重組人白細胞介素—11的生產方法
2023-05-09 03:22:31 2
專利名稱：重組人白細胞介素—11的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種高效生產重組人 白細胞介素一ll (Recombinant Human Interleukin 11， IL-11)的方法，以及 有關的序列優化、表達載體及工程細胞的構建。
背景技術：
白細胞介素_ 11 (IL-11)主要由間充質來源的粘附細胞(mesenchymal -derived adherent cell)產生，如骨髓基質細胞、基質成纖維細胞、人胚肺成纖 維細胞和滋養層細胞。IL-ll是一種促血小板生長因子，可直接刺激造血幹細胞 和巨核祖細胞的增殖，誘導巨核細胞的成熟分化，增加體內血小板的生成，而血 小板功能無明顯改變。IL-ll是人類生長因子家族成員，該家族成員包括生長激 素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)以及其他生長因子等。人IL-11基因定位於19號染色體長臂13區(19ql3. 3—ql3.4)，含有5個 外顯子和4個內含子，長約7 Kb 。人IL—11基因5'端有多個潛在的轉錄調控 序列，如TATA盒樣序列(TATATAA)和AP — 1位點(5' GGTGAGTCAG3'), 其3'端在5591和6762個核苷酸處各有一個聚腺苷酸化位點，為此可形成1. 5kb 和2. 5kb的mRNA轉錄物。人IL-llcDNA含597個bp的單一長開放讀碼框， 編碼199個胺基酸的多肽，其中N端21個胺基酸為導肽，成熟蛋白為178個 胺基酸組成，理論分子量19. 144KD，不含半胱氨酸殘基，亦無潛在的糖基化位 點。近年來，隨著對IL-11體內外調控作用及分子生物學研究的不斷深入,人們認 識到IL-ll是一個多功能的細胞因子,具有廣泛的細胞生物學活性。最初發現它
能刺激IL一6依賴的鼠漿細胞瘤細胞系T1165的增殖。這也是基因工程重組IL 一ll體外測活方法的依據。另外，IL-11對造血系統的作用非常廣泛，主要表現 為與其他造血因子協同，對各系造血均有不同程度的促進作用。國內外新近研究 發現，IL-ll除最常見的造血活性外，還具有免疫調節、抗感染和保護黏膜上皮 等功能。 '人體內的IL-11能刺激原始造血幹細胞的生長，並能誘導巨核細胞前體細胞 的分化和成熟，促進巨核細胞和血小板生成，增加體內血小板數量並保持其功能。 這一家族的共同特點是使用gpl30作為信號轉導蛋白。從而發揮其藥效學作用， 白介素-11的生物學作用主要有以下幾點1、 促進原始祖細胞的增殖IL -ll與IL -3、 IL -4、 SCF和GM-CSF等可 發揮協同作用，可刺激多能造血幹細胞、多能定向幹細胞和單能定向幹細胞增殖， 可促使這些細胞從GO期進入活性周期，縮短了細胞周期。2、 促進巨核細胞和血小板的生成IL-11對巨核細胞和血小板生成的不同階 段都有刺激作用，不僅可以使形成的巨核細胞集落數目及大小增加，而且可以提 高外周血小板的數量。3、 在各種動物模型中，同時還觀察到IL-ll的一些非造血系統效應包括 調節腸上皮細胞的生長(促進胃腸道黏膜損傷癒合)，抑制脂質形成，誘導急性 期反應蛋白合成，刺激破骨細胞的發育和神經祖細胞的增殖。自從1990年發現IL-11後，美國Genetics Institute公司就開始了rhIL-ll 的研究，用基因重組技術將IL-11基因重組到大腸桿菌中進行表達，獲得與人體 IL-ll具有相同活性的重組人白介素-11，共177aa，分子量約19KD，與天然的白 介素-ll相比僅缺乏N端的脯氨酸，該缺失對體內外生物活性均無影響無糖基化。。 1997年11月美國FDA批准了該公司的重組產品上市，商品名為Neuraega，用於治 療腫瘤放化療導致的血小板減少以免於血小板輸注。每支為5mg凍乾粉，不含人 與動物的血源物質，主要添加劑為甘氨酸，用無菌注射用水溶解。皮下給藥10 50yg/(kg*d)，患者都能較好耐受。臨床研究表明，在高劑量化療腫瘤患者中 應用該公司生產的rhlL-ll後，28%的患者避免了血小板輸血，而對照組只有3 %的患者無需輸血小板。
本發明系統提供了一種高效生產重組人IL-11的方法。通過優化編碼重組 人IL-11的核苷酸序列，採用糖基人源化改造的新型畢赤酵母表達體系分泌表達 缺乏N端1個脯氨酸的人IL-ll，優化表達載體/宿主菌組合，同時改進發酵工 藝，提高重組人IL-ll的表達水平。同時簡便純化工藝，獲得高表達、高得率、 極具產業化價值的一種重組人IL-ll生產方法。發明內容本發明的目的就是提供一種優化的重組人IL-ll蛋白。本發明的另一目的就是提供一種高表達重組人IL-ll蛋白的方法，以及用於 該方法的表達載體及工程細胞構建。在本發明的第一方面，就是提供了一種優化的編碼重組人IL-ll蛋白的核苷 酸序列，在不改變IL-11的胺基酸序列的情況下，通過基因編碼序列的優化設計， 獲得優化的編碼重組人IL-ll蛋白的核苷酸序列。所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序 列編碼區與SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列有74%以上相同性。在另一優選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列。在本發明的第二方面，提供了一種高表達重組人IL-ll蛋白的工程細胞構建 的方法，通過將優化後的人IL-ll編碼序列與合適的表達載體連接，轉入畢赤酵 母，篩選獲得高表達工程細胞。在另一優選例中，所述的表達載體是pPIC9/IL-11。該載體經甲醇誘導表達 重組人IL-ll蛋白。 ，
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特徵在於，整合有上述表達 載體。在另一優選例中，所述的工程細胞是經過糖基人源化改造的畢赤酵母在本發明的第四方面，提供了一種生產重組人IL-11蛋白的方法，該方法包 括步驟1. 挑選已確證構建成功的工程細胞4個，接種至含3mlYPD培養基的50ml離心 管，3(TC， 200rpm過夜培養。2. 生長約30小時後(此時OD,在10 30)，測定每管的0D6。。，計算每管酵母 菌體重懸後達到一致OD,值所需誘導培養基的體積。4000rpm，室溫離心 10min，取上清作為誘導前樣品，用計算得到的適當體積的誘導培養基YPM(含1%甲醇)重懸菌沉澱，以誘導表達。3. 每隔24小時補充100%甲醇至終濃度1%左右以維持誘導4. 誘導培養後48小時分別取培養液lml，離心後取上清；SDS-PAGE電泳檢測。本發明的優點在於(1) 選用的是畢赤酵母GS115宿主細胞，通過小搖表達篩選出高表達工程細胞。(2) 優化後的重組人IL-ll蛋白基因非常適合在畢赤酵母GS115宿主細胞 中表達，具有高表達、高穩定的特點。(3) 蛋白高水平分泌表達，純化工藝簡便，回收率高，生產成本降低。
圖1. IL-ll理論序列與IL-ll優化序列的同源性比較。Query:天然IL-1] 基因序列；Sbjct:優化的IL-ll基因序列。
具體實施方式
本發明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優化設計，將優化 後的人IL-ll編碼序列(SEQ ID NO: 2)轉入經糖基人源化改造的甲醇利用型畢 赤酵母(屍.pa"ow's)，實現了重組人IL-11蛋白高效分泌表達。在此基礎上完 成了木發明。本發明根據人IL-ll天然胺基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸 序列的條件下，全基因合成重組人IL-ll蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到 pUC57中測序驗證。優化後的人IL-ll編碼序列與表達載體pPIC9連接，轉化、 整合入屍.pa"on、宿主細胞染色體，小搖篩選獲得高表達工程細胞。在本發明的一個實例中，構建了生產重組人IL-ll的酵母表達工程細胞， 甲醇誘導，高水平分泌表達。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說 明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商 所建議的條件。實施例1表達質粒的構建和高表達工程菌株的獲得根據人IL-ll天然胺基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸序列的 條件下，全基因合成重組人IL-ll蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到PUC57
中並測序驗證。通過PCR擴增得到人IL-ll目的基因，用XhoI+EcoRI雙酶切(MBI， 2*TangoTM，37°C) PCR產物及pPIC9質粒(購自Invitrogen公司)。將兩個片段 用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化進入大腸桿菌DH5 a (購自Promega公 司)，在含有氨苄青黴素的LB平板上挑選克隆，小量製備質粒，通過雙酶切/PCR 鑑定篩選出陽性克隆。大量擴增確證的pPIC9/IL-11質粒，獲得含有IL-ll的重 組質粒pPIC9/IL-11。表達質粒pPIC9/IL-11經測序驗證後，用Sal I酶切線性化，電穿孔法轉 化進入畢赤酵母GS115(購自Promega公司)，塗於MD平板上於30。C培養至有轉 化子長出，篩選高表達菌株。進行小搖表達篩選得到IL-ll高表達的工程酵母菌 株。實施例2重組人IL-ll的表達時間的確定挑選一株確證好的表達工程菌GS115/ pPIC9/IL-11，用YPD培養基進行培 養，甲醇誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測是否有目的條帶的出現，並分析其表達 量。分別在甲醇誘導後24， 48和72小時取一部分發酵後的菌液離心，收集上清， SDS-PAGE電泳檢測。電泳結果表明目的蛋白是以分泌形式表達，48小時達到最 高表達量。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請 所附權利要求書所限定的範圍。
序列表〈110〉上海新生源醫藥研究有限公司〈120〉重組人白細胞介素一ll的生產方法〈160〉 2〈210〉 1<211〉 534<212〉 DNA<213〉人工序列〈221〉 m i sc_f eature '〈222〉(1)…(534)<223〉優化的重組人IL-11基因<400〉 1ggaccaccac ctggaccacc tcgtgtttct ccagatcctc gtacttctta cacgttctct tcttgctgat acacgtcaac aaattcccag ctgatggaga tcacaatctt gattcacttc ggagcacttg gagctcttca acttccaggt gtacttacac tcatatcttc gtcatgtaca atggcttcgt cgtgcaggtg gaaccagaac ttggaactct tcaagcacgt cttgatcgtc cttatgtcac gtcttgcact tccacaacca ccaccagatc ccaccaixat cagcttgggg aggtattcgt gcagcacatg cttacacttg attgggcagt acgtggactt cttcttcttagtgctgaact tgatagtaca GOttgctgcaca acttcgtgac 120caactcttgc aatgagtgct 180gtcttcgtgc tgatcttctt 240gatcttcact taagactctt 300ttcttcgtcg tcttcaactt 360caccagctcc accacttgct 420ctatacttgg aggacttcat 480agactcgtct ttga 534〈210〉 2〈211〉 177〈212〉 PRT 智人〈400〉 2
Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg ValSer Pro Asp Pro Arg Ala 15 10 15Glu Leu Asp Ser Thr ValLeu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala AspTh;r Arg Gin LeuGly Asp His AsnGly Ala Leu GlyArg Ala Asp LeuArg Ala Gly GlyThr Leu Gin AlaLeu MetSer ArgAla Pro Pro LeuAla Ala His AlaAla ValArg Gly20 25Ala Ala Gin Leu Arg Asp Lys35 40Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu 50 55Ala Leu Gin Leu Pro Gly Val65 70Leu Ser Tyr Leu Arg His Val80 85Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu95 100Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg110 115Leu Ala Leu Pro Gin Pro Pro 125 130Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp140 145lie Leu Gly Gly Leu His Leu 155 160Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg 170 175Phe Pro Ala AspAla MetSer AlaLeu Thr ArgGin Trp LeuPro Glu LeuArg Leu GinPro Asp ProGly Gly lieThr Leu AspLeu177J30460Leu75Arg90Gly105Leu120Pro135Arg 150Trp 16權利要求
1.一種高表達人白細胞介素-11(IL-11)蛋白的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)獲得優化的白細胞介素-11的DNA序列；(b)構建合適表達載體；(c)轉化宿主細胞，篩選獲得高表達的工程細胞。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中所述的優化的白細胞介素-11 的DNA序列編碼如SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列，其與SEQ ID N0:1所示的DNA序 列有95%以上的同源性。
3. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中所述的優化的白細胞介素-11 的DNA序列被克隆入合適的表達載體。較佳地，步驟(b)中所述的表達載體是 pPIC9/IL-11。
4. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，步驟(c)中所述的工程細胞，含有權利 要求3所述的表達載體或權利要求2所述的編碼重組人白細胞介素-ll的DNA序列。 較佳地，所述的工程細胞是畢赤酵母。
全文摘要
本發明提供了一種重組人白細胞介素-11的核苷酸序列，高效生產重組人白細胞介素-11的生產方法，以及有關的工程細胞構建、表達和純化的工藝。優化後的重組人白細胞介素-11蛋白基因，非常適合在酵母中表達，同時通過發酵與純化工藝優化，提高了產量，具有高表達、高穩定的優點。本發明可高效、簡便、低成本的獲得重組人白細胞介素-11純品。
文檔編號C12N15/09GK101165180SQ200710162970
公開日2008年4月23日 申請日期2007年9月28日 優先權日2006年9月29日
發明者軍 任, 朱飛雲, 黃陽濱 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司