一種快速檢測腸出血性大腸埃希菌的納米生物傳感器的製作方法

2023-05-08 22:16:16

專利名稱：一種快速檢測腸出血性大腸埃希菌的納米生物傳感器的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物傳感器領域，涉及一種新型基於適配體的光化學生物傳感器，以及這種光化學生物傳感器用於檢測腸出血性大腸埃希菌。
背景技術：
含有丁二炔結構的類脂在形成高度有序而緊密的排列以後，在254nm的紫外光照射下可以聚合形成藍色的聚丁二炔結構。這種聚丁二炔結構隨著所處環境的溫度、溶劑、PH 及其受到的機械應力的改變，其顏色會發生相應的變化。基於這一特殊的光學性質，使得具有聚丁二炔結構的類脂成為製備生物傳感器的信號傳導元件的理想材料。1993年D. H. Charych等人在kience上發表了一篇關於利用功能化聚丁二炔變色薄膜可以識別流感病毒的文章，引起了人們的普遍關注。他們利用10，12-二十五烷基二炔酸(PCDA)為基脂，唾液酸化的PCDA為受體分子，製備功能化LB膜(Langmuir-Blodgett Films)，這種薄膜呈現藍色。當唾液酸遇到信息源感冒病毒時，引起聚丁二炔結構的電子態和重量的改變，最終導致信息處理部分(聚丁二炔結構)的顏色由藍變紅，這種現象肉眼明顯可見，從而開創了聚丁二炔製備生物傳感器的先河。適配體是一類具有高度親和力和能夠高度特異性識別結合目標分子的寡核苷酸序列，其靶分子範圍廣，從小分子藥物和染料，到酶分子、多肽以及蛋白質等複雜的生物大分子。這種人工配體是通過一種新的體外篩選技術-SELEX (指數富集配體系統進化)，從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中篩選得到的。由於適配體具有與抗體相同或優於抗體的選擇性和親和力，所以在檢測系統中以適配體取代抗體進行蛋白質分子識別成為一種趨勢。另外，與抗體相比，適配體還具有幾個優點，如熱穩定性增加、耐廣泛的PH值和鹽濃度以及合成、修飾和固化方法簡便。更重要的是，適配體可以通過核苷酸變性而失去與靶物質結合的能力， 利用這種特性可以製成可重複使用的生物傳感器。目前，人們已經發展各種方法將適配體固化在固體表面並將其應用於蛋白捕獲分離和生物傳感器的製備。然而，現在利用適配體作為分子識別元件進行製備適配體生物傳感器，往往修飾過程過於複雜，檢測靶分子方法繁瑣，不適合快速檢測靶分子的要求。

發明內容
本發明目的是提供修飾過程簡單的一種新型基於適配體的光化學生物傳感器，以及利用所述生物傳感器快速檢測腸出血性大腸埃希菌。這種新型光化學生物傳感器的特徵在於用化學、物理或生物學方法將適配體修飾到聚丁二炔結構分子有序組合體，構建成具有特異性識別腸出血性大腸埃希菌功能的光化學生物傳感器。含有丁二炔結構的兩親性單體分子，在水溶液中，其親水基團在水中十分穩定，而疏水基團極不穩定，整體上來說，是一個能量上不穩定體系。兩親性分子在熱力學上要處於低能量，首先是使其疏水鏈浮到水面上指向空氣，減少分子在水中的不相溶性。當水表面上
3鋪滿兩親性分子而水中分子無法進入表面時，則這些分子在水中抱成一團，使分子的親水基指向水介質，以求得能量上的穩定。將空氣-水界面平鋪的兩親性分子通過LB技術，轉移至固體支持物上，即製成聚丁二炔結構LB膜(Langmuir-Blodgett Films)。而對水中的兩親分子進行超聲處理，即可製備成囊泡結構。聚丁二炔LB膜和聚丁二炔囊泡具有相似的結構，只是兩種不同形式的分子有序組合體。在實際應用中，由於聚丁二炔囊泡具有空間三維結構，其表面的識別元件更容易與靶分子結合，靈敏度更高。我們可通過合適的功能鍵將聚丁二炔囊泡修飾到固體支持物上，即製成固化囊泡。本發明所述的化學方法是碳化二胺法，即通過N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽(EDC)的作用活化PCDA游離的羧基形成活潑酯。活潑酯與適配體5』端氨基反應形成醯胺鍵，從而將腸出血性大腸埃希菌適配體修飾到聚丁二炔結構分子有序組合體，製備成具有特異性識別腸出血性大腸埃希菌功能的光化學生物傳感器。本發明是一種基於適配體的光化學生物傳感器，包括分子識別元件和信號傳導裝置，用於分子識別的適配體其修飾在聚丁二炔結構分子有序組合體表面上。上述的分子識別元件為能特異性識別結合腸出血性大腸埃希菌的適配體。上述的信號傳導裝置是聚丁二炔結構分子有序組合體。上述的將適配體修飾在聚丁二炔結構分子有序組合體表面的方式為共價功能鍵修飾本發明提供了基於適配體的光化學生物傳感器檢測靶物質的方法，包括①製備聚丁二炔結構分子有序組合體，其中將用於檢測的適配體修飾在上述的聚丁二炔納米囊泡的表面，以提供上述適配體能夠識別結合腸出血性大腸埃希菌的結構；②在修飾適配體的聚丁二炔結構分子有序組合體，暴露在腸出血性大腸埃希菌環境的情況下，測量聚丁二炔納米囊泡的紫外-可見光吸光度和螢光強度的變化；③基於吸光度和螢光強度的變化檢測/鑑定腸出血性大腸埃希菌。本實用新型與以往組裝的生物識別元件相比，修飾過程簡單，可以進行快速檢測， 因此本實用新型基於適配體的光化學生物傳感器以及用其檢測腸出血性大腸埃希菌，可以廣泛應用於生物化學研究、生物反恐、流行病普查以及臨床檢驗診斷等方面。


圖1是碳化二胺法介導氨基化適配體修飾到聚丁二炔囊泡表面的示意圖；圖2是修飾適配體的聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜；圖3是適配體囊泡比色檢測腸出血性大腸埃希菌示意圖；圖4表示加入腸出血性大腸埃希菌後囊泡變化CR%值隨時間變化曲線；圖5表示不同濃度腸出血性大腸埃希菌引起聚丁二炔囊泡的CR%值變化及檢測線性範圍；符號說明X為適配體修飾後的聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜；Y為未用適配體進行修飾的聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜；Z為微孔板空白對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例和附圖對本實用新型作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。實施例11.納米生物傳感器的製備(1)腸出血性大腸埃希菌特異性適配體的合成與氨基修飾5』端氨基化修飾的腸出血性大腸埃希菌特異性適配體由柏業貿易(上海)有限公司負責合成並完成氨基修飾。利用Maldi-Tof質譜分析進行質量控制。適配體5，Amine-C6-ATCAAATGTGCAGATATCAAGACGATTTGTACAAGAT上述適配體用滅菌水溶解，分裝，_20°C保存。使用之前，95°C變性5min。(2)腸出血性大腸埃希菌光化學生物傳感器的製備-聚丁二炔脂質納米囊泡的製備與修飾將PCDA溶解於氯仿，配成lmmol/L終濃度。取適量該溶液在氮氣氛下，真空乾燥成薄脂質膜，加入去離子水使溶液終濃度至lmmol/L，使得類脂的總濃度為lmmol/L。避光， 72°C超聲乳化15min，直至溶液透明或半透明。將獲得的溶液置於4°C過夜，以便於囊泡完全閉合。取出閉合囊泡溶液，待其恢復到室溫，用手持式紫外燈OMnm)照射30min，直至出現深藍色，得到聚丁二炔囊泡，製備好的囊泡置於4°C保存。以上過程在紫外照射聚合前，均需在避光條件下進行。取100 μ L的lmmol/L PCDA囊泡，向其中分別加入4mmol/L NHS水溶液50 μ L禾口 4mmol/L EDC 'HCl水溶液50 μ L，反應2h後，加入IOnmol適配體水溶液，補充雙蒸水至lmL。 繼續室溫反應他。反應結束後，在D-Tube Dialyzer (merck)中充分透析去除未反應的適配體等。2.納米生物傳感器快速檢測腸出血性大腸埃希菌(1)細菌的培養與計數在LB液體培養基於37°C條件下培養16 18h，然後用滅菌水將菌體溶液依次稀釋成8個濃度梯度，分別裝入8個小瓶，從101到108，每瓶1ml，分別標號1 8。細胞計數使用傳統的平板計數方法，在分裝好的含有活菌的溶液中取50 μ 1平鋪在普通瓊脂的表面，於37°C培養24h後計數。培養物計數完成後與裝有活菌的小瓶在121°C下30min滅活， 於4°C冰箱保存。(2)腸出血性大腸埃希菌光化學生物傳感器比色檢測腸出血性大腸埃希菌為了定量分析聚丁二炔納米囊泡的藍色-紅色的顏色變化程度，我們定義比色響應(colorimetric response,簡寫 CR) CR% = [(PBO-PBf) /ΡΒ0] X 100%其中，PB = Ablue/(Ablue+Ared)，A是藍色聚丁二炔組份在640nm左右的吸收強度或紅色聚丁二炔組份在540nm左右的吸收強度，PBO是加入融合蛋白質之前聚丁二炔對紅波吸收所佔的百分數，PBf是加入融合蛋白質之後聚丁二炔紅波吸收所佔的百分數。CR% 值越大，表明囊泡溶液的顏色越紅。將上述製備的修飾適配體的聚丁二炔脂質納米囊泡用移液器分裝於96孔 Microtiter-UV微孔板中，每孔各100 μ L。將腸出血性大腸埃希菌菌液稀釋後配成一系列的菌液濃度(分別調至 108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml)，加入上述含有囊泡的孔中充分混勻後，在37°C或室溫孵育30min。採用Varioskan Flash多功能酶標儀(Thermo Scientific)進行400 700nm的全波長掃描，測試孵育前後的可見吸收光譜，同時檢測孵育前後的A640和AM0，並計算CR%值，繪製曲線。(3)實驗結果碳化二胺法介導氨基化適配體修飾到聚丁二炔囊泡表面的示意圖見圖1。修飾適配體的聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜見圖2，圖中X曲線為適配體修飾後的聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜，Y曲線為未用適配體進行修飾的聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜，Z曲線為空白對照的吸收光譜。從結果中可以看出，修飾適配體的聚丁二炔囊泡在^Onm處出現了吸收峰，而這個吸收峰正是核苷酸的特徵峰，同時我們可以看到未用適配體修飾的聚丁二炔囊泡在相應位置卻沒有吸收峰，可以認為適配體已經成功修飾在聚丁二炔囊泡表面。適配體囊泡比色檢測腸出血性大腸埃希菌示意圖見圖3。在微量離心管中比色檢測腸出血性大腸埃希菌，加入腸出血性大腸埃希菌會引起聚丁二炔囊泡的變色反應，圖4是隨著加入腸出血性大腸埃希菌時間的延長，藍色-紅色變色增加，CR%值逐漸增加。且隨著加入的腸出血性大腸埃希菌濃度增加，藍色-紅色變色增加，聚丁二炔囊泡的特徵吸收光譜亦隨著腸出血性大腸埃希菌的加入，最大吸收峰從640nm 處藍移至540nm處，且加入的腸出血性大腸埃希菌的量越大，640nm處的吸光度值下降越多，而MOnm處吸光度值上升越大。圖5用CR%定量地反映了顏色變化的程度，隨著腸出血性大腸埃希菌濃度的增加，CR%值逐漸增加，在IO4 108CFU/mL範圍內，CR%值與菌液濃度呈良好的線性關係，線性方程為Y = 10. 89X-45. 05，相關係數=0. 9991，檢測限為IO4CFU/ mL (S/N = 3)。
權利要求
1.一種基於適配體的光化學生物傳感器，包括分子識別元件和信號傳導裝置，其特徵在於用於分子識別的適配體修飾在聚丁二炔納米囊泡表面上。
2.根據權利要求1所述的基於適配體的光化學生物傳感器，其特徵在於所述的分子識別元件為能特異性識別結合腸出血性大腸埃希菌的適配體。
3.根據權利要求1所述的基於適配體的光化學生物傳感器，其特徵在於所述的信號傳導裝置是聚丁二炔結構分子有序組合體。
4.根據權利要求3的一種基於適配體的光化學生物傳感器，其中所述的聚丁二炔結構分子有序組合體為囊泡。
5.根據權利要求1所述的基於適配體的光化學生物傳感器，其特徵在於將適配體修飾在聚丁二炔結構分子有序組合體表面的方式為共價功能鍵修飾。
6.一種根據權利要求1 4任一項所述的基於適配體的光化學生物傳感器檢測靶物質，包括①製備聚丁二炔結構分子有序組合體，其中將用於檢測的腸出血性大腸埃希菌適配體修飾在所述的聚丁二炔結構分子有序組合體的表面，以提供腸出血性大腸埃希菌適配體序列；②在修飾適配體的聚丁二炔結構分子有序組合體，暴露在腸出血性大腸埃希菌環境的情況下，測量聚丁二炔納米囊泡的紫外-可見光吸光度和螢光強度的變化；③基於吸光度和螢光強度的變化檢測/鑑定腸出血性大腸埃希菌。
全文摘要
本發明涉及一種新型基於適配體的光化學生物傳感器用於檢測腸出血性大腸埃希菌，具體涉及一種利用寡核苷酸適配體識別靶分子-腸出血性大腸埃希菌脂多糖的聚丁二炔結構有序分子組合體光化學生物傳感器，以及利用上述聚丁二炔納米囊泡光化學生物傳感器檢測腸出血性大腸埃希菌。在本發明所述的光化學生物傳感器中，所述特異性結合腸出血性大腸埃希菌的適配體結合在聚丁二炔結構有序分子組合體的表面，以便於當所述腸出血性大腸埃希菌暴露於相應適配體時，通過變化的聚丁二炔納米囊泡的紫外-可見光吸光度或者螢光強度來檢測/鑑定特定腸出血性大腸埃希菌。
文檔編號C12Q1/68GK102175666SQ201110028770
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月21日 優先權日2011年1月21日
發明者呂建新, 王冠冠, 王安娜, 田際雲, 邱盈坡, 靳藝歆, 黃林瑤 申請人:溫州醫學院