利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法與流程
2023-05-09 07:41:16 1
本發明涉及轉伸展蛋白水稻的分子生物學技術領域，尤其涉及一種利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法。
背景技術：
伸展蛋白(extensin)是一種細胞壁結構蛋白，一般由一條多肽鏈組成，並富含羥脯氨酸殘基[1](tierneyetal.,1987)。伸展蛋白廣泛存在於植物細胞壁中，在整個植物界從單細胞的團藻、低等的苔蘚植物，到高等的裸子植物、被子植物中均有表達[2](merkouropoulosetal.,1999)。其脯氨酸殘基可被羥基化,羥脯氨酸及絲氨酸殘基可被糖基化，有些種類伸展蛋白還進行分子內和分子間的交聯反應。伸展蛋白幾乎涉及植物生長發育的各方面，包括花粉的識別與受精[3](wuetal.,2001)，細胞分裂與分化，細胞伸長的停止[4](itoetal.,1998)，衰老與脫落[5](merkouropoulosetal.,2003)，參與生物與非生物脅迫反應[6](showalter,1993)等。wei[7]等(2006)證實在擬南芥中，伸展蛋白基因atext1的過量表達限制了病原菌丁香假單胞菌的入侵。擬南芥atext3，atext18的突變體植株正常生長受到影響[8,9,10,11](halletal.,2002；cannonetal.,2008；sahaetal.,2013；choudharyetal.,2015)。roberts[12]等(2006)在擬南芥中超表達atext1，轉基因植株莖粗增大，而莖的高度降低。但迄今為止，尚無伸展蛋白對提高植物抗倒伏能力的報導。
參考文獻：
1.tierneyml，varnerje.reviewtheextensins.plantphysiol1987；84:1-2.
2.merkouropoulosg，barnettdc，shirsatah.thearabidopsisextensingeneisdevelopmentallyregulated，isinducedbywounding，methyljasmonate，abscisicandsalicylicacid,andcodesforaproteinwithunusualmotifs.planta1999；208(2):212-219.
3.wuh，degb，marianic，etal.hydroxyproline-richglycoproteinsinplantreproductivetissues:structure，functionsandregulation.cellularandmolecularlifesciences2001；58(10):1418-1429.
4.itom，kodamah，komaminea，etal.expressionofextensingenesisdependentonthestageofthecellcycleandcellproliferationinsuspension-culturedcatharanthusroseuscells.plantmolecularbiology1998；36(3):343-351.
5.merkouropoulosg，shirsatah.theunusualarabidopsisextensiongeneatext1isexpressedthroughoutplantdevelopmentandisinducedbyavarietyofbioticandabioticstresses.planta2003；217(3):356-366.
6.showalteram.structureandfunctionofplantcellwallproteins.plantcell1993；5(1):9-23.
7.wei,g.,andshirsat,a.h.extensinover-expressioninarabidopsislimitspathogeninvasiveness.mol.plant.pathol.2006；7,579-592.
8.hallq,cannonmc.thecellwallhydroxyproline-richglycoproteinrshisessentialfornormalembryodevelopmentinarabidopsis.plantcell2002；14(5):1161-72.
9.cannonmc,terneusk,hallq,tanl,wangy,wegenhartbl,etal.self-assemblyoftheplantcellwallrequiresanextensinscaffold.pnas2008；105(6),2226-31.
10.sahap,rayt,tangy,duttai,evangelousnr,kieliszewskimj,etal.self-rescueofanextensinmutantrevealsalternativegeneexpressionprogramsandcandidateproteinsfornewcellwallassemblyinarabidopsis.plantj,2013；75(1):104-16.
11.choudharyp,sahap,rayt,tangyh,yangd,cannonmc.extensin18isrequiredforfullmalefertilityaswellasnormalvegetativegrowthinarabidopsis.frontplantsci2015；6.
12.robertsk,shirsatah.increasedextensinlevelsinarabidopsisaffectinflorescencestemthickeningandheight.jexpbot2006；57:537-45.
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法，即利用轉基因技術對水稻進行遺傳改良，提高莖稈抗倒伏能力，為提高植物機械支撐力做理論以及技術上的探索。
本發明的目的是這樣實現的：
一、利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法(簡稱方法)
本方法包括下列步驟：
①從水稻中克隆osextl基因cdna
基因編碼區序列如seqidno：1，cdna長度為844bp；
②構建含ubi啟動子的基因載體，並轉化水稻中花11，獲得轉基因植株，其轉基因水稻種子extl(oryzasativaextl)於2017年1月3日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學郵編：430072)，保藏編號為cctccno：p201701；
③將獲得的轉基因水稻種子extl開花後30天進行莖稈抗倒伏能力的測定。
本發明具有下列優點和積極效果：
增加osextl基因在水稻中的表達量，使轉基因水稻莖稈抗倒伏能力(開花後30天測定)提高了48％。
附圖說明
圖1是轉osextl基因水稻莖稈的抗倒伏能力的比較圖片；
圖2是植物表達載體的構建示意圖。
轉基因水稻種子extl(oryzasativaextl)於2017年1月3日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學郵編：430072)，保藏編號為cctccno：p201701。
具體實施方式：
下面結合附圖和實施例詳細說明：
一、實施例1：osextl基因cdna的克隆
從水稻中克隆osextl基因的cdna，如序列1，長度為844bp；pcr產物經過回收，酶切，連接載體。
——合成引物擴增osextl的cdna(844bp，包含cds519bp)
正向引物：cgcggatccacgaccattattcctcctcctc；
反向引物：cggggtaccgcctgatagaaagcgacaacatg。
二、實施例2：表達載體的構建
將osextl的cdna序列連接t載體後，酶切，轉入表達載體pubi-zh2，見圖2。
三、實施例3：植物表達載體轉化農桿菌
1、農桿菌活化
將保存的農桿菌(eha105)在固體lb培養基上畫線(加抗生素：kan，如果不加抗生素就有可能造成這些菌株的ti質粒丟失，導致農桿菌缺乏侵染性)，抗生素濃度為：50μg/ml，28℃培養1-2天，然後轉移到新的加有抗生素的固體lb培養基上再培養2天；
2、農桿菌感受態細胞的製備
將100μl接種於1mllb液體培養基中，150rpm28℃振蕩培養過夜；
吸取1ml菌液接種到100ml液體培養基中培養至od600＝0.5；
將菌液置冰上30min，使培養物冷卻到0℃；
4℃，5000rpm離心30s，棄去上清液；
沉澱用60ml0.1mcacl2懸浮，冰浴30min；
5000rpm離心30s，棄去上清液；
每管用100μl含15％甘油的20mmcacl2懸浮，用於轉化；
製備好的感受態細胞可馬上使用，也可按每管200μl分裝於無菌離心管中，於4℃保存48小時內使用，長期貯存時必須在液氮中速凍後轉-80℃保存，使用時從-80℃取出，置冰上融化後使用。
3、dna直接轉化農桿菌
200μl農桿菌感受態細胞中加入質粒dna0.1～1μg(5-10μl)，之後冰浴30min；
放入液氮中7-8min，然後立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；
取出離心管，冰上放置2min，加入0.8mllb，28℃，150rpm振蕩培養3～4hr；
取出菌液於kan抗生素的lb平板上塗板，在培養箱中28℃條件下倒置培養，2天左右菌落可見。
4、重組農桿菌鑑定
挑取單菌落，接種於含相應抗生素的lb液體培養基中，28℃振蕩培養過夜；
小量提取質粒dna，加gte同時加5μl溶菌酶(50μg/ml，貯藏濃度為50mg/ml或10mg/ml)；
質粒酶切或pcr鑑定。
四、實施例4：水稻成熟胚愈傷組織的誘導、分化、生根及移栽方法
1、愈傷誘導
將成熟的水稻種子去殼，先用無菌水衝洗3遍，然後用70％的乙醇處理1分鐘，不時搖動；
無菌水衝洗3遍，每次30秒，不時搖動；
0.1％升汞溶液消毒12分鐘(或2.5％naclo消毒30min)，不時搖動；
無菌水衝洗5遍以上，每次30秒，不時搖動；
將種子放在滅菌濾紙上吸乾水分，然後放在誘導培養基上；
28℃，暗培養4周；
2、愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷(即散落到培養基上的愈傷，不要選從種子上發出來的愈傷)，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度28℃；
3、預培養
挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養4-14天，溫度28℃；
4、愈傷與農桿菌共培養
1)農桿菌培養
在帶有對應抗性選擇的lb培養基上預培養農桿菌兩天，溫度28℃；
將農桿菌轉移至裝有懸浮培養基的帶塞試管或離心管裡，重懸農桿菌，調節農桿菌的懸浮液至od600為0.8-1.0；
2)農桿菌侵染
將預培養的愈傷轉移至滅菌好的三角瓶內；
將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吹乾(30min-1h)；
然後放置在已鋪有一層濾紙的共培養基上培養3天，溫度19-20℃。
5、選擇培養
將共培養的愈傷轉移至滅菌好的三角瓶內；
滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；
浸泡在含400ppm羧苄青黴素的滅菌水中30分鐘；
轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾(1h以上)；
轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2次，每次2周。(第一次羧苄青黴素篩選濃度為400ppm，第二次為250ppm)；
6、分化培養
將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7天(可省略)；
轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26℃；
7、生根培養
剪掉分化時產生的根(留1-2mm)；
然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2周，溫度26℃；
8、移栽
待苗高10-12cm，根系發生較好，打開瓶蓋，洗掉根上的殘留培養基(注意不要傷根)，移栽花盆中。在最初的幾天，蒙上保鮮膜，保持水分溼潤。
五、實施例5：轉基因陽性苗的鑑定
1、基因插入鑑定
檢測引物：潮黴素通用引物和基因特異性引物；
2、表達鑑定
基因特異引物。
六、實施例6：水稻秸杆抗倒伏的測定
抗倒伏指數測定：用開花後30天水稻材料進行倒四節倒伏指數測定。倒四節倒伏指數計算公式如下：倒伏指數＝(鮮重×株高)/折斷力。鮮重：地上部分倒四節基部以上所有重量(包括莖稈、葉片、葉鞘、穗子)；株高：倒四節基部到穗頂端長度；折斷力：將待測樣品倒四節水平放置在寬帶度為5cm的裝置中，採用折斷力儀(dik7401；daiki,osaka,japan)對倒四節進行折斷力測定，結果見圖1。
華中農業大學
利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法
3
1
844
osextl基因的cdna
acgaccattattcctcctcctctctggagtctagtctcctctcctcactcctcactcgccccactccgccgcttcactcgcgagctcgtcgttggcgccggcggcaatggcgtccccccgcgcgctctccctcctcctcgtcctcctgggcatggccctcgcgtcgttcccctccgccgcctccgcctcccgcgacctccgcccccgccgcgcgggcttcgtcgtccgcggccgcgtctggtgcgacacctgcctcgccggcttcgagacccccgcctccacctacatcgccggagcgaaggtaaaggttgagtgcagatcgaaatccactggcgccaagacatgcagcttcgagggccagactgaccacactggcacctacaacatccctgtcaacgatgagcatgagcacgagctctgcgagtctgtccttgtgagcagcccggacgcaaagtgtggcaagattgttgctggacgggagagggctcctgtcttcctcaccaacaacaatggtgtgacatctaatgttcggttggcgaacgctctgggcttccagaaggatgctcctcttgctgcgtgcgcacaaatcctcaagatgtacgaggaagtggacgaccgcgtttgaaggatgtgagttatgtatcaatattcgtacgttgttgaaatactctaagaagacttctatataccttttactgagagcaaaactatcagcatcagatgttgcgtgcttgataagttgtgatatagcttagcacttgagtatgttatatgtatgttcgtctgcagctgaactgcaaaactcatcagttactaaatcgacatgttgtgctttctatcaggc；
2
31
正向引物
cgcggatccacgaccattattcctcctcctc；
3
32
反向引物
cggggtaccgcctgatagaaagcgacaacatg。