一種具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體及其製備方法與應用與流程

2023-05-08 23:41:43 1

本發明涉及一種具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體及其製備方法與應用，屬於納米材料領域。

背景技術：

一個胺基酸的氨基與另一個胺基酸的羧基縮合成肽分子。肽分子廣泛存在於生物體並參與細胞或組織中重要的生命活動，本身具有優異的生物相容性與生物可降解性，是製備各種先進生物材料的優良原料。最近，人們發現許多肽分子(包括環狀肽、枝狀肽、兩親肽、共聚肽與芳香肽等)都具有非常強大的組裝性能，容易形成各種功能有序結構。設計與合成新的肽分子，利用自組裝技術構築新型功能納米材料並應用於生物醫學領域具有重要研究意義。

目前，研究人員受生物體內刺激響應的啟發，結合超分子組裝技術，開發了多種智能生物材料。與生物響應相類似，當遇到刺激信號時，響應型超分子組裝體會產生一系列相應的變化，如解組裝與再組裝、形貌突變、相態轉變等。刺激源根據來源的不同主要分為內部刺激源和外部刺激源。內部刺激源包括pH、氧化/還原劑、酶與抗體等；外部刺激源主要有溫度、光、電場、磁場與超聲等。在所有刺激源中，pH是應用最為廣泛的一種刺激條件，特別是作為抗癌藥物載體在提高藥物生物利用度和減少毒副作用方面優勢非常突出。

另外，與持續釋放藥物體系相比較，爆炸性釋放對於許多特定的治療可能會有更多的優勢和更好的效果，例如心臟病或心肌梗塞、急性缺血性腦中風和嚴重的敗血症等。最近，人們利用層層組裝技術開發出了聚電解質基膠囊系統實現了藥物分子的快速釋放，但是它們的直徑為幾個微米，大大限制了相關應用。因此，非常有必要發展一種尺寸可調且可爆炸性釋放藥物的納米載體。

隨著納米技術的快速發展，各種優異的功能性納米載體相繼被開發，如金納米粒子、SiO2納米粒子、氧化鐵納米粒子和聚合物納米粒子，這些粒子對各種疾病的診斷和治療展現出非常好的靈敏性和特異性，在生物醫藥方面非常有應用前景(參見Nat.Protoc.,2015,10,90-105,Particle generation,functionalization and sortase A-mediated modification with targeting of single-chain antibodies for diagnostic and therapeutic use)。

基於生物肽或生物胺基酸(例如L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸，簡稱二苯丙氨酸)的多種納米結構已被獲得，如：納米囊泡、納米管、納米纖維、納米顆粒及納米森林等，這些納米結構可以充當模板應用於無機和有機納米材料的製備、也可與其他分子共組裝應用於生物成像、藥物輸運和腫瘤治療等方面(參見Chem.Soc.Rev.2010,39,1877-1890,Self-assembly and application of diphenylalanine-based nanostructure)。然而，迄今基於生物肽或生物胺基酸的納米載體還未能實現在不破壞藥物分子功能的前提下完成藥物的爆炸性釋放。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體及其製備方法與應用，本發明納米載體的粒徑可調控，穩定性好，能pH響應的超快速釋放，藥物的封裝能力高；其製備方法簡單、易操作。

本發明提供的具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體，所述納米載體由生物肽或生物胺基酸與交聯劑反應製備得到；

所述生物肽包括二苯丙氨酸和/或二苯丙氨酸羧基端醯胺化的鹽酸鹽；

所述生物胺基酸包括苯丙氨酸；

所述交聯劑包括脂肪族二醛。

本發明中，二苯丙氨酸的結構式如下式Ⅰ所示：

上述的納米載體中，所述脂肪族二醛為戊二醛和/或丁二醛；

所述二苯丙氨酸的構型為L型。

上述的納米載體中，所述納米載體的粒徑可為100～1000nm，具體可為400～700nm。

本發明具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體對pH刺激條件為生理pH條件；

本發明可快速釋放的客體分子為水溶性染料分子(帶負電荷的伊紅(Eosin)與帶正電荷的亞甲基藍(MB))、非水溶的染料分子(尼羅紅(NR))和抗癌藥物阿黴素(DOX)中的至少一種。

本發明還提供了上述的納米載體的製備方法，包括如下步驟：將生物肽溶液或生物胺基酸溶液與所述交聯劑溶液混合進行席夫鹼反應，即得到所述具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體。

上述的製備方法中，溶解所述生物肽的溶劑為六氟異丙醇和/或二甲基亞碸；

所述生物肽溶液的濃度可為100mg/ml～150mg/ml，具體可為125mg/ml；

溶解所述生物胺基酸的溶劑可為水；

所述生物胺基酸溶液的濃度可為5mg/ml～50mg/ml，具體可為20mg/ml、5mg/ml～20mg/ml、20mg/ml～50mg/ml或15mg/ml～45mg/ml；

溶解所述交聯劑的溶劑選自水、乙醇和甲醇中的至少一種；

所述交聯劑溶液的質量百分濃度可為0～25％，且不包括零，具體可為0.6％、0.12％、0.6％～0.12％。

上述的製備方法中，所述生物肽與所述交聯劑的摩爾比可為1：0.2～5，具體可為1:1、1：1.5～2.5或1：0.5～4；

所述生物胺基酸與所述交聯劑的投料摩爾比可為1:0.1～10，具體可為1:1、1:0.5～1.5。

上述的製備方法中，所述席夫鹼反應的溫度可為10～90℃，具體可為25℃、10～25℃、25～90℃、20～50℃或15～80℃；

所述席夫鹼反應的時間可為12～48h，具體可為24h、20～30h或15～40h。

本發明還提供了上述的製備方法製備得到的所述具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體。

本發明所述的納米載體應用於作為藥物釋放載體材料中。

本發明所述的納米載體在製備具有生物相容性的納米材料中的應用。

本發明具有以下優點：

(1)粒徑可調控：通過改變溶劑體積和組裝基元的濃度，可以有效的調節納米載體的大小。

(2)穩定性好：通過將二苯丙氨酸基納米載體的懸濁液加入到不同濃度的NaCl、KCl、KH2PO4以及不同pH的HCl溶液中，靜置並對其進行動態光散射及TEM表徵，發現納米載體只會在鹽效應作用下產生少量聚集，並不會造成結構的破壞，說明本發明納米載體對化學成分(NaCl、KCl、KH2PO4和HCl)保持了良好的穩定性。

(3)pH響應的超快速釋放：無論是水溶性還是非水溶性、正電荷還是負電荷的客體小分子都可以被封裝入納米載體中，並且在生理pH條件下可以選擇性的快速釋放負電荷染料分子與疏水性染料分子，釋放過程可在幾十秒或幾分鐘值內完成。

(4)高的藥物封裝能力：納米載體可以封裝藥物分子阿黴素，封裝效率(EE)達到95％以上，同樣在中性pH或以上能展現了較快的釋放行為。

(5)本發明製備方法簡單，容易操作。

附圖說明

圖1是納米載體的製備及客體分子封裝釋放示意圖。

圖2是自然乾燥納米載體的掃描電鏡圖。

圖3是自然乾燥納米載體的透射電鏡圖。

圖4是溶劑用量及組裝基元濃度對納米載體尺寸的影響。

圖5是納米載體的粒徑隨溶液濃度以及表面電勢隨時間變化的關係圖。

圖6是納米載體懸浮液的濁度隨pH增加的變化情況以及納米載體於不同pH值條件下的TEM圖；其中圖6a)為納米載體懸浮液的濁度隨pH增加的變化情況，圖6b)為pH值為5.0的TEM圖，圖6c)為pH值為5.6的TEM圖，圖6d)為pH值為6.5的TEM圖，圖6e)為pH值為7.2的TEM圖；圖6f)為pH值為8.1的TEM圖。

圖7是CLSM觀察的具有強烈螢光的納米載體；其中圖7a)為加入PBS(pH 7.2)前，納米載體螢光；圖7b)加入PBS(pH 7.2)時，納米載體螢光的變化情況；圖7c)加入PBS(pH 7.2)後，持續觀察納米載體螢光。

圖8為染料分子在PBS(pH 7.2)和pH 5.0緩衝溶液中的累積釋放量；其中圖8a)為Eosin的UV-Vis光譜分析；圖8b)為MB的UV-Vis光譜分析。

圖9a)為相同濃度納米載體裝載DOX前(虛線)後(實線)的UV-Vis光譜，插圖為納米載體裝載DOX前後的光學圖片；圖9b)為DOX在PBS(pH 7.2)和pH 5.0緩衝溶液中的累積釋放量分析。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中,苯丙氨酸的二聚體(二苯丙氨酸)的英文名為di-L-phenylalanine(Phe-Phe)，購自Sigma公司，貨號為P4126；二苯丙氨酸羧基端醯胺化的鹽酸鹽(陽離子二肽)的英文名為cationic dipeptide(H-Phe-Phe-NH2·HCl)，購自Bachem公司，貨號為G-2930。

實施例1、二苯丙氨酸納米載體的製備

1)將1mg生物肽二苯丙氨酸溶於8μl六氟異丙醇中，得到生物肽的六氟異丙醇溶液(又稱為溶液a)，濃度為125mg/ml，4℃存放24小時以上使其充分溶解；

2)將2.4μl質量百分濃度為25％的戊二醛的水溶液通過超純水稀釋到500μl，得到溶液b，濃度為0.12％；二苯丙氨酸與戊二醛的投料摩爾比為1：1；

3)將溶液b於65℃水浴加熱至恆溫充分溶解後，加入到溶液a中，經席夫鹼反應，室溫(25℃)靜置24小時老化後，溶液變為淡黃色濁液，離心除去上清液體即得本發明具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體。

實施例2、苯丙氨酸納米載體的製備

1)將20mg生物胺基酸苯丙氨酸溶於1mL超純水中，得到苯丙氨酸的水溶液(又稱為溶液a)，濃度為20mg/ml，4℃存放24小時以上使其充分溶解；

2)取24μl質量百分濃度為25％的戊二醛的水溶液即溶液b，濃度為0.6％；苯丙氨酸與戊二醛的投料摩爾比為1：1；

3)將溶液b加入到溶液a中，經席夫鹼反應，室溫(25℃靜置24小時老化後，溶液變為淡黃色濁液，離心除去上清液體即得本發明具有pH響應的可快速釋放客體分子的納米載體。

實施例3、本發明實施例1所得二苯丙氨酸納米載體的表徵

本發明實施例1製備得到的納米載體掃描電鏡表徵：將經過離心洗滌的納米容器懸濁液(5μl)滴於矽片表面，真空將其抽乾後，通過導電膠固定於樣品臺，通過濺射儀向其表面噴灑Au顆粒後於HITACHI S-4800掃描電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為10kV；結果如圖2所示。

由圖2可知，本發明所得納米載體材料為單分散納米球，表面非常粗糙並有許多孔道結構。

二苯丙氨酸納米載體透射電鏡表徵：將經過離心洗滌的納米球懸濁液(5μl)滴於銅網表面於真空將其抽乾後於JEOL JEM-1011透射電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為100kV；結果如圖3所示。

由圖3可知，本發明所得納米載體材料的納米球為實心，粒徑為400～700nm。

本發明實施例2和1所得納米載體的表徵結果與上無實質性差別。

實施例4、二苯丙氨酸納米載體尺寸調控測試

將1mg FF所用的HFP體積從8μL逐漸增加到32μL或同比例增加FF與GA的量來控制組裝基元的濃度，並於Zetasizer Nano ZS ZEN3600動態光散射儀器下表徵本發明實施例1製備的二苯丙氨酸納米載體的粒徑。

所得結果如圖4所示。

由圖4可知，當溶解1mg FF所用的HFP體積從8μL逐漸增加到32μL時，本發明二苯丙氨酸納米載體的粒徑被控制於700nm到400nm範圍內；隨著組裝基元濃度的增加，納米載體的粒徑逐漸減小，說明可以通過改變良溶劑HFP的量和組裝基元的濃度，可以有效的調節納米載體的大小。

實施例5、二苯丙氨酸納米載體在不同環境中的穩定性測試

1)將300μL二苯丙氨酸納米載體懸濁液加入到不同濃度的NaCl或KCl溶液中(濃度範圍為0.0025mol/L到4mol/L)，靜置2h後，對其進行DLS表徵，並選具有代表性的樣品做SEM表徵。

2)將300μL二苯丙氨酸納米載體懸濁液加入到12mmol/L KH2PO4水溶液中並保存15天，通過DLS監測及TEM測試其粒徑隨時間的變化關係。

3)幾份300μL二苯丙氨酸納米載體懸濁液分別加入到不同pH的HCl溶液中(pH為4.6、3.8、3.2、2.5和1.9)，靜置15天，每天通過DLS監測所有樣品的粒徑變化，並選取具有代表性的樣品進行TEM表徵及表面電勢檢測。

所得結果如圖5所示。

由圖5可知，NaCl、KCl、KH2PO4鹽溶液和不同pH值的HCl溶液只會在鹽效應作用下使二苯丙氨酸納米載體粒子產生部分聚集，並不會對其造成結構的破壞。

實施例6、pH誘導的二苯丙氨酸納米載體的爆炸性降解測試

將0.1mol/L的NaOH溶液逐滴滴加到二苯丙氨酸納米載體懸濁液中，同時進行UV-Vis光譜測試，監測濁度在650nm處的變化，通過TEM表徵不同pH條件二苯丙氨酸納米載體粒子詳細的形貌變化，並將樣品置於培養皿中通過CLSM成像觀測其降解過程。

所得結果如圖6與圖7所示。

由圖6與圖7可知，說明二苯丙氨酸納米載體在pH為中性或鹼性的溶液中立即解組裝，這種特性可以使二苯丙氨酸納米載體作為一種潛在的可在生理pH條件下實現爆炸性釋放所裝載貨物的納米容器。

實施例7、客體小分子的封裝及pH響應的快速釋放測試

對本發明實施例1所得的二苯丙氨酸納米載體進行客體小分子的封裝及pH響應的快速釋放測試。具體步驟如下：

將5mg/mL Eosin水溶液(50μL)、5mg/mL MB水溶液(50μL)、0.25mg/mL NR乙醇溶液(60μL)或4mg/mL DOX水溶液(25,50,75和100μL)分別加入到GA溶液中形成含0.12％GA水溶液0.5mL，再加入到8μL 125mg/mL的FF/HFP溶液中，室溫老化24h後，帶有不同顏色的沉澱出現於離心管底部。合併入二苯丙氨酸納米載體粒子中的水溶性分子的量用UV-Vis光譜並結合客體分子的標準曲線來確定。計算NR分子的合併量稍有不同：首先離心之後得到含NR的二苯丙氨酸納米載體沉澱，通過DMSO將其溶解之後再用UV-Vis光譜結合客體分子的標準曲線來確定。包封效率(Loading Efficiency,LE)與封裝效率(Encapsulation Efficiency,EE)分別通過如下公式Ⅰ和公式Ⅱ進行計算：

包封於納米載體中的客體分子的質量包封於納米載體中的客體分子的質量+FF的質量×100％公式Ⅰ

包封於納米載體中的客體分子的質量初始加入的客體分子的質量×100％公式Ⅱ

客體分子的快速釋放分別於PBS(pH 7.2)與另一種pH 5.0的緩衝溶液中進行，其中在pH 5.0的緩衝溶液中的過程作為對照組。將含客體分子的FFNCs分別置於2mL PBS(pH 7.2)或pH 5.0的緩衝溶液中，立即離心收集上清液後，再向沉澱中加入等體積的釋放介質，再離心收集，反覆重複此過程直到PBS中幾乎沒有沉澱為止，收集到的上清液通過UV-Vis光譜和標準曲線確定客體分子的量。

所得結果如圖8與圖9所示。

由圖8與圖9可知，二苯丙氨酸納米載體在生理pH條件下可以選擇性的快速釋放負電荷染料分子與疏水性染料分子，釋放過程可在幾十秒或幾分鐘值內完成。此外，二苯丙氨酸納米載體也能封裝藥物分子阿黴素，封裝效率(EE)達到95％以上，在中性pH或以上也展現了較快的釋放過程。