一種核仁定位信號肽及其編碼基因和應用的製作方法

2023-05-09 04:46:31 2

專利名稱：一種核仁定位信號肽及其編碼基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核仁定位信號肽及其編碼基因和應用。
背景技術：
真核生物與原核生物最大的區別是真核生物的細胞發展出了複雜的膜系統，這些生物膜將真核生物的細胞分割成為多個區域，進而形成了多個不同細胞器和空間，比如溶酶體、內質網、高爾基體、線粒體、細胞核等等。真核細胞內膜系統的出現大大增加了細胞內膜的表面積，並且將細胞分隔成為多個特定的功能區域，為多種酶類提供了特定的結合部位和發揮功能的環境，同時也增加了細胞信號調控的深度和廣度，是真核生物發揮複雜生物功能的基礎。每個細胞大約含10億個蛋白質分子，蛋白質的基本組成單位是胺基酸，胺基酸首先按照不同的組成和順序靠共價鍵形成一條多肽鏈，然後多肽鏈再摺疊成為具有高級空間構象的活性蛋白質，分布到細胞不同的區域去執行不同的生理功能，有的構成細胞骨架蛋白，有的成為受體分子，有的具有酶活性等等。那麼這些蛋白是通過什麼機制被進行分選然後定位到特定的細胞區域的？這個問題直到20世紀70年代才有了初步的答案。60年代後期Blobel進入了由George Palade領導的洛克菲勒大學細胞生物學實驗室研究新生蛋白質轉運和分泌的機制。他於1971年第一次提出了「信號假說」，認為分泌到細胞外的蛋白質有一個內源信號，是這個信號指導了蛋白質穿越細胞膜；隨後在一系列可靠的生化試驗基礎上。Blobel於1975年描述了其從合成到分泌到胞外的各個步驟的詳細過程，指導蛋白分泌到胞外的是一段疏水性多肽，蛋白質在合成的過程中依賴於這段多肽通過一個通道穿過內質網膜，然後經過分選進入分泌途徑。後來的研究表明，不同的蛋白質具有不同的細胞定位信號，指導其靶向轉運到不同的細胞器上去，比如靶向內質網、溶酶體、線粒體、細胞核等
坐寸ο蛋白質的轉運和定位機制對於細胞的正常的生理功能至關重要，許多人類的遺傳性疾病就是由於這種信號和轉運機制出錯所致，比如原發性草酸尿症是由於蛋白質的分選信號改變導致蛋白質的定位出錯，使人在早年便出現腎結石。某些家族性高膽固醇血症也是由於運輸信號缺失造成血液中高膽固醇累積。研究蛋白質的轉運和定位信號具有很大的應用價值，比如將蛋白藥物與分泌表達的信號肽融合表達，可以得到分泌形式的成熟蛋白，此技術已經在多肽藥物生產方面被廣泛應用。此外，多肽在藥物靶向運送及疾病治療中也具有廣泛的應用，比如可以利用HIV的 rev蛋白具有核定位信號的機制，可以將治療基因通過慢病毒載體轉移到細胞核中，以進行疾病的細胞定向基因治療。實際上，在細胞內除了上述的具有膜結構的細胞器外，還有一些非膜結構重要的細胞器，比如染色體、中心粒、核糖體、核仁等等。這些特化的大分子結構對細胞功能的正常發揮也具有重要的作用。比如中心粒是由排列成圓筒狀的9束三體微管組成的非膜結構細胞器，其與細胞分裂過程中紡錘體的形成有關，並能決定細胞分裂的方向。核仁是哺乳動物細胞核內的一個亞細胞非膜性細胞器，主要由rDNA，rRNA和多種核仁定位蛋白組成。以前認為核仁的主要功能是合成和組裝核糖體亞單位，但是最近隨著研究的深入，目前發現核仁還具有很多重要的生物學功能，與DNA損傷修復、細胞周期調控、衰老以及脅迫反應等眾多重要的細胞事件有關，而且發現很多與疾病和癌症發生和發展相關的蛋白質在細胞核仁中具有定位現象。因此研究核仁定位信號，不僅可以揭示核仁定位蛋白質基本的生物學功能和機制，同時還能為特異的核仁靶向生物技術藥物開發提供技術支持。

發明內容
本發明的目的是提供一種核仁定位信號肽及其編碼基因和應用。本發明提供的多肽，是一種核仁定位信號肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)將序列I的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有核仁定位信號肽功能的由序列I衍生的多肽。所述取代和/或缺失和/或添加位於五個結構域以外；所述五個結構域依次為序列表的序列I自N末端第4至6位(RLR基序)、第12至13位(LR基序)、第16至18位 (RLR基序)、24至26位(RLR基序)、第34至35位(LR基序)、第41至46位(核定位信號)。序列表中序列I所示的胺基酸即序列表的序列3自N末端第347至400位胺基酸殘基。編碼所述多肽的基因也屬於本發明的保護範圍。所述基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有核仁定位信號肽功能蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有核仁定位信號肽功能蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在O. IXSSPE(或O. I X SSC), O. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交並洗膜。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。所述重組表達載體具體可為將所述基因插入質粒PEGFP-Cl的多克隆位點得到的重組質粒。本發明還保護所述多肽在將目標蛋白定位於核仁中的應用。所述目標蛋白具體可如序列表中序列4自N末端第I至346位胺基酸殘基所示。本發明還保護一種將目標蛋白定位於核仁中的方法，是採用所述多肽作為核仁定位信號肽將目標蛋白定位於核仁中。所述核仁為細胞的核仁。所述細胞具體可為HeLa細胞、U251細胞或HEK293細胞。所述方法具體可為將融合基因導入細胞並表達，從而將目標蛋白定位於所述細胞的核仁中；所述融合基因自上遊至下遊依次包括所述多肽的編碼基因和所述目標蛋白的編碼基因。本發明提供了一種核仁定位信號肽及其編碼基因。本發明提供的核仁定位信號肽可將目標蛋白的靶向核仁定位。將本發明提供的核仁定位信號肽和適宜的目標蛋白形成融合蛋白，可以得到用於治療惡性腫瘤、血液病，病毒感染等疾病的藥物，並實現高效給藥。本發明對於生物技術領域和醫藥領域具有重大價值。


圖I為重組質粒pEGFP-Cl-PICT-Ι的酶切電泳圖。圖2為GFP-PICT-I融合蛋白的亞細胞定位的雷射共聚焦觀察；綠色螢光為 PICT-I蛋白的定位，藍色螢光代表DAPI染色的細胞核，Merge是將PICT-I蛋白定位和DAPI 染色的兩個圖片疊加。圖3為內源PICT-I蛋白亞細胞定位的雷射共聚焦觀察；綠色螢光為PICT-I蛋白的定位，藍色螢光代表DAPI染色的細胞核，Merge是將PICT-I蛋白定位和DAPI染色的兩個圖片置加。圖4為含有各個核仁定位蛋白的編碼基因的重組質粒的的酶切電泳圖。圖5為PICT-I蛋白與UBFl蛋白、B23蛋白、S5蛋白、L9蛋白亞細胞共定位的雷射共聚焦觀察；紅色螢光代表PICT-I蛋白，綠色螢光代表GFP-B23融合蛋白、GFP-UBFl融合蛋白、GFP-L9融合蛋白或GFP-S5融合蛋白，藍色蛋白DAPI染色的細胞核，Merge代表前三者的圖片疊加；A =GFP-UBFl融合蛋白；B GFP-B23融合蛋白；C GFP-S5融合蛋白；DGFP_L9 融合蛋白。圖6為PICT-I蛋白與內源nucleolin蛋白的亞細胞共定位的雷射共聚焦觀察；紅色代表PICT-I蛋白，綠色代表nucleolin蛋白的定位，藍色代表DAPI染色的細胞核，Merge 代表前三者的圖片疊加。圖7為PICT-I蛋白片段亞細胞定位的雷射共聚焦研究；綠色螢光代表各個 PICT-I蛋白片段，藍色代表DAPI染色的細胞核，Merge代表前兩者的圖片疊加。圖8為PICT-I蛋白的347-386片段、347-400片段和347-400突變片段的亞細胞定位；綠色螢光代表PICT-I各片段的亞細胞定位，藍色代表DAPI染色的細胞核，Merge代表iu兩者的圖片置加。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。HeLa細胞購自ATCC，目錄號為CCL-2 。U251細胞購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，資源編號為3115CNCB00312。HEK293 細胞購自 ATCC，目錄號為 CRL-1573。實施例I、PICT-I蛋白核定位性能的發現研究發現在人彌散性神經膠質瘤(Diffuse glioma)的19號染色體長臂上一段 150Kb的片段經常發生等位缺失現象(LOH)，這說明在這個區域可能存在有腫瘤抑制基因， 其缺失能導致人類神經膠質瘤的發生和發展。2000年，Smith等人在這個區域鑑定了 5個基因，其中兩個為已知的SEPWl和CRX基因，另外三個是新基因，將其分別命名為GLTSCR1、 EHD2和GLTSCR2。2004年，Okahara等利用酵母雙雜交技術以PTEN的C末端作為誘餌蛋白， 篩選人腦cDNA文庫，得到了一個陽性克隆，將其命名為PICT-1，分析發現其編碼基因就是 GLTSCR2。Okahara等人證明重要抑癌基因PTEN和PICT-I之間存在物理相互作用。PICT-I 蛋白與PTEN的結合是由PTEN的C末端介導的。進一步研究表明PICT-I能夠通過與PTEN 結合促進PTEN的磷酸化，穩定PTEN，進而抑制PI3K/AKT信號的過度活化，抑制腫瘤的發生和生長。然而，PICT-I的結構、細胞定位以及其所參與的細胞信號調控途徑還遠沒有研究清楚。一、全長PICT-I基因的克隆和表達載體的構建I、提取HeLa細胞的總RNA提取。2、將步驟I的總RNA反轉錄為cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用PICT-IF和PICT-IR組成的引物對進行PCR擴增， 得到PCR擴增產物。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3』 ；PICT-1R : 5，-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3，。PCR 擴增體系(50 μ I) PFU DNA 聚合酶 O. 5 μ I、10 X buffer 5 μ I、cDNA 模板 I μ l.dNTP Mixture (2. 5mM)4y I, PICT-IF 引物 I μ 1、PICT_1R 引物 I μ 1，其餘為 ddH20。PCR 擴增條件95°C 5min ；95°C 30s、57°C 30s,72°C lmin，35 個循環；72°C IOmin04、用限制性內切酶EcoRI和BamHI雙酶切步驟3的PCR擴增產物(37°C酶切4小時)，得到酶切產物。5、用限制性內切酶EcoRI和BamHI雙酶切質粒pEGFP-Cl (Clontech公司， Catalog#6084-1)，回收約4. 7kb的載體骨架。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒 pEGFP-Cl-PICT-Ι。重組質粒 pEGFP-Cl-PICT-l 的酶切電泳圖見圖 I (EcoRI 和 BamHI)，I 為marker，2為酶切產物，釋放出一條約1500bp的DNA片段。根據測序結果，對重組質粒 pEGFP-Cl-PICT-l進行結構描述如下在質粒pEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的全長PICT-I基因(GenBank編號NM_015710. 4)，全長PICT-I基因與載體上的GFP基因形成融合基因，表達GFP-PICT-I融合蛋白。二、外源PICT-I蛋白的亞細胞定位研究用重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l分別轉染不同細胞(HeLa細胞、U251細胞或HEK293 細胞)，具體方法如下I、轉染前一天，將細胞消化成單細胞，以1.0X106的密度重新接種入雷射共聚焦觀察專用培養皿；第二天細胞生長到80-90%匯合度時開始進行如下轉染轉染前先用PBS 緩衝液洗滌細胞兩次，然後加入無雙抗無血清的DMEM培養基。2、在兩個EP管中分別用250 μ I DMEM培養基(無雙抗無血清)懸浮2 μ g重組質粒和5μ1 Lipofectamin TM 2000 (購自invitrogen),室溫放置5min後將兩管混合混勻並室溫放置20min，然後將混合液均勻的滴加入步驟I的培養皿中，在5% C02、37°C培養箱中培養5小時；然後將培養基更換為含10%胎牛血清和雙抗(100U/mL青黴素、100mg/L鏈黴素)的完全DMEM培養基，繼續培養24小時；然後用PBS緩衝液洗滌，加入Iml甲醇固定2分鐘，吸棄甲醇，加入含有100 μ g/ml DAPI的PBS緩衝液室溫染色10分鐘，用PBS緩衝液洗滌後向培養皿的凹槽內滴加甘油覆蓋細胞。3、將培養皿置於雷射共聚焦顯微鏡下，觀察GFP-PICT-I融合蛋白的亞細胞定位情況。轉染U251細胞的結果見圖2，藍色代表細胞核(DAPI染色顯示為藍色)，綠色代表 GFP-PICT-I融合蛋白(GFP顯示為綠色)。可以觀察到，GFP-PICT-I融合蛋白以顆粒狀形態分布於細胞核內。轉染HeLa細胞的結果、轉染HEK293細胞的結果均與轉染U251細胞的結果一致。結果表明，PICT-I蛋白中具有核定位信號。三、內源PICT-I蛋白亞細胞定位的研究為了研究是否內源PICT-I蛋白是否具有與GFP-PICT-I融合蛋白具有相似的定位和形態，對HeLa細胞進行了免疫螢光實驗，具體步驟如下I、同步驟二的I。2、第二天用PBS緩衝液洗滌細胞，然後加入4%的多聚甲醛室溫輕搖固定15分鐘； 用PBS緩衝液洗滌細胞，加入O. I %的Triton-100室溫放置7分鐘，用PBS緩衝液洗滌細胞，加入含有3%牛血清白蛋白的PBS緩衝液室溫封閉I小時，吸棄上清，加入一抗稀釋液 (用含有3%牛血清白蛋白的PBS緩衝液按照I : 50的體積比稀釋Santa Cruz公司生產的 PICT-I蛋白一抗)4°C孵育4小時，用PBS緩衝液洗滌細胞，加入二抗稀釋液(用含有I. 5% 牛血清白蛋白的PBS緩衝液按照I : 50的體積比稀釋KPL公司生產的FITC標記的二抗) 室溫放置I小時，用PBS緩衝液洗滌細胞，然後加入含有100 μ g/ml DAPI的PBS緩衝液室溫染色10分鐘，用PBS緩衝液洗滌，向培養皿的凹槽內的細胞上滴加螢光防淬滅劑。3、將培養皿置於雷射共聚焦顯微鏡下，觀察PICT-I蛋白的亞細胞定位情況。結果見圖3，藍色代表細胞核，綠色代表PICT-I蛋白。可以觀察到，與GFP-PICT-I融合蛋白相似，內源的PICT-I蛋白也是定位於細胞核內，且呈現點狀分布。四、PICT-I蛋白是一個核仁定位蛋白分別從HeLa細胞中提取總RNA並反轉錄為cDNA，以該cDNA為模板分別克隆幾個已知的核仁定位蛋白的編碼基因(B23基因、UBFl基因、L9基因和S5基因)並分別連接入質粒pEGFP-Cl中，得到各種重組質粒(具體方法同步驟一)，各個編碼基因分別於載體上的 GFP基因融合，表達各個融合蛋白(GFP-B23融合蛋白、GFP-UBFl融合蛋白、GFP-L9融合蛋白、GFP-S5融合蛋白)。擴增B23基因的引物如下B23F:5』 -CGGAATTCTATGGAAGATTCGATGGACATG-3』 ；B23R : 5 』 -CGGGATCCTTAAAGAGACTTCCTCCACTG-3，。擴增UBFl基因的引物如下UBFlF :5』 -CGGAATTCTATGAACGGAGAAGCCGACTGC-3』 ；UBFlR :5』 -CGGGATCCTCAGTTGGAGTCAGAGTCTGAGGA-3，。擴增L9基因的引物如下L9F:5』 -CGGAATTCTATGAAGACTATTCTCAGCAAT-3』 ；L9R : 5 』 -CGGGATCCTTATTCATCAGCCTGCTGAAC-3，。擴增S5基因的引物如下S5F:5』 -CGGAATTCTATGACCGAGTGGGAGACAGCA-3』 ；
S5R : 5 』 -CGGGATCCTCAGCGGTTGGACTTGGCCAC-3』。各個重組質粒的酶切電泳圖見圖4 (EcoRI和BamHI)，M為marker，I和2為插入 UBFl基因的重組質粒的酶切產物，3和4為插入B23基因的重組質粒的酶切產物，5和6為插入S5基因的重組質粒的酶切產物，7和8為插入L9基因的重組質粒的酶切產物。酶切重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l，回收目的基因片段，插入質粒DsRed-Cl的相應酶切位點中(全長PICT-I基因與載體上的紅色螢光蛋白基因融合，表達RFP-PICT-I融合蛋白)，得到重組質粒DsRedCl-PICT-I。將重組質粒DsRedCl-PICT-I分別與含有各個核仁定位蛋白的編碼基因的重組質粒共轉染細胞(HeLa細胞、U251細胞或HEK293細胞)。轉染 24小時後，DAPI染色後進行雷射共聚焦觀察。U251細胞的結果見圖5，藍色代表細胞核，綠色代表GFP-B23融合蛋白、GFP-UBFl融合蛋白、GFP-L9融合蛋白或GFP-S5融合蛋白，紅色代表RFP-PICT-I融合蛋白。可以觀察到RFP-PICT-I融合蛋白與GFP融合的幾種已知核仁蛋白具有非常好的定位，說明PICT-I的確是一個核仁定位蛋白。為了進一步證明PICT-I 是一個核仁定位蛋白，首先用重組質粒DsRedCl-PICT-I轉染HeLa細胞，轉染24小時後，利用一個已知的核仁蛋白nucleolin的特異性一抗對細胞進行免疫螢光染色，然後進行雷射共聚焦觀察。結果見圖6。可以觀察到，雖然內源的nucleolin核仁指示蛋白與PICT-I蛋白不具有完全一致的形態，但PICT-1蛋白的確分布於核仁內。實施例2、核仁定位信號肽的發現及其功能鑑定一、重組質粒的構建I、重組質粒I的構建(I)以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用PICT-1F和346R組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3』 ；346R 5，-CGGGATCCTCACTTCTCCCGCCGCCGCTGCTGCT-3，。步驟⑵至(5)依次同實施例一的步驟一的2至5。(6)將步驟(4)的酶切產物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質粒I。根據測序結果，對重組質粒I進行結構描述如下在質粒pEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第I至1038位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第I至346位胺基酸殘基組成的片段，簡稱1_346片段)。2、重組質粒II的構建(I)以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用347F和PICT-IR組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物。347F:5』 ~CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA~3J ；PICT-IR :5，~CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC~3，。步驟⑵至(5)依次同實施例一的步驟一的2至5。(6)將步驟(4)的酶切產物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質粒II。根據測序結果，對重組質粒II進行結構描述如下在質粒PEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第1039至1437位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第347至479位胺基酸殘基組成的片段，簡稱347-479 片段)。
3、重組質粒III的構建(I)以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用PICT-1F和356R組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3』 ；356R : 5 』 -CGGGATCCTCAGGCCTGCTGTACCCGCAGCCTGT-3，。步驟⑵至(5)依次同實施例一的步驟一的2至5。(6)將步驟(4)的酶切產物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質粒III。根據測序結果，對重組質粒III進行結構描述如下在質粒PEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第I至1068位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第I至356位胺基酸殘基組成的片段，簡稱1_356片段)。4、重組質粒IV的構建(1-386片段)(I)以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用PICT-1F和386R組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3』 ；386R 5，-CGGGATCCTCACGCCAGCTCCGCCAGCCTCA-3，。步驟⑵至(5)依次同實施例一的步驟一的2至5。(6)將步驟(4)的酶切產物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質粒IV。根據測序結果，對重組質粒IV進行結構描述如下在質粒PEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第I至1158位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第I至386位胺基酸殘基組成的片段，簡稱1_386片段)。5、重組質粒V的構建(1-400片段)(I)以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用PICT-1F和400R組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3』 ；400R 5，-CGGGATCCTCAAGCCTCAGCCTCCCGCCGCGCCT-3，。步驟⑵至(5)依次同實施例一的步驟一的2至5。(6)將步驟(4)的酶切產物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質粒V。根據測序結果，對重組質粒V進行結構描述如下在質粒pEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第I至1200位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第I至400位胺基酸殘基組成的片段，簡稱1_400片段)。二、各個蛋白片段的細胞定位研究用步驟一構建的各個重組質粒分別轉染HeLa細胞，具體方法同實施例I的步驟

結果見圖7，藍色代表細胞核，綠色代表與GFP融合的各個PICT-I蛋白片段。1-346 片段雖然還是定位在細胞核內，但已經彌散到整個細胞核，說明這個片段中不包含有核仁定位信號。347-479片段也分布於細胞核內，而且與野生型PICT-I具有相同的形態，即呈斑點狀分布於細胞核內，說明這段序列中含有核仁定位信號。1-356片段雖然還是主要以彌散狀分布於細胞核內，但在核仁內也出現了斑點狀分布。1-386片段和1-400片段都呈現出了與野生型完全一致的分布特點。三、重組質粒VI的構建(347-386片段)I、以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用347F和386R組成的引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物。347F 5，-CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA-3，；386R 5，-CGGGATCCTCACGCCAGCTCCGCCAGCCTCA-3，。步驟2至5依次同實施例一的步驟一的2至5。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒VI。根據測序結果，對重組質粒VI進行結構描述如下在質粒pEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第1039至1158位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第347至386位胺基酸殘基組成的片段，簡稱347-386片段)。四、蛋白片段的細胞定位研究用步驟三構建的重組質粒轉染HeLa細胞,具體方法同實施例I的步驟二。結果見圖8A，藍色代表細胞核，綠色代表與GFP融合的347-386片段。347-386片段並沒有表現出嚴格的核仁定位。五、重組質粒VII的構建(347-400片段)I、以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，用347F和400R組成的引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物。347F:5』 ~CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA~3J ；400R 5，-CGGGATCCTCAAGCCTCAGCCTCCCGCCGCGCCT-3，。步驟2至5依次同實施例一的步驟一的2至5。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒VII。根據測序結果，對重組質粒VII進行結構描述如下在質粒pEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列4自5』末端第1039至1200位核苷酸所示的DNA片段(表達序列表的序列3所示PICT-I蛋白自N末端第347至400位胺基酸殘基組成的片段，簡稱347-400 片段)。六、蛋白片段的細胞定位研究用步驟五構建的重組質粒轉染HeLa細胞,具體方法同實施例I的步驟二。結果見圖8B，藍色代表細胞核，綠色代表與GFP融合的347-400片段。347-400片段表現出了與野生型PICT-I蛋白一樣嚴格的核仁定位狀態。以上結果表明，序列表的序列I所示多肽片段為具有核仁定位功能的信號肽，該信號肽的編碼序列具體如序列表的序列2所示。實施例3、信號肽的胺基酸殘基突變及其功能驗證因為核定位或者核仁定位信號一般都含有精氨酸基序，所以發明人認為在序列I 中，RLR和LR基序應該對其核仁靶向起重要作用。—、重組表達載體的構建I、以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，採用PICT-1F和mutR組成的引物對進行
10PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF和mutR組成的引物對的靶序列為序列表的序列4 自5』末端第I至1074位核苷酸所示的DNA片段，且當將其中第1048至1056位核苷酸由 「aggctgcgg」 突變為了 「GCGGCTGCA」，即第一個 「RLR 基序」突變成 「AAA」。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3，；mutR 5，-ACGCGGCCTGCTGTACTGCAGCCGCGTGCACAGCCTTCTC-3，。2、以重組質粒pEGFP-Cl-PICT-l為模板，採用mutF和PICT-I組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF和mutR組成的引物對的靶序列為序列表的序列4 自5』末端第1037至1437位核苷酸所示的DNA片段，且當將其中第1048至1056位核苷酸由「aggctgcgg」突變為了 「GCGGCTGCA」，即第一個「RLR基序」突變成「AAA」。mutF:5』 -GAGAAGGCTGTGCACGCGGCTGCAGTACAGCAGGCCGCGT-3』 ；PICT-IR :5，-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3，。3、將步驟I和PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物的等質量混合物作為模板， 採用PICT-IF和PICT-IR進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PICT-IF :5，-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3，；PICT-1R : 5，-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3，。4、以步驟3的PCR擴增產物為模板，採用347F和400R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。347F:5』 -CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA-3』 ；400R 5，-CGGGATCCTCAAGCCTCAGCCTCCCGCCGCGCCT-3，。5、用限制性內切酶EcoRI和BamHI雙酶切步驟4的PCR擴增產物(37°C酶切4小時)，得到酶切產物。6、用限制性內切酶EcoRI和BamHI雙酶切質粒pEGFP-Cl (Clontech公司， Catalog#6084-1)，回收約4. 7kb的載體骨架。7、將步驟5的酶切產物和步驟6的載體骨架連接，得到重組質粒VIII。根據測序結果，對重組質粒VIII進行結構描述如下在質粒PEGFP-Cl的EcoRI和BamHI酶切位點之間插入了突變DNA片段(突變DNA片段與序列表的序列4自5』末端第1039至1200位核苷酸所示的DNA片段的差異僅在於將其中第1048至1056位核苷酸由「aggctgcgg」突變為了 「GCGGCTGCA」)，突變DNA片段表達突變蛋白片段(突變蛋白片段與序列表的序列3所示 PICT-I蛋白自N末端第347至400位胺基酸殘基組成的片段的差異僅在於將第350至352 位胺基酸殘基由「RLR」突變成「AAA」，突變蛋白片段簡稱347-400mt片段)。二、蛋白片段的細胞定位研究用步驟一構建的重組質粒轉染HeLa細胞,具體方法同實施例I的步驟二。結果見圖8C，347_400mt片段雖然也有核仁定位，但也彌散到了整個細胞核，這說明第一個RLR基序的突變影響了核仁定位信號的靶向能力。綜上所述，發明人鑑定得到了核仁定位信號序列，其典型特徵是包含有三個RLR 和兩個LR基序，另外還包含一個典型的核定位信號(RRRRRR)。
權利要求
1.多肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)將序列I的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有核仁定位信號肽功能的由序列I衍生的多肽。
2.編碼權利要求I所述多肽的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因是如下I)至3)中任一所述的DNA 分子1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有核仁定位信號肽功能蛋白的 DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有核仁定位信號肽功能蛋白的 DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為將權利要求2 或3所述基因插入質粒pEGFP-Cl的多克隆位點得到的重組質粒。
6.權利要求I所述多肽在將目標蛋白定位於核仁中的應用。
7.一種將目標蛋白定位於核仁中的方法，是採用權利要求I所述多肽作為核仁定位信號肽將目標蛋白定位於核仁中。
全文摘要
本發明公開了一種核仁定位信號肽及其編碼基因和應用。本發明提供的核仁定位信號肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有核仁定位信號肽功能的由序列1衍生的多肽。本發明提供了一種核仁定位信號肽及其編碼基因。本發明提供的核仁定位信號肽可將目標蛋白的靶向核仁定位。將本發明提供的核仁定位信號肽和適宜的目標蛋白形成融合蛋白，可以得到用於治療惡性腫瘤、血液病，病毒感染等疾病的藥物，並實現高效給藥。本發明對於生物技術領域和醫藥領域具有重大價值。
文檔編號C12N15/12GK102584975SQ20121002710
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月8日 優先權日2012年2月8日
發明者周蘭貞, 李俊暢, 梅林 , 鄭義, 陳紅波, 黃來強 申請人:清華大學深圳研究生院