肺癌標誌物sbp-1及其用途的製作方法

2023-05-09 08:22:41

專利名稱：肺癌標誌物sbp-1及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和腫瘤藥物領域。具體地說，本發明涉及一種肺癌標誌物SBP-1在肺癌診斷中的用途，及SBP-1作為標誌物用於肺癌的檢測方法。
背景技術：
研究報導，肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，也是全球發病率和死亡率增加最快的腫瘤。據統計，每年約有120萬患者被診斷為肺癌，110萬人死於肺癌。肺癌依據其組織病理學可分為兩大類:小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌又包含鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等。
迄今為止，全球的肺癌篩查方案尚不成熟。因此，早期篩查和診斷已經成為肺癌防治急需解決的重大科學問題。腫瘤標誌物的發現和合理應用是腫瘤早期發現、早期診斷的前提。然而，目前對有關肺癌的發病機制和特性的認識仍然不足，因此，研究者認為，直接從蛋白質整體水平入手研究肺癌的發病機制將有可能尋找出更合適的用於肺癌診斷的分子標誌物，這將為肺癌的診斷預防和治療提供關鍵依據。
現有的研究中表明，硒是一種具有抗癌效應的元素，它以無機亞硒酸鹽或有機硒酸鹽的形式存在於植物和其他有機食物中。人類硒基蛋白質組包含35種含硒蛋白質，它們具有廣泛的生理功能。其中，(selenium binding protein, SBP-1)是一種細胞溶質蛋白，由Medina等於1990年首次從老鼠的肝臟分離純化出來，該SBP-1為硒元素在體內的蛋白結合物，位於染色體lq21-22，分子量為56KD。因人類SBP與老鼠SP56基因為同系物，所以又稱為hSP56。目前已證實SBP-1在正常肝臟、肺、腎臟、結腸、前列腺、以及胰腺組織中高表達，在胸腺、睪丸、外周血細胞和腦組織中幾乎檢測不到。
迄今，尚未見有關有效地早期篩查和診斷肺癌的可供臨床應用的檢測試劑，尤其是以SBP-1作為標誌物用於肺癌的檢測試劑及方法，這將為深入地研究和大規模驗證SBP-1與肺癌的相關性，對癌症進行診斷以及為個體患者提供輔助治療方案具有重要意義。發明內容
本發明的目的是提供SBP-1的新用途。本發明提供了 SBP-1作為肺癌標誌物的用途，以及以SBP-1為靶標篩選抑制肺癌細胞侵襲的藥物的應用，為肺癌的診斷和治療提供參考依據。
本發明提供了 SBP-1作為肺癌標誌物的用途，主要針對小細胞肺癌和非小細胞肺癌；尤其是針對非小細胞肺癌的鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等。
相應的，本發明提供了一種肺癌診斷試劑盒，該試劑盒含有SBP-1。較好的，該試劑盒，主要針對小細胞肺癌和非小細胞肺癌的檢測；尤其是針對非小細胞肺癌的鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等的檢測。
通常，試劑盒中含有標準劑量的SBP-1蛋白對照品，操作手冊，稀釋液或者緩衝液坐寸ο
本發明中，檢測時，通常採用相關抗體等檢測樣本中SBP-1含量。
本發明中，通過SBP-1抗體來檢測SBP-1的存在。
本發明採用比較蛋白質組學方法對肺癌細胞系/組織和正常對照細胞/組織的蛋白質表達譜進行比較分析，質譜鑑定其中部分差異蛋白質點。SBP-1蛋白為其中一個差異點，即其在癌細胞中比正常細胞高表達，且可明顯區分。
採用Real-time PCR (以下簡稱RT-PCR)和免疫組化的技術，分別檢測肺癌患者及其配對的正常組織中的SBP-1的mRNA和蛋白表達表達水平，發現SBP-1在肺癌組織中表達明顯高於其配對的正常組織。該發現與比較蛋白質組的實驗結果一致，表明SBP-1能夠作為一種肺癌的診斷標誌物。
具體檢測時，可以先取待測樣本，然後分析比較待測樣本與正常對照中SBP-1的表達量。
為此，本發明提供了一種採用上述肺癌診斷試劑盒用於檢測肺癌的方法，試劑盒中含有標準劑量的SBP-1蛋白對照品，稀釋液或者緩衝液以及容器或液態晶片和標籤等，其特徵在於，該方法包括以下步驟:
(I)製備含有標準劑量的SBP-1蛋白對照品，稀釋液或者緩衝液以及容器或液態晶片和標籤的肺癌診斷試劑盒，所述的容器或液態晶片中分別設有:
a、SBP-1蛋白的特異性抗體；
b、PBS緩衝液ρΗ7.2-7.4，或0.0lmol檸檬酸鈉緩衝液ρΗ6.0，或3% Η202溶液，或辣根酶檢測試劑；
(2)製備重組蛋白，擴增 SBP-1的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達載體轉化或轉導至合適的宿主細胞；
(3)在合適的培養基中培養宿主細胞；
(4)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質；
(5)純化的SBP-1基因產物或者其具有抗原性的片段，注射於動物體內以誘導多克隆抗體製備的產生，同時特異性結合SBP-1蛋白的抗體，也可以是用於檢測比較的抗體；
(6)免疫組化:脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片於二甲苯中30min，脫蠟；然後通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化；
(7)抗原修復:將切片置於IOmM pH6.0檸檬酸緩衝液(pH6.0)中，微波爐加熱15min ；
(8)微波處理後的切片仍置於檸檬酸緩衝液中15min，然後用流動的水衝洗5min ；
(9)將切片放置於3% H202室溫孵育15min,以消除內源性過氧化物酶的活性；
(10)切片置於1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min ；
(11)然後通過免疫組化辣根酶系統的DAB ( 二氨基聯苯胺)底物染色；
(12)切片用蘇木精復染，然後通過一系列不同級別的乙醇浸泡至二甲苯，處理完的切片，鏡檢，實驗中以水或緩衝液代替多克隆抗體做陰性對照，以SBP-1過表達的標本為陽性對照，最後完成檢測。
本發明中，重組蛋白製備SBP-1的編碼序列通過RT-PCR獲得，引物分別是:S100A2-F:5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3 和 S100A2-R:5』 -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3』，模板用的是肺癌組織cDNA。獲得的DNA片段經限制性內切酶BamHI/XohI雙酶切後插入經BamHI/Xohl雙酶切的pGEX_4T_l中，構建重組質粒PGEX-4T-1-SBP-1。轉化重組質粒到BL21 (DE3)中誘導表達，誘導表達的SBP-1重組蛋白經過純化，並通過SDS-PAGE檢測。
本發明中，多克隆抗體製備用生理鹽水稀釋SBP-1重組蛋白，然後與弗氏不完全佐劑進行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和後大腿進行肌肉注射。每次免疫前採血2ml (獲得0.5-lml免疫前血清)，並進行ELISA和Western Blotting檢測。如果檢測為陰性或抗體效價較低，則需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100-150mg抗體，最後進行ELISA和WB等質量檢測。
本發明的實驗結果用獨立實驗的平均值和標準差表示，用雙側t檢驗來比較差異。P < 0.01認為具有統計學差異。所有數據採用SPSS V13.0軟體或者具備類似統計功能的軟體分析。實際檢測時待測樣本比正常對照中SBP-1的表達量高為陽性結果，結果顯示=SBP-1蛋白為差異蛋白質點其中一個差異點，其在癌細胞中比正常細胞高表達，且可明顯區分，表明SBP-1與肺癌腫瘤細胞有關。
從另一個角度說明，本發明的SBP-1可以作為篩選抑制肺癌細胞的藥物的藥靶。
本發明採用比較蛋白質組學方法對肺癌細胞系/組織和正常對照細胞/組織的蛋白質表達譜進行比較分析，質譜鑑定其中部分差異蛋白質點。SBP-1蛋白為其中一個差異點，即其在癌細胞中比正常細胞高表達，且可明顯區分。由此，提供了本發明的肺癌標誌物SBP-1在肺癌診斷中的用途，及SBP-1作為標誌物用於肺癌的檢測試劑及方法，將為深入地研究和大規模驗證SBP-1與肺癌的相關性，對癌症進行診斷以及為個體患者提供輔助治療方案具有重要意義。
下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。
具體實施方式
實施例1
採用比較蛋白質組學方法對肺癌細胞系/組織和正常對照細胞/組織的蛋白質表達譜進行比較分析，質譜鑑定其中部分差異蛋白質點；SBP-1蛋白為其中一個差異點，即其在癌細胞中比正常細胞高表達，且可明顯區分。採用Real-timePCR(以下簡稱RT-PCR)和免疫組化的技術，分別檢測了肺癌患者及其配對的正常組織中的SBP-1的mRNA和蛋白表達表達水平，發現SBP-1在肺癌組織中表達明顯高於其配對的正常組織。
本發明中，通過SBP-1抗體來檢測SBP-1的存在。
基於此，提供一種肺癌診斷試劑盒，該試劑盒中含有標準劑量的SBP-1蛋白對照品，操作手冊，稀釋液或者緩衝液等。該試劑盒主要針對小細胞肺癌和非小細胞肺癌的檢測；尤其是針對非小細胞肺癌的鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等的檢測。
所涉及的SBP-1蛋白質的兩種亞型(酸性型457和天然型460)，相對分子質量均為56KD，在人肺癌中近似等電點為6.3 6.6 ;另外，只存在於正常的肺臟組織中的SBP-1的相對分子質量相同的其他兩種亞型中，帶有更多的酸性基團，甚至有兩個或三個磷醯基。
採用上述肺癌診斷試劑盒檢測肺癌細胞:
I,通過重組DNA技術,表達或生產重組SBP-1蛋白，包括步驟:
(I)擴增SBP-1的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達載體轉化或轉導至合適的宿主細胞；
(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；
(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
所述的純化的SBP-1基因產物或者其具有抗原性的片段，可注射於動物體內以誘導多克隆抗體的產生，同時特異性結合SBP-1蛋白的抗體，也可以是商業化的抗體；
所涉及的免疫組化包括步驟:(I)脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片於二甲苯中30min，脫蠟；然後通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化。(2)抗原修復:將切片置於IOmMpH6.0朽1檬酸緩衝液(pH6.0)中，微波爐加熱15min。(3)微波處理後的切片仍置於朽1檬酸緩衝液中15min，然後用流動的水衝洗5min。(4)將切片放置於3% H2O2室溫孵育15min，以消除內源性過氧化物酶的活性。(5)切片置於1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min。(6)然後通過免疫組化辣根酶系統的DAB (二氨基聯苯胺)底物染色。(7)切片用蘇木精復染，然後通過一系列不同級別的乙醇浸泡至二甲苯；處理完的切片，鏡檢；實驗中以水或緩衝液代替多克隆抗體做陰性對照，以SBP-1過表達的標本為陽性對照。
2，製備重組蛋白
通過RT-PCR獲得SBP-1的編碼序列，引物分別為:S100A2-F:5，-GGATCCGAACTTCTGCACAAGG-3，和 S100A2-R:5，-CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3，，以肺癌組織cDNA為模板；獲得的DNA片段經限制性內切酶BamHI/Xohl雙酶切後插入經BamHI/XohI雙酶切的pGEX-4T-l中，構建重組質粒pGEX-4T-l-SBP-l ;轉化重組質粒到BL21 (DE3)中誘導表達，誘導表達的SBP-1重 組蛋白經過純化，並通過SDS-PAGE檢測。
所述的多克隆抗體的製備免疫用生理鹽水稀釋SBP-1重組蛋白，然後與弗氏不完全佐劑進行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和後大腿進行肌肉注射。每次免疫前採血2ml (獲得0.5-lml免疫前血清)，並進行ELISA和Western Blotting檢測。如果檢測為陰性或抗體效價較低，則需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100-150mg抗體，最後進行ELISA和WB等質量檢測。
所述的免疫組化收集肺癌患者及其配對的正常組織切片各20例，通過下述步驟:
(I)脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片於二甲苯中30min，脫蠟；然後通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化；(2)抗原修復:將切片置於IOmM pH6.0檸檬酸緩衝液(pH6.0)中，微波爐加熱15min ;(3)微波處理後的切片仍置於檸檬酸緩衝液中15min，然後用流動的水衝洗5min ； (4)將切片放置於3% H2O2室溫孵育15min，以消除內源性過氧化物酶的活性；(5)切片置於1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min ； (6)然後通過免疫組化辣根酶系統的DAB(二氨基聯苯胺)底物染色；(7)切片用蘇木精復染，然後通過不同級別的乙醇浸泡至二甲苯；處理切片，鏡檢。
實驗中以水或緩衝液代替多克隆抗體做陰性對照，以SBP-1過表達的標本為陽性對照；結果顯示，肺癌患者中16例均有不同程度高表達，而正常組織中未見高表達，結果表明，SBP-1高表達與肺癌有緊密的相關性，可供臨床對癌症進行診斷及為個體患者提供更好的輔助治療的有效方法。
權利要求
1.SBP-1蛋白在製備腫瘤標誌物中的用途，其中，所述的腫瘤為肺癌。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的肺癌是小細胞肺癌和非小細胞肺癌，包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。
3.一種肺癌診斷試劑盒，其特徵在於，試劑盒中含有標準劑量的SBP-1蛋白對照品，操作手冊，稀釋液或者緩衝液以及容器或液態晶片和標籤。
4.一種採用權利要求3的肺癌診斷試劑盒檢測肺癌的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟: (1)製備含有標準劑量的SBP-1蛋白對照品，稀釋液或者緩衝液以及容器或液態晶片和標籤的肺癌診斷試劑盒，所述的容器或液態晶片中分別設有: a、SBP-1蛋白的特異性抗體； b、PBS緩衝液pH7.2-7.4，或0.0lmol檸檬酸鈉緩衝液pH6.0，或3% H202溶液，或辣根酶檢測試劑； (2)製備重組蛋白，擴增SBP-1的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達載體轉化或轉導至合適的宿主細胞； (3)在合適的培養基中培養宿主細胞； (4)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質； (5)純化的SBP-1基因產物或者其具有抗原性的片段，誘導產生多克隆抗體； (6)免疫組化:脫蠟和水化:取5μπι的石蠟切片於二甲苯中30min，脫蠟；通過不同的乙醇浸泡至水化；(7)抗原修復:將切片置於IOmMpH6.0檸檬酸緩衝液(pH6.0)中，微波爐加熱15min ； (8)微波處理後的切片置於檸檬酸緩衝液中15min，用流動水衝洗5min； (9)將切片放置於3%H202室溫孵育15min，消除內源性過氧化物酶的活性； (10)切片置於1/500稀釋的SBP-1兔多克隆抗體中溫育60min； (11)免疫組化辣根酶系統DAB底物染色； (12)切片用蘇木精復染，不同級別的乙醇浸泡至二甲苯，處理切片，鏡檢，以水或緩衝液做陰性對照，以SBP-1過表達標本為陽性對照，完成檢測。
5.如權利要求4方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中，通過RT-PCR獲得重組蛋白SBP-1的編碼序列，引物分別是:S100A2-F:5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3』和 S100A2-R:5』 -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3』， 模板為肺癌組織cDNA。
6.SBP-1在製備抑制肺癌細胞侵襲的藥物的應用。
7.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的肺癌細胞是小細胞肺癌和非小細胞肺癌細胞。
全文摘要
本發明涉及分子生物學和腫瘤藥物領域。涉及一種肺癌標誌物SBP-1在肺癌診斷中的用途，及SBP-1作為標誌物用於肺癌的檢測方法。本發明採用比較蛋白質組學方法對肺癌細胞系/組織和正常對照細胞/組織的蛋白質表達譜進行比較分析，質譜鑑定其中部分差異蛋白質點。SBP-1蛋白為其中一個差異點，其在癌細胞中比正常細胞高表達，且可明顯區分，本發明採用RT-PCR和免疫組化的技術，分別檢測肺癌患者及其配對的正常組織中的SBP-1的mRNA和蛋白表達表達水平，結果顯示SBP-1在肺癌組織中表達明顯高於其配對的正常組織，表明SBP-1能作為肺癌的診斷標誌物。進一步本發明提供一種肺癌診斷試劑盒及用於肺癌的檢測方法。
文檔編號A61K38/17GK103217534SQ20121001982
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者宋言崢, 張舒林, 孫戰強 申請人:上海市公共衛生臨床中心