的安全性和商品價值。病害防控問題已成為制約人參產業可持續發展的重大問題之一。
[0003]人參病害約有20~40種，其中，以下6類病原菌是導致人參常見病害並限制人參產業發展的主要病原菌:由腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)導致的人參根腐病一般發病率在30%左右，六年生人參根腐病造成的死亡率可達50%~80%，主要危害幼苗根部和根莖部(地表以下莖部)，腐爛的參根呈黑褐色溼腐狀，後期糟朽狀，僅存中空的根皮；惡疫黴菌(Phytophthora cactorum)導致的人參疫病發病率可達70%,其症狀為發病輕時葉片上產生不規則的暗綠色斑，重者莖葉枯萎，根部腐爛，植株成片枯死，減產嚴重；人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)導致的人參菌核病主要危害3年生以上參根，發病部位為芽苞、根和根莖，參根被害後，初期在表面生少許白色絨狀菌絲體，以後，內部迅速腐敗、軟化，細胞全部被消解殆盡，只留下壞死的外表皮，表皮內外形成許多鼠糞狀的菌核；人參鏈格孢菌(Alternaria panax)導致的人參黑斑病一般發病率20%_30%，嚴重時達到100%，造成早期落葉，植株枯萎，不結實，參根和參籽減產；立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)導致的人參立枯病是人參苗期主要病害之一，在低溫溼度大的條件下，發展蔓延極為迅速，一般發病率為8~30%，嚴重者可達40%左右，病菌使幼苗在地面3~5釐米乾濕土交界面的莖部縊縮、腐爛，切斷輸導組織，致使幼苗倒伏；毀滅柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)導致的人參鏽腐病嚴重時發病率達70%以上，該病發生於根的各部位，病斑呈鐵鏽色，由點至面擴散至全根，土壤溼度大、透氣不好、腐殖質層厚，發病重。
[0004]長期以來通過使用化學農藥等化學防治措施來防治人參病害遠遠未達到人們預想的效果，而且過量使用化學農藥會破壞土壤的微生態環境，加重環境汙染，也使有毒物質在參根內大量積累，降低人參的使用安全性和商品價值，因此，人們把防治重點逐步轉向生物防治措施和農業防治措施上。在農作物植物保護領域，利用作物根際土壤篩選對病原菌具有顯著拮抗效果的土壤微生物，並製成微生物製劑是生物防控研究的重要手段，也是有益微生物資源開發的重要途徑。
[0005]生物防治是以生態學原理為基礎，利用生物物種間的相互作用，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物。生物防治最大的優點是不汙染環境，沒有農藥殘留，這是農藥等非生物方法防治病蟲害所無法比的。利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技術的重要組成部分，它避免了化學農藥使用帶來的一系列植保、環境和能源方面的問題，避免了農藥殘留對人畜的危害，更重要的是促進了農業的可持續發展。美國已有GB03、MBI600、QsT713和解澱粉枯草芽孢桿菌變種等4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環保局商品化或有限商品化生產應用許可。在德國解澱粉枯草芽孢桿菌變種FZB24被商業化生產，用於控制糧食作物的不同真菌病害。
[0006]芽孢桿菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其種類多分布廣，是土壤和植物微生態的優勢種群。該類微生物通過分泌抗生物質和生長競爭，在防治植物病害方面發揮多種有益作用。目前利用解澱粉芽孢桿菌防治人參真菌性病害未見報導。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於:針對人參生產中的主要真菌性病害，尤其是人參土傳病害發生面積日益擴大，化學藥劑防治除易造成環境汙染和農藥殘留外，防效也不理想的實際情況，提出一種解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株SZ-60及其在分別引起人參根腐病、鏽腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、毀滅柱孢菌(C.destructans)、人參鏈格抱菌(A.panax)、立枯絲核菌(Rh.solani)、惡疫黴菌(Ph.cactorum)和人參核盤菌(S.schinseng) 6種病原菌防控上的應用。
[0008]本發明提供了一種對上述引起人參根腐病、鏽腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的6種病原菌均具有良好防控作用的解澱粉芽孢桿菌SZ-60，該菌株的保藏名稱為解澱粉芽孢桿菌SZ-60,分類命名為Bacillus amyloliquefaciensSZ-60,保藏單位為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號:CGMCC N0.8277，其 16SrDNA 序列長度為 1436bp，具體如 SEQ ID No:l 所示。應用 BLAST軟體和DNAMAN軟體等進行分析，將SZ-60菌株的16SrDNA序列通過BLAST比對，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與SZ-60菌株相似性最高的是Bacillusamyloliquefaciens,同源性達到99%。根據MEGA5.10Beta2軟體以UPGMA法構建系統發育樹發現，SZ-60與Bacillus amyloliquefaciens同屬一個遺傳分枝,親緣關係十分接近,親源性達到了 100%。結合形態學和生理生化性狀的鑑定結果，可以確認本發明的菌株SZ-60為解澱粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)o
[0009]本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60在牛肉膏蛋白腖(NB)培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落不規則、乳白色、中心稍隆起、表面溼潤、半透明；鏡檢呈杆狀，大小為0.3~0.4X3.2~3.3 iim，具鞭毛，G -，有芽孢；其能在25°C~40°C的溫度下生長，其最適生長溫度為32°C ;其生長pH範圍為6.5~8.0，最適生長pH為7.2 ;需氧生長；硝酸鹽還原反應生成紅色化合物；接觸酶測定為陽性；脂肪酶反應為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應呈陰性；不能利用D-葡萄糖、D-木糖；澱粉水解試驗鏡檢有糊精生成；明膠液化試驗呈陽性；檸檬酸鹽利用試驗培養基呈酸性(綠色)；V-P(pH 7.0)測定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇檢測呈陽性；在含有2%~5%的NaCl的牛肉膏蛋白腖(NB)培養基上均能生長。所述的牛肉膏蛋白腖(NB)培養基的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g，NaC15.0g，瓊脂17g，水1000mL, pH 6.8 ~7.2。
[0010]本發明還涉及解澱粉芽孢桿菌SZ-60在防治植物真菌病害中的應用，或在製備防治植物真菌病害的微生物製劑中的的應用，所述植物優選為人參，所述真菌優選為引起人參根腐病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、引起人參鏽腐病的毀滅柱孢菌(C.destructans) ><71起人參黑斑病的人參鏈格孢菌(A.panax)、引起人參立枯病的立枯絲核菌(Rh.solani)、弓丨起人參疫病的惡疫黴菌(Ph.cactorum)和引起人參菌核病的人參核盤菌(S.schinseng)這6種病原菌中的一種或多種。本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60對人參還具有促生長的作用。
[0011]本發明還涉及含有解澱粉芽孢桿菌SZ-60的全培養液培養物和解澱粉芽孢桿菌SZ-60的孢子的微生物製劑，其可通過以下製備方法製備得到:
[0012](1)將解澱粉芽孢桿菌SZ-60試管種接種於用1000mL三角瓶裝的300mL營養肉湯酵母膏(NBY)培養液中，在180轉/min，30°C下培養36小時，獲得發酵菌液；
[0013](2)將發酵菌液在以種子罐體積20%接種於種子罐中的發酵培養液中發酵培養，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，種子罐的溫度30~34°C，接種發酵菌液4小時後，每隔2小時對種子罐中的發酵液進行發酵質量檢測，直到發酵液菌體生長比較飽滿即將出現芽孢時，獲得發酵菌種，種子罐中的發酵時間為12~16小時；
[0014](3)將種子罐中發酵菌種的10%接種於發酵罐中的NBY培養液中發酵培養，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，發酵罐的溫度30~34°C，接種發酵菌種4小時後，每隔2小時對發酵罐中的發酵液進行發酵質量檢測，觀察菌含量，直到發酵罐發酵液中的最終培養物(包括菌和芽孢)生物量為109cfu/ml以上、芽孢含量大於或等於90%時，立即將發酵液出罐，進行分裝，獲得SZ-60微生物製劑；發酵罐中的發酵時間為24~36小時。
[0015]NBY培養液的配方為:牛肉膏3.5g，蛋白腖l0.0g，酵母浸膏5.0g，麥芽浸膏10g，葡萄糖5.0g，水1000mL，pH6.8~7.2 ;製備方法為:稱取牛肉膏、蛋白腖、酵母浸膏、麥芽浸膏、葡萄糖放入1000mL水中，充分混勻後將pH調整至6.8~7.2，1000mL三角瓶中裝量為300mL培養液，用雙層封口膜封好三角瓶口，121°C溼熱滅菌30分鐘，冷卻後備用。發酵培養液的配方以重量百分比計為:大豆粉2.0%，豆餅粉1.5%，澱粉0.5%，酵母膏0.2%，玉米漿
0.2%，NaCl0.1%，Ca(HCO3)20.2%，餘量為水，ρΗ7.0~7.2 ;製備方法為在種子罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆餅粉、澱粉、酵母浸膏、玉米漿、NaCUCa(HCO3)2，充分攪拌，將發酵培養液PH調整到7.0~7.2，密封加料孔，用高溫蒸汽滅菌2小時，冷卻後立即接種。
[0016]在種子罐或發酵罐的發酵過程中，當出現較多泡沫時，可以加入消泡劑，所述的消泡劑為有機娃，加入量以種子te或發酵te中的泡沫不&出為準；發酵中發酵完成後，在發酵罐中加入佔罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，再出罐進行分裝。
[0017]通過上述發酵工藝得到的發酵液即為一種微生物殺菌劑。本發明的微生物製劑可以以稀釋液的形式均勻地施加到土壤中，微生物製劑與水的稀釋體積比為1:100。另外，稀釋液中還可以添加助劑有機矽，有機矽與稀釋液的體積比為1:5000。
[0018]本發明的優點在於，保藏號為CGMCC N0.8277的解澱粉芽孢桿菌SZ-60對分別引起人參根腐病、鏽腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、毀滅柱孢菌(C.destructans)、人參鏈格抱菌(A.panax)、立枯絲核菌(Rh.solani)、惡疫黴菌(Ph.cactorum)和人參核盤菌(S.schinseng) 6種病原菌均具有良好的防治效果,對人參具有促生長作用，無毒無致病性，對人畜安全，不汙染環境；同時，生防菌劑稀釋後直接施加到土壤中對植物進行灌根處理即可發揮其殺菌作用，能顯著改善人參根際環境中微生物群落的合理結構，形成一個生物多樣化的人參根際土壤微生態環境，從而有效地、持久地控制人參真菌性病害的流行。【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1:本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對毀滅柱孢菌(CyI indrocarpondestructans)菌絲的生長平板抑制作用。
[0020]圖2:本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)菌絲的生長平板抑制作用。
[0021]圖3:本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對人參鏈格孢菌(Alternaria panax)菌絲的生長平板抑制作用。
[0022]圖4:本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對人參核盤菌(Sclerotiniaschinseng)菌絲的生長平板抑制作用。
[0023]圖5:本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)菌絲的生長平板抑制作用。
[0024]圖6:本發明的解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對惡疫黴菌(Phytophthora cactorum)菌絲的生長平板抑 製作用。
[0025]圖7:SZ-60對人參的促生長作用(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0026]圖8:SZ-60對毀滅柱孢菌引起的人參鏽腐病的防治效果(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0027]圖9:SZ_60對惡疫黴菌引起的人參疫病的防治效果(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0028]圖10:SZ-60對人參核盤菌引起的人參菌核病的防治效果(A:空白，B:燒注SZ-60菌懸液)。
[0029]圖11:SZ-60對腐皮鐮孢菌引起的人參根腐病的防治效果(A:空白，B:燒注SZ-60菌懸液)。
[0030]圖12:SZ_60對人參鏈格孢菌引起的人參黑斑病的防治效果(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0031]圖13:SZ-60對立枯絲核菌引起的人參立枯病的防治效果(A:空白，B:燒注SZ-60菌懸液)。
【具體實施方式】
[0032]實施例1
[0033]解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) SZ-60菌株的分離和保藏
[0034]該菌株自吉林省撫松縣萬良鎮人參栽培地多年生人參根際周圍30cm以內的土壤分離得到。採集上述土壤樣品，風乾後過篩。稱取樣品10g，放入裝有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩10-30min，使樣品與無菌水混合均勻，製得樣品懸液，靜置5min。在無菌條件下取ImL上清液，加入9mL0.05%SDS水溶液(十二烷基硫酸鈉水溶液)，40°C保溫20min，取lmL，加入9mL無菌水，按梯度依次製成10' 10_4、10_5的稀釋液。分別吸取100 u L各稀釋液加入到牛肉膏蛋白腖(NB)平板上，採用平板稀釋法均勻塗布，每處理3次重複，34°C培養箱培養I~2天。挑選單菌落轉接到NB平板培養，長出菌落後，用接種環進行劃線分離純化，純化菌株於4°C保存。牛肉膏蛋白腖(NB)培養基的配方為:牛肉膏3.0g、蛋白腖 10.0g、NaC15.0g，瓊脂 17g，水 1000mL, pH6.8 ~7.2。
[0035]該菌株在NB培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落不規則、乳白色、中心稍隆起、表面溼潤、半透明；鏡檢呈杆狀，大小為0.3~0.4X3.2~3.3iim，具鞭毛，G -，有芽孢；其能在25°C~40°C的溫度下生長，其最適生長溫度為32°C;其生長pH範圍為6.5~8.0，最適生長pH為7.2 ;需氧生長；硝酸鹽還原反應生成紅色化合物；接觸酶測定為陽性；脂肪酶反應為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應呈陰性；不能利用D-葡萄糖、D-木糖；澱粉水解試驗鏡檢有糊精生成；明膠液化試驗呈陽性；檸檬酸鹽利用試驗培養基呈酸性(綠色)；V-P(pH 7.0)測定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇檢測呈陽性；在含有2%~5%的NaCl的NB培養基上均能生長。
[0036]該菌株於2013年9月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8277。
[0037]該菌株我們命名為SZ-60，分類命名為:解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
[0038]實施例2
[0039]解澱粉芽孢桿菌SZ-60菌株對人參真菌病害病原菌生長的抑制作用
[0040]採用濾紙片法測定菌株SZ-60對人參真菌病害病原菌的拮抗作用:用直徑8mm的打孔器將活化好的人參病原菌菌落製成相應尺寸的菌餅，無菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板(直徑90mm)的正中央，同時將4片直徑為Icm的滅菌濾紙圓片粘於距平板中心25mm處的4個角點上。將菌株SZ-60製成菌懸液(濃度約為108cfu/mL)，其中3片濾紙圓片每片點接20 y L菌懸液，I片濾紙圓片點接20 y L無菌水，作為處理組，每個處理重複3次；另在一塊平板的4個角點的4片濾紙圓片上均分別點接20 y L無菌水，作為對照組，均置於28°C培養箱培養6~7天，待對照組病原菌菌落長滿平板，測量處理組病原菌菌落直徑(單位:mm)，並按照如下公式計算抑菌率。每種病原菌重複3次，結果取平均值。
[0041 ]抑菌率(%) = [ (A — B) / (A — 8) ] X 100%
[0042]注:A為對照組病原菌菌落直徑，即90mm ；B為處理組病原菌菌落直徑。
[0043]馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基的製備方法:稱取去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g，加入水1000mL,調節pH為7.0。在沸水浴上加熱20min，紗布過濾後定容到1000mL,加瓊脂22g熔化後分裝溼熱滅菌(12rC，30min)。
[0044]上述菌懸液的製備方法:保藏的菌株SZ-60通過平板劃線方式活化2天後，用接種環取3~4塊直徑Icm的細菌菌落，接入到200mL含50mL牛肉膏蛋白腖(NB)培養液的三角錐形瓶中，搖床32°C，180r/min培養48h後製成濃度約為108cfu/mL的細菌菌懸液。NB培養液的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g, NaC15.0g，水1000mL, pH6.8~7.2。
[0045]結果如表1所示，菌株SZ-60對分別引起人參根腐病、鏽腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、毀滅柱孢菌(C.destructans)、人參鏈格孢菌(A.panax)、立枯絲核菌(Rh.solani)、惡疫黴菌(Ph.cactorum)和人參核盤菌(S.schinseng) 6種病原菌均具有明顯的抑制作用。特別是對引起人參疫病的惡疫黴菌和引起人參鏽腐病的毀滅柱孢菌的抑菌率達到了 90%以上，對引起黑斑病的人參鏈格孢菌、弓丨起人參根腐病的腐皮鐮孢菌和引起人參菌核病的人參核盤菌的抑菌率為71~82%，對引起人參立枯病的立枯絲核菌的抑菌率也達到了 46.4%，反映出菌株SZ-60對人參6種主要病原菌的防治作用具有廣譜性。
[0046]表1菌株SZ-60對人參病原真菌的抑制作用
[0047]
【權利要求】
1.一種解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SZ_60,其特徵在於,其保藏號為 CGMCC N0.8277。
2.如權利要求1所述的解澱粉芽孢桿菌SZ-60，其特徵在於，該菌株在牛肉膏蛋白腖(NB)培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落不規則、乳白色、中心稍隆起、表面溼潤、半透明。鏡檢呈杆狀，大小為0.3~0.4X3.2~3.3 μ m，具鞭毛，G -，有芽孢。其能在25°C~40°C的溫度下生長，其最適生長溫度為32°C。其生長pH範圍為6.5~8.0，最適生長pH為7.2。需氧生長；硝酸鹽還原反應生成紅色化合物。接觸酶測定為陽性；脂肪酶反應為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應呈陰性。不能利用D-葡萄糖、D-木糖。澱粉水解試驗鏡檢有糊精生成。明膠液化試驗呈陽性；檸檬酸鹽利用試驗培養基呈酸性(綠色)。V-P(pH7.0)測定生成紅色化合物；L_阿拉伯糖、甘露醇檢測呈陽性；在含有2%~5%的NaCl的牛肉膏蛋白腖(NB)培養基上均能生長。 所述的牛肉膏蛋白腖(NB)培養基的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g, NaC15.0gJlC月旨 17g，水 1000mL, ρΗ6.8 ~7.2。
3.如權利要求1或2所述的解澱粉芽孢桿菌SZ-60在防治植物真菌病害中的應用，或在製備防治植物真菌病害的微生物製劑中的應用。 優選地，所述植物為人參。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述真菌為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、毀滅柱抱菌(Cylindrocarpon destructans)、人參鏈格抱菌(Alternariapanax)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、惡疫黴菌(Phytophthora cactorum)和人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)中的一種或多種。
5.—種微生物製劑，其特徵在於，含有權利要求1的解澱粉芽孢桿菌SZ-60的全培養液培養物和解澱粉芽孢桿菌SZ-60的孢子。
6.如權利要求5所述的微生物製劑，其特徵在於，其是通過以下製備方法製備得到的: (1)將如權利要求1所述的解澱粉芽孢桿菌SZ-60試管種接種於用1000mL三角瓶裝的300mL營養肉湯酵母膏(NBY)培養液中，在180r/min，30°C下培養36小時，獲得發酵菌液； (2)將發酵菌液在以種子罐體積20%接種於種子罐中的發酵培養液中發酵培養，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，種子罐的溫度30~34°C，接種發酵菌液4小時後，每隔2小時對種子罐中的發酵液進行發酵質量檢測，直到發酵液菌體生長比較飽滿即將出現芽孢時，獲得發酵菌種，種子罐中的發酵時間為12~16小時； (3)將種子罐中發酵菌種的10%接種於發酵罐中的NBY培養液中發酵培養，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，發酵罐的溫度30~34°C，接種發酵菌種4小時後，每隔2小時對發酵罐中的發酵液進行發酵質量檢測，觀察菌含量，直到發酵罐中發酵液中的最終培養物(包含菌和芽孢)生物量為109cfu/ml以上、芽孢含量大於或等於90%時，立即將發酵液出罐，進行分裝，獲得SZ-60微生物製劑；發酵罐中的發酵時間為24~36小時。 優選地，所述的NBY培養液的配方為:牛肉膏3.5g，蛋白腖10.0g，酵母浸膏5.0g，麥芽浸膏10g，葡萄糖5.0gjK lOOOmL，pH6.8~7.2 ;所述的發酵培養液的配方以重量百分比計為:大豆粉2.0%，豆餅粉1.5%，澱粉0.5%，酵母浸膏0.2%，玉米漿0.2%，NaCl0.1%，Ca(HCO3)20.2%，餘量為水，ρΗ7.0 ~7.2。 更優選地，所述的NBY培養液是這樣配製的:稱取牛肉膏、蛋白腖、酵母浸膏、麥芽浸膏、葡萄糖放入1000mL水中，充分混勻後將pH調整至6.8~7.2，1000mL三角瓶中裝量為300mL培養液，用雙層封口膜封好三角瓶口，121°C溼熱滅菌30分鐘，冷卻後備用； 所述的發酵培養液是這樣配製的:在種子罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆餅粉、澱粉、酵母浸膏、玉米漿、NaCl、Ca (HCO3)2，充分攪拌，將發酵培養液pH調整到7.0~7.2，密封加料孔，用高溫蒸汽滅菌2小時，冷卻後立即接種。
7.如權利要求6所述的微生物製劑，其特徵在於:在種子罐或發酵罐的發酵過程中，當出現較多泡沫時，加入消泡劑，所述的消泡劑為有機矽，加入量以種子罐或發酵罐中的泡沫不溢出為準；發酵罐中發酵完成後，在發酵罐中加入佔罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，再出罐進行分裝。
8.如權利要求5-7中任一項所述的微生物製劑在防治人參真菌病害中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述真菌為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、毀滅柱抱菌(Cylindrocarpon destructans)、人參鏈格抱菌(Alternariapanax)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、惡疫黴菌(Phytophthora cactorum)和人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)中的一種或多種。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，在人參真菌病害發病初期，將所述微生物製劑的稀釋液均勻地施加到土壤中，所述稀釋液中微生物製劑與水的稀釋體積比為1:100。 優選地，所述的稀釋液中還添加了助劑有機矽，所述助劑有機矽與稀釋液的體積比為1:5000。
【文檔編號】A01N63/02GK103789234SQ201410017081
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】楊利民, 孫卓, 韓梅, 林紅梅 申請人:吉林農業大學