治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物的製作方法

2023-05-09 03:58:36

專利名稱：：治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種治療軟組織損傷的藥物組合物，尤其涉及膝關節前交叉韌帶損傷的治療藥物組合物，該組合物含有生長因子，基質金屬蛋白酶抑制劑，和抗炎症因子。技術背景由於人在運動中頻繁發生前交叉韌帶與內側副韌帶的損傷，對關節功能造成很大影響。近三十多年來，研究人員與醫生在膝關節韌帶修複方面作了大量的研究工作，至上世紀末已廣泛觀察到的、最重要的臨麻見象是，前交叉韌帶與內側副韌帶具有不同的癒合能力；韌帶受力損傷後，同為由大多數成纖維細胞與纖維構成的內側副韌帶具有功能自我癒合性反應,而前交叉韌帶在創傷後卻不能發生功能性的修復。膝關節前交叉韌帶對膝關節起著重要的穩定和P艮製作用。它的修復重建一直是骨科和運動創傷領域內重要的研究課題。一根部分撕裂的ACL反覆受損最終將導致ACL來源的嚴重關節疾病。雖然人們已經充分認識到這種事實，但是對於損傷ACL乃至其它較為複雜的組織的修復再生而言，至今尚無良策。目前國內外對前交叉韌帶的修復主要採用手術重建，前交叉韌帶重建手術最常見是進行生物移植。使用的移植物分為三種自體移植物、同種異體移植物和人工韌帶。自體移植物應用最廣，並取得了良好的臨床效果，但也有其缺點，如常用的骨--髕腱一骨供體部位會出現膝前疼痛、髕腱攣縮、髕腱炎等併發症。同種異體移植物也存在疾病傳播、免疫排斥等問題。而且兩者需要康復時間長，對患者影響較大，尤其對運動員來說，還可因為移植物強度下降、被拉長而影響術後效果。人工韌帶會隨時間延長而失敗，其併發症也較高。經檢索，對與"前交叉韌帶"相關的170項文獻進行分析，其中95%以上的技術與前交叉韌帶重建手術相關，包括重建用器械，選用替代物，而與基質金屬蛋白酶交叉的專利為o，也未見又以抑制基質金屬蛋白酶來實現治癒前交叉韌帶的任何專利申請與授權及相關文獻的報導。
發明內容針對現有技術存在上述的對前交叉韌帶損傷修復技術的不足，本發明的目的是而提供一種用於治療受損前交叉韌帶的組合物。目前，前交叉韌帶的損傷與修復過程需要經歷兩個過程，即傷損組織的去除，新組織的生長；這兩個過程必牽連到一群酶既需要鄰化"組織的酶，又需要'再生"組織的酶。胞外基質按照時序的崩解與澱積必須要得到適當的平衡，即由這些酶的合理參與，才能實現有效的癒合與組織再生。但是，組織受損時，炎因子與生長因子，發炎因子可以激活或調控許多酶的生成和釋放(但未必有助於組織修復)；生長因子則可以促使組織加快修復。不過，生長因子也是"雙刃劍"，既可激活"再生"組織的酶，也可激活鄰化"組織的酶。因此，如果能有調控因子來實現抑制鄰化"酶的過度激活，同時又不讓生長因子失活'再生"酶，那麼將有效地促進各種組織(尤其如ACL類組織)的自愈M程。本發明屬於一種治療受損前交叉韌帶的組合物。其主要作用原理是防止受損的前交叉韌帶與其周圍組織釋放大量MMP-2與其它基質金屬蛋白酶(MMPs)，同時也要防止釋放在膝關節腔中的MMPs破壞已經損傷的ACL。本發明組合物是一種基於前交叉韌帶組織消化與生長之間競爭的平衡策略，用以實現這種平衡策略的一個具體'載體'，它包括基質金屬蛋白酶抑制因子it/和生長因子。本發明的上述組合物和炎症阻斷劑。本發明所述的基質金屬蛋白,制因子主要起抑制基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)及其他其它基質金屬蛋白酶(MMPs)的作用。這類基質金屬蛋白酶抑制因子可以是維甲酸、四環素、AP-1的抑制劑薑黃素、NF-kB抑制剤(BAY11-7082)、特異性c-Jun氨基末端激瞰JNK)抑制劑SP600125、Gi蛋白通道抑制劑百日咳毒素(PT)、P38信號通道抑制劑SB203580、ERK激酶1(MEK)特異性抑制劑PD98059等中的其中一種或者幾種組合。本發明所述的生長因子可以是轉化生長因子(TGF)、表皮生長因子(f:GFs)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(aFGF，bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF-l,IGF-2)、腫瘤壞死因子一e(TNF-e)其中的一種或幾種組合。本發明所述的炎症阻斷劑用來終止膝關節液中MMP活性，可以是英夫利昔單抗(cA2)、依那西普、阿達木單抗等其中一種或者幾種組合。基於發明，基質金屬蛋白酶抑制因子所包括的維甲酸(retinoidacid，RA)是維生素A在體內的活性代謝產物，屬維生素A類物質。RA在胚胎及成年組織中有多種生物學活性，如在細胞增生、凋亡、分化、生殖、維持細胞正常功能等方面發揮重要作用。作為一種抗腫瘤劑RA已成功用於肺、肝、皮膚、膀胱和乳腺腫瘤動物模型，並作為急性早幼粒細胞白血病(APL)的治療藥物應用於臨床。近年來RA在腎臟疾病中的應用受到國外學者的關注，多種腎臟疾病動物實驗證實RA有減少蛋白尿和抗纖維化和細胞增生作用。上述維甲酸在生物個體發育及維持正常生理狀態中有重要作用，有介導細胞分化、增殖、凋亡及調節免疫等功能。其發揮生物學效應是通過如下機制實現的RA在細胞核內有兩組核受體RAR和RXR，均屬類固醇激素受體家族，分別有a、(3、y三種亞型。RARs與RXRs通常形成異二聚體，與目的基因啟動子特異性RAR反應元件(RAREs)結合啟動目的基因轉錄。RXRs還以同源二聚體或與其他核受體形成異二聚體發揮作用，這些核受體包括過氧化物增殖激活受體(PPAR)、甲狀腺激素受體(ThR)、維生素D受體(VDR)以及孤核受體(orphannuclearreceptor)，與相應耙基因位點結合發揮作用。RA特異性調節基因轉錄是通過特異性的核受體反應元件實現的。RARE-姬由間隔2個或5個核苷酸(DR2或DR5)的直接重複序列AGGTCA組成，，RXRs的反應元件主要由間隔1個核苷酸(DR1)的直接重複序列AGGTCA組成。維甲酸RA可通過共價鍵與蛋白結合參與蛋白翻譯後修飾，RA通過硫酯鍵使RA醯化，影響蛋白質功能。RA可影響多種蛋白激酶活性，如PKC各種亞型，MAPK-ERK1/2，JNK和p38。RA活化的RAR/RXR二聚體正性或負性調節其他信號途徑介導的基因激活如轉錄因子激活蛋白(AP-1)，NF-kB。許多機制參與RA介導抗AP-1活性如①抑制c-Fos、c-Jun的表達②抑制JNK的活性◎幹擾c-Fos與c-Jun聚合特異性抑制含JunB的二聚體⑤抑制JunD磷酸化和RNA聚合酶2的結合，解離CREB結合蛋白CBP和ERKs與AP—1的結合位點⑥與AP—1競爭結合位點。RA抗AP-1活性可以抑制氧化應激介導的繫膜細胞凋亡。基質金屬蛋白酶抑制因子包括的薑黃素是薑黃的黃色物質，是薑黃發揮藥理作用的主要成分。薑黃素溶於乙醇、鹼、醋酸、丙酮和氯仿等有機溶劑,不溶於水,其分子式為C2IH2。06,其主鏈為不飽糊節矣及芳香族基團。薑黃素可抑制炎性細胞前炎症細胞因子:腫瘤壞死因子TNF—a、白介素一lP和白介素一8的產生。984年薑黃素作為有效的非甾體消炎藥進入n期臨床試驗階段，對18個風溼性關節炎和骨關節炎病人做短期、雙盲、交叉i微,顯示了令人滿意的結果。本發明涉及的生長因子中所述的轉化生長因子是一大類異質性多肽，主要為TGF-a和TGF-P。TGF-a是一種由50個胺基酸組成的多肽，分子量為5.6kl)的-條單鏈，具有促進細胞生長和轉化能九在許多細胞轉化途徑及腫瘤細胞生長過程中TGF-a作為自分泌生長因子起著重要的作用。TGF-P是巨噬細胞分泌的-,中活性多肽，其分子量為25kD，TGF—p是一種具有多種功能的蛋白多肽,是--種能促進細胞生長、分化及形態發生的超家族因子中的代表性成員，TGF—p超家族的成員廣泛地分布於脊椎動物和非脊椎動物中，以自分泌和旁分泌的形式調節細胞的增殖、凋亡和細胞外基質的分泌，在細胞分化、胚胎發育、炎症反應和損傷修復過程中發揮重要的作用。本發明由於提供上述組合物而產生的積極效果使顯而易見的。g卩上述組合物具有明顯抑制基質金屬蛋白酶過度釋放的作用。開闢了膝關節前交叉韌帶損傷治療的新的有效途徑，療效顯著，經修復後的韌帶的張力強度恢復到正常狀態。突破了現有技術對膝關節前交叉韌帶損傷治採用的外科重建手術只限於"治"，而不能實現"愈"，特別是關節力學功能無法恢復的嚴重缺陷。附圖1是對比實驗中大鼠前交叉韌帶斷裂後只進行縫合的效果觀察圖；附圖2為對比實驗中大鼠前交叉韌帶斷裂縫合後再添加本發明組合物實施例1治療後的的效果觀察圖；附圖3為對比實驗中大鼠前交叉韌帶斷裂縫合後再添加本發明組合物實施例2治療後的的效果觀察圖；附圖4為對比實驗中大鼠前交叉韌帶斷裂縫合後再添加本發明組合物實施例3治療後的的效果觀察圖；附圖5為對比實驗中大鼠前交叉韌帶斷裂縫合後再添加本發明組合物實施例4治療後的的效果觀察圖。具體實施方式本發明通過基於下列非限定性的實施例更詳細地解釋。實施例l:組合物配方l組合物成分維甲酸50ng/ml、四環素10—4M、薑黃素50wM、轉化生長因子10n^ml。配製方法用2.5mL冷凍的PBS稀釋，用0.2M的NaOH將pH值調到7.4，並保持在250一300毫滲摩爾(mOsm)。把組合物加入調好pH的溶液中，使最終總濃度達到2mg/mL。試驗動物Wistar大鼠體重220土20g，雄性，共三組，每組10隻。對兩組大鼠進行ACL斷裂手術，再對其進行逢合。一組再其逢合後，為減輕大鼠手術後的疼痛，在開始5天，每12小時注射0.01-0.05mg/ml的止痛抓讓其自動恢復。另一組進行手術逢合後，取3uL已配好消毒的膠原凝膠塗被在ACL—ACL的縫合處。50分鐘後，取5UL已配好的組合物溶液，注射到大鼠的關節腔內。開始三天，每天都注射同樣的量，之後的3個周內，每5天注射一次。為減輕大鼠手術後的M，也在開始5天，每12小時注射0.01-0.05mg/ml的止痛劑。6周後。將所有的大鼠處死，取出其骨一韌帶一骨複合物，見圖2，測量其韌帶的拉伸強度。結果表一表一tableseeoriginaldocumentpage10實施例2:組合物配方2成分維甲酸50ng/ml、四環素104M、薑黃素50yM、轉化生長因子30ng/ml。配製方法同實施例l試驗動物Wistar大鼠體重220士20g，雄性，共三組。試驗過程同實施例l6周後。將所有的大鼠處死，取出其骨一韌帶一骨複合物，見圖3，測量其韌帶的拉伸強度。結果表二:表二組別濃度動物數(只)平均值土SD拉伸鵬(N)修復(％)iH常組織536±3.5ACX縫合75.2±7.213.7維甲酸+四環素薑黃素+轉化生長因子GX)50ng/ml+104M+50uM+30ng/ml826.4±1.783實施例3:組合物配方3組合物成分維甲酸50ng/ml、四環素104M、NF-kB抑制剤50uM、轉化生長因子30ng/ml。配製方法同實施例l試驗動物Wistar大鼠體重220土20g，雄性，共三組。試驗過程同實施例l6周後。將所有的大鼠處死，取出其骨一韌帶一骨複合物，見圖4，帶的拉伸強度。結果表三表二tableseeoriginaldocumentpage12實施例4:組合物配方4成分轉化生長因子30ng/ml配製方法同實施例l試驗動物Wistar大鼠體重220士20g，雄性，共三組。試驗過程同實施例l6周後。將所有的大鼠處死，取出其骨一靭帶一骨複合物，見圖4，測量其韌帶的拉伸強度。結果表四表四tableseeoriginaldocumentpage13實施例5:組合物配方5成分維甲酸50ng/ml、四環素10^M、NF-kB抑制劑50uM、轉化生長因子30ng/ml。配製方法同實施例l試驗動物Wistar大鼠體重220士20g，雄性，共三組。試驗過程同實施例l6周後。將所有的大鼠處死，取出其骨一韌帶一骨複合物，見圖5，測量其韌帶的拉伸強度。結果表五:表五tableseeoriginaldocumentpage13+NF-Kfi抑制劑++50tiM+30ng/ml轉化生長因子實施例6:組合物配方6組合物成分轉化生長因子10ng/ml、依那西普30ng/ml。配製方法同實施例l試驗動物Wistar大鼠體重220士20g,雄性，共三組。試驗過程同實施例l6周後。將所有的大鼠處死，取出其骨一韌帶一骨複合物，測量其韌帶的拉伸強度。結果表六:表六組別濃度動物數(只)平均值土SD拉伸鵬(N)修復(％)正常組織35±2.0-----ACL縫合-75.2±1.313.0轉化生長因子+依那西普10ng/ml+30ng/ml65.8±4.315.2從上述實施例，及我們對4000多個大鼠試驗樣本的統計結果可得出。組合物的優化組分為維甲fr四環素+NF-KB抑制劑+轉化生長因子，從大鼠前交叉韌帶斷裂縫合後再添加本發明組合物實施例中的解剖圖能夠直觀觀察到這點。權利要求1、一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是它包括基質金屬蛋白酶抑制因子或/和生長因子，按單位為質量/體積(m/v)，它們之間的配比關係為0～300∶0～1。2、根據權利要求1所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是述組合物還包括炎症阻斷劑，它與基質金屬蛋白酶抑制因子或/和生長因子之間的配比關係是按單位為質量/體積(m/v)，它們之間的配比關係為0300:01:01。3、根據權利要求1所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是所述的基質金屬蛋白酶抑制因子選自維甲酸、四環素、AP-1的抑制劑薑黃素、NF-KB抑制劑、特異性c-Jim氨基末端激酶(JNK)抑制劑SP600125、Gi蛋白通道抑制劑百日咳毒素、P38信號通道抑制劑SB203580、ERK激酶1特異性抑制劑PD98059中的其中一種或者幾種組入口('4、根據權利要求1所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是所述的生長因子可以是轉化生長因子、表皮生長因子、血小板衍生的生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子(IGF-l，IGF-2)、腫瘤壞死因子一0中的一種或幾種組合。5、根據權利要求2所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是所述的炎症阻斷劑選自英夫利昔單抗、依那西普、阿達木單抗中一種或者幾種組合。6、根據權利要求1、3、4所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是組合物由維甲酸50ng/ml四環素1(T4M，薑黃素50uM，轉化生長因子10ng/ml組成。7、根據權利要求1、3、4所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是組合物由維甲酸50ng/ml、四環素10"M、薑黃素50uM、轉化生長因子30ng/ml組成。8、根據權利要求1、3、4所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是組合物由轉化生長因子30ng/ml構成。9、根據權利要求1、3、4所述的一種治療膝關節前交叉韌帶損傷的組合物，其特徵是組合物由維甲酸50ng/ml、四環素14M、NF-kB抑制劑50uM、轉化生長因子30ng/ml構成10、根據權利要求l、3、4所述的一種治療膝關節前交叉靭帶損傷的組合物，其特徵是組合物由轉化生長因子10ng/ml、依那西普30ng/ml構成。全文摘要本發明涉及膝關節前交叉韌帶損傷治療的藥物組合物，具有抑制基質金屬蛋白酶過度釋放的作用。該組合物含有生長因子、基質金屬蛋白酶抑制劑和炎症阻斷劑。組合物的優化成分是轉化生長因子+維甲酸+四環素+NF-κB抑制劑。本發明由於有效的抑制了基質金屬蛋白酶過度釋放，開闢了膝關節前交叉韌帶損傷治療的新的有效途徑，療效顯著，經修復韌帶的張力強度恢復到正常狀態。突破了現有技術對膝關節前交叉韌帶損傷治採用的外科重建手術只限於「治」，而不能實現「愈」(特別是關節力學功能無法恢復)的嚴重缺陷。文檔編號A61K38/55GK101147802SQ20061005457公開日2008年3月26日申請日期2006年11月7日優先權日2006年11月7日發明者宋國立,苑李,力楊,榮楊,蔣稼歡申請人:重慶大學