一種高產山梨酮的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌及其構建方法

2023-06-14 03:34:01 1

專利名稱：一種高產山梨酮的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種高產山梨酮的G. oxydans工程菌及其構建方法和應用,採用分子生物學的方法引入山梨糖脫氫酶(SDH)基因，從而實現代謝山梨醇生產山梨酮，屬於遺傳工程領域。
背景技術：
維生素C(Vitamin C, VC),又稱為L-抗壞血酸(L_ascorbic acid),是一種重要的有機酸，廣泛應用於製藥、食品、飲料、化妝品和飼料等工業中。由於一直未能發現直接合成維生素C的微生物，所以精力主要集中在利用微生物發酵生產其中間產物，特別是其直接前體2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2_KLG)。1972年，我國科學家發明了維生素C 二步發酵法，由於工藝極大簡化、得率和安全性均得到較大提升，很快在全國得到推 廣，但是在第二步混合菌發酵體系中，執行糖酸轉化的微生物只有小菌，小菌單獨生長很困難，需要與大菌共同培養才能正常生長，工藝複雜，影響因素較多，難以精確控制，如何簡化當前的二步發酵工藝是一個迫切需要解決的問題。基因工程技術改造G. oxydans生產維生素C中間產物山梨酮國內未見有相關報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問在於提供一種高產山梨酮的G. oxydans工程菌，所述工程菌通過啟動子tufB表達sdh基因。所述sdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種可用於山梨酮高效生產的質粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述sdh基因連接到革蘭氏陰性菌廣泛宿主穿梭質粒載體pBBRMCS-2上(Fournewderivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS，carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes)。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種高產山梨酮的G. oxydans基因工程菌的構建方法。為解決上述技術問題，本發明的具體方案為I)根據本實驗室對K. vulgare WSH-001 (來源於江蘇江山製藥有限公司)的全基因組測序結果中注釋的sdh基因合成sdh基因；根據G. oxydans WSH-003基因組信息合成其延伸因子啟動子tufB基因。2)將sdh、tufB與pBBRMCS-2載體連接得到重組表達載體；3)將得到的重組表達載體轉化G. oxydans 621H後得到重組菌株。本發明所要解決的另一個技術問題在於G. oxydans基因工程菌山梨酮生產中的應用，具體方法為將所述工程菌G. oxydans從斜面中接種重組菌於20mL的種子培養基中，30° C、200rpm培養24h後按15%的接種量接種於發酵培養基，30° C、220rpm進行搖瓶發酵，發酵周期48h。種子和斜面培養基(g/L):山梨醇15，酵母膏O. 6，pH 4. 8 5. 1，瓊脂20 (斜面培養基)，pH 7.0,121° C滅菌15min，卡那黴素終濃度50 μ g/mL。發酵培養基(g/L):山梨醇25，酵母膏O. 2，初始pH 5. I 5. 4，121° C滅菌15min,卡那黴素終濃度50 μ g/mL。山梨醇、山梨酮含量測定液相色譜(HPLC)發酵樣品用流動相十倍稀釋,O. 45 μ m濾膜過濾。Agilent IlOOsystem, RioRad公 司 Aminex HPX-87H 色譜柱；流動相2. 75 μ mol/L 濃硫酸；柱溫:35。C ;流速0. 6mL/min ；進樣量5 μ L ;檢測器示差折光檢測器。本發明通過基因工程改造，將來源於K. vulgare WSH-001的sdh基因克隆到G. oxydans621H中，並將G. oxydans WSH-003中延伸因子的啟動子連接到sdh基因前，獲得了一株利用山梨醇生產山梨酮的G. oxydans工程菌,為構建G. oxydans 一步發酵工程菌生產維生素C直接前體2-KLG提供了理論基礎，從而解除小菌對伴生菌依賴的問題，簡化維生素C生產工藝，具有很好的應用前景。本發明提供的構建方法簡單，適於標準化。利用本發明提供的高產山梨酮基因工程菌發酵生產山梨酮，其產量可達到72g/L。
具體實施例方式實施例I表達載體的構建 將本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結果中注釋的sdh和G. oxydans WSH-003中延伸因子的啟動子tufB擴增後克隆到pMD19_T載體中，挑取陽性轉化子測序驗證，將正確的轉化子培養提取質粒，與革蘭氏陰性菌廣泛宿主穿梭質粒載體pBBRMCS-2分別經Xho I及Hind III雙酶切後連接，轉化大腸桿菌(Escherichia coli)JM109，挑取轉化子培養，提取質粒經Xho I及Hind III酶切驗證，出現1858bp的條帶，證明已經成功構建表達載體pBBRMCS-sdh。再將測序正確的pMD 19-T-tufB和pBBRMCS_sdh經Kpn I及Xho I雙酶切後連接，轉化E. coli JM109，挑取轉化子培養，提取質粒分別經Kpn
I、Xho I和Xho I、HindIII雙酶切驗證，出現1858bp和500bp的條帶，證明已經成功構建表達載體 pBBRMCS-tufB-sdh。實施例2G. oxydans工程菌的構建將上述構建好的大腸桿菌重組菌E. coli/pBBRMCS-tufB-sdh,輔助菌coli/PRK2013 (ATCC保藏編號37159)和受體菌G. oxydans 621H別培養至對數期，按2:1:1的比例混合後離心，用生理鹽水洗滌菌體沉澱，重懸於100 μ L生理鹽水，將菌懸液全部塗布到山梨醇平板的無菌濾膜上，培養12h，刮取菌體作適當稀釋後，塗布到終濃度50μ g/mL的頭孢西丁鈉和50 μ g/mL的卡那黴素的選擇性平板上，挑取陽性轉移子進行PCR驗證，並將陽性轉移子培養後提取質粒迴轉E. coli JM109，提取質粒分別經Kpn I, Xho I和Xho I、Hind III雙酶切驗證，出現1858bp和500bp的條帶，證明成功構建重組菌株G. oxydans/pBBRMCS-tufB-sdh。實施例3發酵生產山梨酮
種子和斜面培養基(g/L):山梨醇20，酵母膏2，pH 4. 8 5. 1，瓊脂20 (斜面培養基)，pH 7.0，121。C滅菌15min，卡那黴素終濃度50 μ g/mL。發酵培養基(g/L):山梨醇80，酵母膏5，初始pH 5. I 5. 4，121° C滅菌15min，卡那黴素終濃度50 μ g/mL。培養條件從斜面中接種重組菌於20mL的種子培養基中，30° C、200rpm培養24h後按15%接種量接種於發酵培養基，30° C、220rpm進行搖瓶發酵，發酵周期48h，山梨酮產量為72g/L。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種高產山梨酮的氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydans)工程菌，其特徵在於通過啟動子tufB表達外源sdh基因。
2.根據權利要求I所述的工程菌，其特徵在於所述sdh基因核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
3.一種促進表達生產山梨酮的質粒，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.權利要求I所述工程菌的構建方法，其特徵在於包括如下步驟 1)設計引物分別克隆sdh和tufB； 2)將sdh、tufB克隆到重組表達載體； 3)將重組表達載體轉化到G.oxydans 621H後得到重組菌株。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於所述重組表達載體為pBBRMCS-2。
6.權利要求I所述工程菌應用於山梨酮生產。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於將所述工程菌在30°C、200rpm培養24h後按15%的接種量接種於發酵培養基，30° C、220rpm進行搖瓶發酵，發酵周期48h。
全文摘要
本發明公開了一種產維生素C合成中間體山梨酮的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌及其構建方法和應用，屬於遺傳工程領域。本發明通過基因工程技術，將來源於普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脫氫酶基因(sdh)克隆到氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)中，獲得了一株利用山梨醇生產山梨酮的G.oxydans工程菌。G.oxydans WSH-003是二步發酵法生產2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)過程中第一步發酵工業菌株，由江蘇江山製藥有限公司提供。將sdh克隆到G.oxydans中，實現了從D-山梨醇到維生素C合成中間體山梨酮的轉化，為進一步構建一步發酵工程菌生產維生素C直接前體2-KLG奠定了基礎，山梨酮的產量可達72g/L，具有很好的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK102851252SQ20121027417
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者陳堅, 周景文, 高麗麗, 劉傑, 堵國成 申請人:江南大學