一種培育抗蚜蟲轉基因小麥的方法及專用載體的製作方法

2023-05-08 22:02:06

專利名稱：一種培育抗蚜蟲轉基因小麥的方法及專用載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗蚜蟲轉基因小麥的方法及專用載體。
背景技術：
小麥作為最重要的糧食作物之一，是人類蛋白質主要攝取來源；同時富含維生素 B、維生素 E、纖維及鎂、磷等物質(Vasil I K, Anderson 0 D. Genetic engineering of wheat gluten. Trends in Plant Science, 1997,2(8) :292-297.)。據 1997 年召開的「世界食物和可持續發展農業」大會估計，世界小麥需求量將以每年1. 6%的速率增長，2020年將達到 7. 75 億噸，比 1993 年的 5. 52 億噸增長 40% (Rosengrant M W, Agcaoili-Sombilla M, Perez N D. Global food projections to 2020 amplications for investment. 1995, Washington, DC:IFPRI.)。屆時我國小麥需求量約為1. 4 1. 5億噸，比目前產量增加 4600 5600萬噸，增長49 60% (甘吉生.2006-2020年《作物科技發展規劃》研究報告.Il路明主編，2003中國作物學會學術年會文集.2003 :47-62.)。建國以來，我國已培育出小麥品種2000多個，實現品種更新換代6 8次，單產從43公斤/畝提高到285公斤/ 畝，為我國糧食的有效供給作出了巨大貢獻(喻修道，徐兆師，陳明，李連城，馬有志.2010. 小麥轉基因技術研究及其應用.中國農業科學，43 (8) ,1539-1553.)。但近十多年來，小麥產量提高速度趨緩。鑑於目前耕地面積不斷減少和人口的持續增長，病蟲害及乾旱等脅迫的日益嚴重，我國小麥生產依然面臨很大挑戰，轉基因技術可能為新形勢下的小麥有效供給提供保障。蟲害一直是小麥生產的重要障礙之一，其防治好壞直接影響到小麥產量和品質。 據不完全統計，危害中國麥類作物的害蟲超過110種，隸屬於8目40科以上，主要包括麥蚜、吸漿蟲、地下害蟲、麥蜘蛛、黏蟲、薊馬、麥葉蜂、麥莖蜂等10餘類群(曹雅忠，李克斌，尹姣，張克誠.小麥主要害蟲的發生動態及可持續控制的策略與實踐.中國植保導刊，2006， 26(8) :11-14.)。其中以麥蚜為害最為嚴重，中國常年發生面積達1.5-2.0億畝，造成小麥減產10%左右，大發生年份減產超過30% (武予清，李素娟，劉愛芝，李世功.小麥抗蚜育種研究進展.河南農業科學，2002( :19-20.)。近年來，由於全球C02濃度不斷增加、耕作制度變化等使麥蚜的繁殖能力和適應性顯著增強(Awmack C S,Harrington R. Elevated C02 affects the interactions between aphid pests and host plant flowering. Agricultural and Forest Entomology，2000，2 :57-61)，其危害面積和危害程度正在不斷擴大並日趨嚴重。現有小麥種質資源中幾乎找不到對麥蚜免疫的材料，高抗材料也很少，因此通過植物基因工程創造小麥抗蚜新種質是非常必要的。轉基因技術與常規育種手段相結合進行品種選育，可以縮短育種周期，提高育種效率，是非常有效的育種新途徑，中國農業科學院生物技術研究所郭三堆課題組開展的抗蟲棉選育已充分證明了此途徑的有效性(倪萬潮， 張震林，郭三堆(1998).轉基因抗蟲棉的培育.中國農業科學，31,36-40.；郭三堆，崔洪志， 夏蘭芹，武東亮，倪萬潮，張震林，張保龍，徐英俊(1999).雙價抗蟲轉基因棉花研究.中國農業科學，32 (3)，1-7.)。目前已有研究者將幾個抗蟲基因導入了小麥，如Vishnudasan等 (Vishnudasan D，Tripathi M N，Rao U，Khurana P.Assessment of nematode resistance in wheat transgenic plants expressing potato proteinase inhibitor (PIN2)gene. Transgenic Research，2005，14 (5) :665-675.)將馬鈴薯來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因PIN2通過農桿菌介導法轉入小麥，轉基因小麥株系對禾穀孢囊線蟲具有很高的抗性。Altpeter 等(Altpeter F，Diaz I，McAuslane H，Gaddour K，Carbonero P，Vasil I K. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe. Molecular Breeding，1999，5 :53-63.)將大麥胰蛋白酶抑制基因 BTI-CMe 轉入小麥，該基因對儲存害蟲麥蛾有較強的抑制作用，但對小麥葉面害蟲作用不大。就抗蚜轉基因小麥而言，研究最成功的是轉外源凝集素基因，如人工合成及來源於雪花蓮的凝集素基因(gna)，半夏凝集素基因(Pta)。凝集素是一類具有特異糖結合活性的蛋白，對蚜蟲等同翅目害蟲有很強的抗殺作用。Moger等(Stoger E, Williams S，Christou P， Down R E，Gatehouse J A. Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin ；GNA)in transgenic wheat plants :effects on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding，1999，5 :65-73.) 將韌皮部特異啟動子調控下的gna導入小麥，發現轉基因株系對小麥長管蚜有抗性，目的基因表達量高於0.04%的植株可以顯著降低蚜蟲繁殖率，但不影響蚜蟲存活率。Yu等(Yu Y, Wei Z.Increased oriental armyworm and aphid resistance in transgenic wheat stably expressing Bacillus thuringiensis(Bt) endotoxin and Pinellia ternate agglutinin (PTA). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2008,94 (1) :33-44.)構建了 cry Ia和pta雙元表達載體，通過農桿菌介導法轉入小麥，對2個轉基因小麥株系進行抗蟲鑑定，蚜蟲的存活率分別為對照的和78%，粘蟲的存活率分別為對照的65%和73%。 但根據 Birch 等(Birch A N Ε, Geoghegan I Ε,Majerus M E N,Mcnicol J W, Hackett C, Gatehouse AMR, Gatehouse J A.Tri—trophic interaction involving pest aphids, predatory 2~spot ladybirds and transgenic potatoes expressing snowdrop lectin for aphid resistance. Molecular Breeding, 1999,5 :75-83.)的報導，二星瓢蟲取食轉 gna馬鈴薯上的蚜蟲後，其產卵力、卵的生存力和壽命明顯降低，因而，轉gna植物對生態環境的影響引起了人們的關注。挖掘利用新的更加安全有效的抗蚜基因將是小麥抗蟲轉基因育種的重要課題(喻修道，徐兆師，陳明，李連城，馬有志O010).小麥轉基因技術研究及其應用·中國農業科學，43 (8) ,1539-1553.)。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種培育抗蚜蟲轉基因小麥的方法。本發明所提供的培育抗蚜蟲轉基因小麥的方法，包括如下步驟將如下1)或2)所示基因表達盒導入出發小麥中，得到抗蚜蟲轉基因小麥1)由如下元件依次連接而成啟動子、增強子、kozak片段、SEQ ID NO :3所示蛋白的編碼基因、終止子；2)由如下元件依次連接而成啟動子、增強子、kozak片段、水稻Rubisco小亞基葉綠體導肽的編碼序列、SEQ ID NO :3所示蛋白的編碼基因、終止子。
上述方法中，所述1)所示基因表達盒為SEQ ID NO 1中自5 『末端起第1_3擬8位核苷酸所示基因表達盒；上述方法中，所述2)所示基因表達盒為SEQ ID NO :2中自5'末端起第1-3981位核苷酸所示基因表達盒。上述方法中，所述基因表達盒是通過如下I或II所述重組載體導入所述出發小麥中的；I、為如下I-I或1-2所示I-I JfSEQ ID N0:1中自5'末端起第1_3擬8位核苷酸所示基因表達盒插入載體PG4AB的多克隆位點，得到的重組載體；1-2、將SEQ ID NO :2中自5'末端起第1-3981位核苷酸所示基因表達盒插入載體PG4AB的多克隆位點，得到的重組載體；II、為如下II-I或II-2所示:11-1、將SEQ ID NO :1中自5'末端起第1_3擬8位核苷酸所示基因表達盒插入載體pG Π UB中，得到的重組載體；11-2、將SEQ ID NO :2中自5'末端起第1-3981位核苷酸所示基因表達盒插入載體pG Π UB中，得到的重組載體。上述方法中，所述蚜蟲為麥長管蚜(Sitobion avenae)；所述出發小麥為揚麥12 或科農199。本發明的另一個目的是提供一種基因表達盒。本發明所提供的基因表達盒，為如下1)或2)所示1)由如下元件依次連接而成啟動子、增強子、kozak片段、SEQ ID NO :3所示蛋白的編碼基因、終止子；2)由如下元件依次連接而成啟動子、增強子、kozak片段、水稻Rubisco小亞基葉綠體導肽的編碼基因、SEQ ID NO :3所示蛋白的編碼基因、終止子。上述基因表達盒中，所述1)所示基因表達盒為SEQ ID NO :1中自5'末端起第 1-3828位核苷酸所示基因表達盒；上述基因表達盒中，所述2)所示基因表達盒為SEQ ID NO :2中自5'末端起第 1-3981位核苷酸所示基因表達盒。含有上述任一所述基因表達盒的重組載體也屬於本發明的保護範圍。含有上述任一所述基因表達盒的重組菌也屬於本發明的保護範圍。含有上述任一所述基因表達盒的重組細胞也屬於本發明的保護範圍。所述重組載體按照包括如下步驟的方法得到將上述任一所述基因表達盒插入載體pG4AB的多克隆位點，得到所述重組載體。所述重組載體還可按照包括如下步驟的方法得到將權利要求5或6所述基因表達盒插入載體PG Π UB中，得到所述重組載體。上述任一所述基因表達盒在培育抗蚜蟲轉基因小麥中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述任一所述重組載體在培育抗蚜蟲轉基因小麥中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述應用中，所述蚜蟲為麥長管蚜(Sitobion avenae)；所述小麥為揚麥12或科農 199。本發明載體中含有表達盒rbcS-Ω序列-kozak-Mh β FS-poly (A)-Nos或表達盒 rbcS-Ω 序列-kozak-CTP-Mh β FS-poly(A)-Nos。其中，rbcS 為水稻核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因(rbcS)啟動子，CTP為水稻rbcS基因的葉綠體轉導肽；為了能夠有效的表達胞0 51和/或胞0 51+0 ，在目的基因前添加了 Ω和kozak序列，在目的基因後添加了 polyA。所述kozak序列是指包括Mh β FSl和/或Mh β FSl+CTP起始密碼子在內的 『GCCATGG，，Ω序列在MhPFSl和/或Mh^FSl+CTP基因上遊，中間間隔2bp。kozak序列和Ω序列能顯著提高外源基因的表達量。實驗證明，轉入本發明載體的轉基因小麥的抗蟲性能明顯高於野生型小麥，因此， 本發明載體在植物的遺傳育種領域具有重要意義。


圖1為基因槍法轉基因小麥的表達載體構建流程。
圖2為基因槍法轉基因小麥的表達載體鑑定。
圖3為農桿菌介導法轉基因小麥表達載體的構建流程。
圖4為農桿菌介導法轉基因小麥表達載體的鑑定。
圖5為轉基因小麥的獲得。
圖6為轉基因小麥植株的PCR檢測。
圖7為轉基因小麥植株的Southern雜交。
圖8為轉基因小麥植株的蚜蟲鑑定。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。SEQ ID NO 1 所示(即 rbcS- Ω 序列-kozak-Mh β FS-poly (A) -Nos)，其中，自 SEQ ID NO :1的5'末端起，第1-1619位核苷酸為水稻Rubisco小亞基啟動子rbcSPromotor, 第1621-1702位核苷酸為Ω序列，第1705-1711位核苷酸為kozak，第1708-3360位核苷酸為Mh β FS, H 3361-3575位核苷酸為poly (A)，第3576-38 位核苷酸為Nos。SEQ ID NO 2 所示(即 rbcS-Ω 序歹Ij -kozak-CTP-Mh β FS-poly (A)-Nos)，其中， 自SEQ ID N0:2的5'末端起，第1-1619位核苷酸為水稻Rubisco小亞基啟動子rbcS Promotor，第1621-1702位核苷酸為Ω序列，第1705-1711位核苷酸為kozak，第1708-1854 位核苷酸為CTP，1856-1860位核苷酸為所加Spe I酶切位點，第1861-3513位核苷酸為 Mh^ FS，第3514-37 位核苷酸為poly (A)，第3729-3981位核苷酸為Nos。實施例1、Mh β FS基因的cDNA克隆製備亞洲薄荷(Mentha asiatica)購自北京湯河香草藝術莊園。平末端載體 pEASY-Blunt購自北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為CBlOl。提取亞洲薄荷的總RNA，反轉錄成cDNA，以該cDNA為模板，用引物對Mh β FSFl/ Mh β FS Rl進行PCR擴增，得到的PCR產物即為Mh β FS基因。Mh^FS Fl :5，-ATGGCTACAAACGGCGTC-3，
Mh β FS Rl :5，-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3，。擴增體系如下ddH2031. 5 μ 1, 5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10. 0μ 1, dNTPMixture (2. 5mM each) 4. O μ l,Mh^FS Fl(IOyM)L 5 μ l,Mh^FS Rl(IOyM)L 5 μ 1，反轉錄產物 1. O μ 1, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ 1)0. 5 μ 1, Total50. Ομ 1。I^rimeSTAR高保真酶擴增得到的是平末端片段，因此回收的PCR產物可與平末端載體pEASY-Blunt連接，得到重組載體pEASY-Blunt/Mh β FS。將重組載體轉入大腸桿菌Dffia感受態細胞，Amp抗性篩選培養，挑取陽性單克隆，將陽性單克隆進行液體培養， 提取質粒，進行測序，測得在載體pEASY-Blunt中插入了 SEQ ID NO :1的自5'末端起第 1708-3360位核苷酸所示基因，即為Mh β FS基因。證明構建的載體pEASY-Blunt/Mh β FS正確。實施例2、基因槍法轉基因小麥一、基因槍法轉基因小麥的表達載體構建載體Mh β FS l-pG4AB和載體Mh β FS l+CTP_pG4AB的構建流程如圖1所示。( 一 )載體 Mh β FS l-pG4AB 的製備水稻品種為日本晴，購自中國農業科學院作物科學研究所國家農作物種質保存中心。A. 7jC稻 Rubisco 小亞基啟動子(rbcS Promoter)製備提取水稻葉片DNA，用引物對rbcSP Fl/rbcSP Rl進行PCR擴增，得到Rubisco小亞基啟雲力子(rbcS Promoter) οrbcSP Fl :5』 -TCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3，；rbcSP Rl :5』 -AGATGCACTGCTCTGCACAC-3，；將rbcS Promoter與T-easy載體連接，將重組載體進行測序驗證，結果得到正確的重組載體，記作T-easy/rbcSP，該載體中含有SEQ ID NO 1的自5'末端起第1-1619位核苷酸所示基因，即為Rubisco小亞基基因啟動子(rbcS Promoter)。Rubisco小亞基基因啟動子(rbcS Promoter)的電泳圖如圖2A所示。B. R-pG4AB載體構建用水稻rbcS Promoter置換pG4AB上的!35S CaMV啟動子。pG4AB為表達載體提供Ω序列、kozak序列、poly (A)和Nos序列。pG4AB在文獻 「毛立群，郭三堆.1996. Ω序列和3』poly(A)序列長度與基因表達效率的關係.植物學報， 1998,40(7) 1-3"中公開過，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。具體步驟如下1) pG4AB載體用BamH I酶切，酶切後純化；2)用Klenow Fragment填平末端，具體步驟反應體系如下Reaction Buffer 5μ 1dNTP (2. 5mM)2 μ 1Klenow Fragment 1 μ 1BamH I酶切後的質粒 42 μ 137°C孵育 20min，70°C孵育 IOmin 使酶失活。3)以重組載體T-easy/rbcSP為模板，用引物對rbcSP F2/rbcSP R2進行PCR擴增；
rbcSP F2 5' -GGGaagcttTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3' (5，端加酶切位點 Hind III)rbcSP R2 :5』 -AGATGCACTGCTCTGCACAC-3，。4)將用BamH I酶切後填平末端的pG4AB載體用Hind III半酶切(半酶切條件 370C IOmin)，回收載體大片段；將步驟3)的PCR擴增產物用Hind III酶切，回收酶切後基因片段；將回收的載體大片段與酶切後基因片段連接，得到重組載體，記作R-PG4AB ；將重組載體進行測序驗證，結果在載體PG4AB的Hind III和BamH I之間插入了 SEQ ID NO=I 的自5'末端起第1-1620位核苷酸所示基因，證明該重組載體正確，記作R-pG4AB載體。用水稻rbcS置換了 pG4AB上的35S CaMV啟動子。酶切驗證將重組載體R-pG4AB用Hind III酶進行酶切驗證，以pG4AB為對照 (CK)；結果如圖2C所示，重組載體R-pG4AB得到3. 1Kb和3. 8Kb的片段，對照組得到3. 1Kb 和2. 7Kb的片段。C. Mh β FSl-pG4AB 構建以重組載體pEASY-Blunt/MhβFS為模板，用引物對MhβFS F6/Mh β FS R6進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物，將PCR擴增產物用Nsi I和Ml I雙酶切，回收酶切後的PCR 產物；將R-PG4AB載體用I^st I和B10 I雙酶切，回收載體大片段；將回收酶切後的PCR產物與回收的載體大片段連接，得到重組載體，記作Mh β FSl-pG4AB ；將重組載體用引物對Mh β FS F6/Mh β FS R6進行PCR驗證，擴增結果如圖2Ε所示。MhPFS F6 :5，-CCAatgcatATGGCTACAAACGGCGTC-3，(加酶切位點 Nsi I)Mh^FS R6 :5，-GCGCgtcgacTCAAAAGACTATGGCATCAACA-3，(加酶切位點 Sal I)。將Mh β FSl-pG4AB進行測序驗證，結果在載體pG4AB的兩個Hind III酶切位點之間的基因片段如 SEQ ID N0:1(即 rbcS-Ω 序列-kozak-Mh β FS-poly (A)-Nos)所示，SEQ ID NO :1中，第1-1619位核苷酸為rbcS Promotor，第1621-1702位核苷酸為Ω序列，第 1705-1711位核苷酸為kozak，第1708-3360位核苷酸為Mhi3 FS，第3361-3575位核苷酸為 poly (A)，第；3576-3擬8位核苷酸為Nos。( 二 )載體 Mh β FS l+CTP-pG4AB 的製備1、提取水稻葉片DNA，用引物對rbcSC Fl/rbcSC Rl進行PCR擴增，得到水稻 Rubisco小亞基葉綠體轉導肽(CTP)的編碼基因。rbcSC Fl :5，-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3，rbcSC Rl :5』 -CTGCATGCACCTGATCCTGC-3』將水稻Rubisco小亞基葉綠體轉導肽(CTP)的編碼基因與pEASY-Blunt載體連接，將重組載體進行測序驗證，結果得到正確的重組載體，記作pEASY-Blimt/CTP，該載體中含有SEQ ID NO 2中第1708-18M位核苷酸所示，即為水稻Rubisco小亞基葉綠體轉導肽 (CTP)的序列。CTP的凝膠電泳圖如圖2B所示。2、Mh β FSl+CTP 表達盒擴增1)以 pEASY-Blunt/CTP 為模板，用引物對rbcSC F2/rbcSC R2 進行 PCR擴增，用高保真酶擴增，得到CTPl ；rbcSC F2 :5』 -ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3，rbcSC R2 :5，-AGactagtCTGCATGCACCTGATCCTGC-3'(加上 Spe I 酶切位點)2)以重組載體pEASY-Blunt/MhβFS為模板，用引物對MhβFS F5/Mh β FS R5進行
9PCR擴增，用高保真酶擴增，得到Mh β FSl ；MhP FS F5 :5，-CAactagtATGGCTACAAACGGCGTC-3，(加上 Spe I 酶切位點)Mh^FS R5 :5，-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3，3)將CTPl用Spe I酶切，回收酶切後的CTPl ；將Mh β FSl用Spe I酶切，回收酶切後的Mh β FSl ；將酶切後的CTPl和酶切後的Mh β FSl連接，得到Mh β FSl和CTPl的連接產物；4)以Mh β FSl和CTPl的連接產物為模板，用引物對Mh β FS+CTPFl/Mh β FS+CTPR1 進行擴增Mh β FS+CTP，得到的PCR擴增產物即為Mh β FSl+CTP融合片段。Mh β FS+CTP Fl :5-CCCatgcatATGGCCCCCTCCGTGATGG_3 (加酶切位點 Nsi I)Mh β FS+CTP Rl :5-GCGCgtcgacTCAAAAGACTATGGCATCAACAAAGAG_3 (力口酶切位點 Sail)。CTP-Mh β FS 1的凝膠電泳圖如圖2D所示。3、Mh β FS l+CTP_pG4AB 構建將Mhi3FSl+CTP融合片段用Nsi I和Ml I雙酶切，回收酶切後的PCR產物；將 R-PG4AB載體用I^st I和B10 I雙酶切，回收載體大片段；將回收酶切後的PCR產物與回收的載體大片段連接，得到重組載體，記作Mh β FS l+CTP-pG4AB ；將重組載體用引物對Mh β FS+CTP Fl/Mh β FS+CTP Rl進行PCR驗證，擴增結果如圖2E所示。Mh^FS l+CTP-pG4AB進行測序驗證，結果在載體pG4AB的Hind III和Hind III之間的基因片段如SEQ ID NO 2所示(即rbcS-Ω序歹 Ij-kozak-CTP_Mh0FS-poly(A)-Nos)，其中，自 SEQ ID N0:2 的 5'末端起，第 1-1619 位核苷酸為rbcS，第1621-1702位核苷酸為Ω序列，第1705-1711位核苷酸為kozak，第 1708-1854位核苷酸為CTP，1855-1860位核苷酸為所加Spe I酶切位點，第1861-3513位核苷酸為Mhi3 FS，第3514-37 位核苷酸為poly (A)，第3729-3981位核苷酸為Nos。二、小麥基因槍介導的遺傳轉化揚麥12在文獻「劉永偉，徐兆師，杜麗璞，徐惠君，李連城，馬有志，陳明.病毒複製酶基因NibS和ERF轉錄因子W17基因槍法共轉化小麥.作物學報，2007，33(9) 1548-1552. 」中公開過，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。pAHC20在文獻「徐惠君，龐俊蘭，葉興國，杜麗璞，李連城，辛志勇，馬有志，陳劍平， 陳炯，程順和，吳宏亞.基因槍介導法向小麥導入黃花葉病毒複製酶基因的研究.作物學報，2001，27(6) :688-693」中公開過，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。(一)方法A.外植體和靶材料取授粉後14天左右的揚麥12幼胚為外植體，接種於誘導培養基(MS+lmg/L VB^lSOmg/L ASP+2mg/L 2，4_D)，22_25°C條件下暗培養3-7天，得到幼胚愈傷組織。B.基因槍法共轉化及轉化體篩選採用BIO-RAD 公司的 PDS-1000/He 基因槍進行轟擊(PsillOO，27. 5cm Hg 柱)，金粉、質粒(Mh β FSl+CTP-R-pG4AB和pAHC20)濃度分別為45 μ g/槍和1 μ g/槍，轟擊後的愈傷組織轉移到新的誘導培養基上培養2-3周，培養條件為22-25°C、黑暗。
再生、篩選和壯苗等方法除培養基中不含150mg/lTimentin外，其餘均與下面農桿菌轉化中所述相同。(二)鑑定1、Tc^T1代轉基因小麥的PCR檢測鑑定引物為MhiiFS-J Fl/Mh β FS-J Rl0預期產物長度為817bp。Mh β FS-J F1 5，-GCTCTTCGTTTCCGTTTGCTC-3，Mh β FS-J Rl 5，-GCTCCTCATTAAATGCCCTTGC-3，2、T2代轉基因小麥PCR檢測檢測採用的是巢式PCR，先用Mh β FS-J Fl/Mh β FS-J Rl擴增，將PCR產物稀釋100 倍，取Ιμ 為模板，用MhiiFS-J F2/Mhi3FS-J R2進行第二輪擴增，第二輪PCR擴增的預期產物長度為329bp ；Mh β FS-J F2 5，-CGAGTCGTGGAGGCTTATGT-3，Mh β FS-J R2 5，-GCCCTTGCCAGTTGTTTCA-3，3、T0代轉基因小麥的Southern雜交提取Ttl代轉基因小麥株系的DNA，純化後用B10 I酶切，轉膜、標記探針和雜交。以載體Mh^FS 1164々8為模板，利用引物胞0 5-了 F2和Mh β FS-J R2擴增，PCR 產物即為探針；探針標記使用TaKaRa Random primer DNA Labeling Kit。本實驗基因槍法共獲得547棵再生植株，為了檢測目標基因MhiiFSl或Mhi3FSl+CTP是否轉入到小麥基因組中，根據 MhiiFSl基因序列設計引物，以 ；、T1再生植株葉片的基因組DNA為模板進行PCR檢測 (圖6A為Ttl代檢測結果；圖6B為T1代檢測結果)，陽性植株中擴增出了一特異性片段，在 SOObp左右，符合預期大小(預期產物長度為817bp)，而對照植株(小麥受體品種，CK)中沒有擴增出相應片段；Ttl植株共檢測到12個陽性株系，11、44、50、215、249、274、538等7個株係為Mh β FSl基因槍法獲得的轉基因小麥株系；C321、C322、C360、C428、C491等5個為 Mhi3FSl+CTP基因槍法獲得的轉基因小麥株系；將部分T1轉基因植株種於溫室加代，獲得T2 轉基因植株，T2轉基因植株檢測採用的是巢式PCR擴增，兩輪PCR之後擴增出330bp左右的特異性片段，陰性對照植株(小麥受體品種)中沒有擴增出相應片段(圖6C)，隨後獲得轉基因小麥T3種子。Southern雜交顯示目的基因已經整合到小麥基因組中。實施例2、農桿菌法轉基因小麥載體Mh β FSl-pG Π UB和載體Mh β FSl+CTP-pG Π UB的構建流程如圖3所示。載體pG Π UB 在文獻"Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mul 1 ineauxPM. 2000. pGreen -.a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology 42, 819-832」中公開過，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。pG Π UB提供表達載體由W^iqutin啟動子調控的Bar盒子。pENTR/D-TOPO 載體購自 hvitrogen 公司，產品目錄號為 K2420-20。一、農桿菌法轉基因小麥表達載體的構建本載體構建過程中，在正向引物的5』端加上CACC，擴增得到整個表達盒片段，這樣片段的5』端與入門載體pENTR/D-TOPO的突出末端GTGG序列互補，在拓撲異構酶I的作用下使基因以正確的方向插入到pENTR/D-TOPO載體的兩個attL重組位點之間，形成帶有兩個attL重組位點的入門克隆；提取構建正確的入門克隆質粒，BspH I酶切後，按比例與目的載體PG Π UB混合，在LR Clonase Π Enzyme Mix的作用下，入門克隆載體的兩個 attL重組位點與pG Π UB的兩個attR位點進行LR位點特異性重組反應，得到目的重組載體。(一)Mh3FSl-pGTI UB 構建1、入門克隆載體構建以重組質粒Mh β FS l-pG4AB為模板，用引物對V_G F/V-G R進行PCR擴增。擴增片段的凝膠電泳如圖4中A泳道1所示。V-G F:5-CACCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3V-G R:5-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3。pENTR/D-TOPO 載體 1 μ 1，Salt Solution 1 μ 1，PCR 擴增產物 X μ 1，ddH20 補充至 Ij 6 μ 10將PCR擴增產物與pENTR/D-TOPO載體按照摩爾比1 1比例混合，室溫下連接 5min，將連接產物熱激轉化大腸桿菌DH5ci後塗布在含有Kan (100mg/L)的平板上篩選，挑取單菌落進行PCR鑑定，提取質粒並測序，將測序正確的重組載體即為入門克隆載體，記作 Mh β FSl-pENTRTM/D-T0P0。2、Mh β FS 1-pG Π UB 載體構建由於入門克隆載體Mh β FSl-pENTRTM/D-TOP和pG Π UB載體均為Kan抗性，故在重組反應前先將入門克隆載體用BspH I酶切，反應體系如下10XNEB Buffer 4 10μ 1, BspH I 3μ l，Mh3FSl-pENTRTM/D-T0P0 入門克隆載體 50μ l，ddH20 37 μ 1, Total 100 μ L·37°C酶切過夜，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況，結果如圖4中B泳道2所示， 並切膠回收目的片斷。參照 Invitrogen 公司 Gateway LR Clonase Π Enzyme Mix 說明書，在 0. 5ml EP 管中依次加入如下組分進行LR重組反應酶切後的入門克隆載體2 μ 1，pG Π UB 2 μ 1，TE buffer(ρΗ 8. 0)4 μ 1, LR Clonase Π Enzyme Mix 2 μ 1。短暫混勻後25°C孵育過夜，待反應完全後加入1 μ 1蛋白酶K於37°C IOmin終止反應。取2 μ 1反應液熱激轉化大腸桿菌DH5 α，菌液塗布在含有Kan (100mg/l)的平板上篩選，挑取單菌落進行PCR鑑定，提取質粒並測序。測序結果表明，將SEQ IDNO 1中第1_3擬8 所示 DNA 片段(rbcS- Ω 序列-kozak-Mh β FS-poly (A) -Nos 片段)插在了 pG Π UB 的 attRl 和attR2之間，表明得到的重組載體正確，記作Mh β FSl-pG Π UB0Mh β FSl-pG Π UB的菌液PCR鑑定結果如圖4中C所示。(泳道1_4為載體pG Π UB 引物擴增結果，泳道5-8為Mh β FSl鑑定結果)。鑑定載體引物為pG Π UB F/pG Π UB R0 鑑定 Mh β FSl 引物為 Mh β FS F3/Mh β FS R3。pG Π UB F 5 『 - G A T T C C T T T C C C A C C G C T C C T - 3 『 ； pG Π UB R 5』 -GGCGTTGCGTGCCTTCCAG-3』。Mh β FS F3 5-ATGGCTACAAACGGCGTC-3Mh β FS R3 5-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3。
(二)Mh β FSl+CTP-pG Π UB 構建1、入門克隆載體構建參照 Invitrogen 公司 Gateway pENTR Directional TOPO Cloning Kits 說明書對引物的要求，設計了引物對V-G F/V-G R0以重組質粒Mhi3FS l+CTP_pG4AB為模板，用引物對V-G F/V-G R進行PCR擴增。擴增片段的凝膠電泳如圖4中A泳道2所示。V-G F:5-CACCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3V-G R:5-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3。將PCR擴增產物與pENTR/D-TOPO載體按照摩爾比1 1比例混合，室溫下連接 5min，將連接產物熱激轉化大腸桿菌DH5ci後塗布在含有Kan (100mg/L)的平板上篩選，挑取單菌落進行PCR鑑定，提取質粒並測序，將測序正確的重組載體即為入門克隆載體，記作 Mh β FSl+CTP-pENTRTM/D-T0P0。2、Mh β FSl+CTP-pG Π UB 載體構建由於入門克隆載體Mh β FSl+CTP-pENTRTM/D-TOP和pG Π UB載體均為Kan抗性，故在重組反應前先將入門克隆載體用BspH I酶切，反應體系如下10XNEB Buffer 410 μ 1， BspH I 3 μ 1，Mh β FS1 +CTP-pENTRTM/D-T0P0 入門克隆載體 50 μ 1，ddH20 37 μ 1, Total 100 μ 1。37°C酶切過夜，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況，結果如圖4中B泳道2所示， 並切膠回收目的片斷。參照 Invitrogen 公司 Gateway LR Clonase Π Enzyme Mix 說明書，在 0. 5ml EP 管中依次加入如下組分進行LR重組反應酶切後的入門克隆載體2 μ 1，pG Π UB 2 μ 1，TE buffer(ρΗ 8. 0)4 μ 1, LR Clonase Π Enzyme Mix 2 μ 1。短暫混勻後25°C孵育過夜，待反應完全後加入1 μ 1蛋白酶K於37°C IOmin終止反應。取2 μ 1反應液熱激轉化大腸桿菌DH5 α，菌液塗布在含有Kan (100mg/l)的平板上篩選，挑取單菌落進行PCR鑑定，提取質粒並測序。測序結果表明，將SEQ IDNO 2中第1-3981 所示 DNA 片段(rbcS- Ω 序列-kozak-CTP-Mh β FSl-poly (A) -Nos 片段)插在了 pG Π UB 的 attRl和attR2之間，表明得到的重組載體正確，記作Mh β FSl+CTP-pG Π UB0MhβFSl+CTP-pGIIUB的菌液PCR鑑定結果如圖4中D所示。(泳道1_4為pGTIUB 載體引物擴增結果，泳道5-8為CTP-Mh β FSl鑑定結果)。鑑定載體引物為pGTIUB F/pG Π UB R0 鑑定 CTP-Mh β FSl 引物為 Mh β FS+CTP F2/Mh β FS+CTP R2。pG Π UB F 5 『 - G A T T C C T T T C C C A C C G C T C C T - 3 『 ； pG Π UB R 5』 -GGCGTTGCGTGCCTTCCAG-3』。Mh β FS+CTP F2 5-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3Mh β FS+CTP R2 5-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3。二、農桿菌轉化科農199在文獻「李俊明，張相岐，張愛民，王志國，安調過，紀軍，王靜.高產廣適小麥新品種-科農199.麥類作物學報，2007，39 O) :368_368」中公開過，公眾可從國家種質資源庫獲得，也可中國農業科學院作物科學研究所獲得。根癌農桿菌菌株AGLl 在文獻「Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA. 1991. A DNAtransformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology9,963-967.，，中公開過，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。載體pAL154 和載體 pGreen-UB-UG 在文獻「Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM. Pgreen :A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol 2000，42 :819_832。」巾公開過，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。pAL154和pGreen-UB-UG，是由JIC基於pSoup/pGreen雙元載體系統發展而來。 pALIM作為輔助質粒，除具有促進pGreen複製和擴增功能外，還含有額外的15-1Λ的 Komari片段，大大增強和提高了菌株侵染和轉移Ti質粒的效率。(一)方法該轉化方法及所用的培養基等與中國專利(申請號200810116723. 2，
發明者喻修道, 夏蘭琴, 張保明, 馬有志 申請人:中國農業科學院作物科學研究所