一種利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測microRNA的分析方法

2023-05-09 01:35:21 2

專利名稱：一種利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測microRNA的分析方法
技術領域：
本發明涉及了一種螢光納米銀簇探針檢測microRNA的分析方法，屬於檢測分析領域。
背景技術：
microRNA是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約18 25個核苷酸。它參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防禦、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。近期研究發現，miCToRNA在腫瘤發生過程中起至關重要的作用，已成為一類理想的腫瘤標記物。所以定量檢測miCToRNA對了解其生物功能，癌症的早期診斷以及新藥的開發，都具有十分重要的意義。與傳統的核酸檢測相比，miCToRNA其獨有的特點，如序列短，家族序列同源性高及低豐度表達，增加了其檢測的難度。目前檢測microRNA的方法主要有Northern印跡分析,微陣列晶片技術,聚合酶鏈式反應(PCR)等。雖然Northern印跡是當前microRNA分析的標準方法,但操作繁瑣,耗時長，靈敏度低，分析檢測時需要大量的樣品及分離富集步驟，而且對汙染非常敏感，實驗中每一步操作不當都會影響分析結果。微陣列晶片技術雖然可實現高通量，多組分同時檢測，但是其製作和檢測費用高；晶片上可利用的樣品體積很小，導致靈敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同時優化所有待測的microRNA雜交環境，所以選擇性不高。聚合酶鏈式反應(PCR)是現在定量檢測microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，莖環引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。雖然基於聚合酶鏈式反應的microRNA檢測方法具有快速、特異性強、靈敏度高等特點，但是需要逆轉錄操作，增加了實驗的成本和設計的複雜性。隨著新的microRNA序列不斷發現和對microRNA功能研究的逐步深入,對microRNA的分析檢測提出了新要求。因此，開發簡單直接，靈敏度高，特異性強，準確檢測microRNA的分析技術仍然是一個挑戰。

發明內容
本發明涉及一種利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測microRNA的分析方法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強，背景信號低、線性檢測範圍寬、適用範圍廣等優點，是一種簡便實用的分析技術。本發明利用靶標microRNA誘導恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測microRNA的分析方法如下。設計一條含有三種功能序列的DNA擴增模板與祀標microRNA結合序列，nicking核酸內切酶酶切序列和合成螢光納米簇的DNA互補序列。從3』端到5』端排列順序為祀標microRNA結合序列,nicking核酸內切酶酶切序列,祀標microRNA結合序列，nicking核酸內切酶酶切序列，和合成螢光納米簇的DNA互補序列。當靶標microRNA與DNA擴增模板結合後，誘導恆溫擴增反應和nicking核酸內切酶特異性的酶切反應得到大量單鏈DNA產物，其中一種單鏈DNA產物能夠與DNA擴增模板結合，繼續充當靶標microRNA的引物作用，從而極大地提高擴增的效率。另一種單鏈DNA產物即為螢光納米銀簇的合成DNA序列，能與加入的硝酸銀離子溶液在硼氫化鈉還原作用下，合成螢光納米銀簇探針，在一定波長的入射光照射下，發射出相應的螢光，通過測定反應體系中的螢光信號並計算螢光改變值，與標準工作曲線比對，推算出靶標microRNA的濃度。此外，DNA擴增模板中功能序列也可以有不同的組合和排列模式，如從3』端到5』端排列順序為靶標microRNA結合序列，nicking核酸內切酶酶切序列，合成螢光納米簇的DNA互補序列，nicking核酸內切酶酶切序列，和合成螢光納米簇的DNA互補序列。本發明的方法可以進一步描述如下利用祀標microRNA與DNA擴增模板結合後，誘導恆溫擴增反應和nicking核酸內切酶特異性的酶切反應得到單鏈DNA產物，該單鏈DNA產物與加入的硝酸銀溶液在硼氫化鈉還原作用下製備螢光納米銀簇探針，測定反應體系中的螢光信號並計算螢光信號改變值，與標準工作曲線比對，推算出祀標microRNA的濃度。
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所述螢光納米銀簇探針粒徑為I 10nm，激發波長為500 680nm，發射波長為510 900nm。本發明的靶標microRNA檢測方法包括以下操作步驟步驟I將靶標microRNA加入到DNA擴增模板溶液中，進行孵育反應；步驟2向步驟I中所得的反應液中加入恆溫擴增混合液，孵育反應後，熱失活酶，終止反應；步驟3向步驟2中所得的反應液中加入硝酸銀溶液與檸檬酸緩衝溶液，混勻後，離心取上清，然後加入硝酸銀溶液和新鮮配製的硼氫化鈉溶液，黑暗中反應後合成螢光納米銀簇；步驟4測定步驟3中所得的螢光納米銀簇溶液的螢光信號。所述步驟I中靶標microRNA來自於組織、血液或細胞的生物樣本。所述步驟I中的孵育反應在37°C 55 °C和反應緩衝溶液中，步驟I中的DNA擴增模板反應液和靶標microRNA的體積比為0. I 10，反應時間為5 50分鐘，所述的DNA擴增模板濃度為10 800nM ;所述的靶標microRNA濃度為IaM IOOnM ;所述的DNA擴增模板含有三種功能序列與靶標microRNA結合序列，nicking核酸內切酶酶切序列和合成螢光納米簇的DNA互補序列，所述的反應緩衝溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，0. 5mM 二硫蘇糖醇和pH為6. O 8. 9。所述步驟2的孵育反應是在35°C 55°C和反應緩衝液中，步驟I所得的反應液和恆溫擴增混合液體積比為0. I 10，反應20 200分鐘，恆溫擴增混合液中含有恆溫聚合酶、nicking核酸內切酶、RNase抑制劑和dNTP ;所述的恆溫聚合酶濃度為0. OlUy Γ1 I. OU μ L_\nicking核酸內切酶濃度為0. IU μ Γ1 I. OUy Λ RNase抑制劑濃度為0. IUμ Γ1 I. OU μ ΙΛ dNTP溶液濃度為80 500 μ M ;所述的反應緩衝液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸鎂和 0. 1% Triton X-100 和 pH 為 6. O 8. 9。所述恆溫聚合酶為商品化的VentR (610-)0嫩聚合酶411丨290嫩聚合酶或1(16110￥Fragment聚合酶。所述nicking 核酸內切酶為商品化的 Nt. CviPII、Nb. BbvCI> Nb. BtsI、Nt. BsmAI>Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. AlwI 或 Nt. BstNBI。
所述的標準工作曲線是由已知濃度的靶標microRNA的標準溶液，按照所述操作步驟反應後，測定反應體系中的螢光信號並計算螢光改變值，然後根據標準溶液中microRNA的濃度和體系中螢光改變值製作標準工作曲線。所述步驟3中硝酸銀濃度為10 800 μ Μ，硼氫化鈉溶液為新鮮配製，其濃度為10 10mM，反應溫度為25°C 55°C，反應時間為20 120分鐘。本發明的方法中DNA擴增模板中採用雙nicking核酸內切酶酶切序列的設計，利用擴增得到的單鏈DNA序列與DNA擴增 模板再結合，充當引物作用，極大地提高了擴增效率。DNA擴增模板中合成螢光納米簇的DNA互補序列的設計，實現了一種新型的螢光納米探針的應用。與傳統的螢光探針相比，螢光納米探針具有優良的光學特性，如高螢光強度、抗光漂白性、發光顏色可調、激發波長和發射波長可調等。本發明的優點在於(I)靈敏度高DNA擴增模板中通過雙microRNA結合序列(或雙合成螢光納米簇的DNA互補序列)和nicking核酸內切酶酶切序列的設計,使得擴增產物和祀標microRNA一樣，能夠與DNA擴增模板進行結合，啟動恆溫擴增反應，達到指數信號放大的作用，從而極大地提高了檢測靈敏度。(2)選擇性好基於靶標miRNA與DNA擴增模板的特異性鹼基互補配對原則，使得其它分子的幹擾影響很小。(3)背景信號低螢光納米銀簇的合成與DNA序列的鹼基組成直接相關，只有鹼基組成特異性的DNA序列才能合成穩定螢光信號的螢光納米銀簇。(4)多重檢測利用不同鹼基組成的DNA序列合成的納米銀簇探針光學特性的差異，針對不同的祀標microRNA,設計不同的DNA擴增模板,可以實現多重microRNA檢測。(5)高通量檢測採用96或384酶標板，可以實現同時製作標準工作曲線和待測樣本的檢測，減少檢測誤差。(6)操作過程簡便快速整個檢測過程簡單。(7)無汙染整個檢測過程不需要用到有機溶劑或是有毒試劑。


圖I利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測miR-141的分析方法的原
理示意圖。圖2工作曲線製備。(A)不同濃度miR-141反應溶液的螢光光譜；(B)不同濃度miR-141反應溶液的螢光改變值(F/Ffl)與miR-141濃度對數值的工作曲線。圖3特異性實驗。㈧不同靶標microRNA反應溶液的螢光光譜；⑶實驗數據比較柱狀圖(f/fq-i)。圖4利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測miR-21的分析方法的原
理示意圖。圖5利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測let_7a的分析方法的原理示意圖。圖6利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測miR-646的分析方法的原
理示意圖。
圖7利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針多重檢測miR-141和miR-21的分析方法的原理示意圖。符號說明附圖I 中，miR-141 為 5』-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3』，A 為靶標 miR-141 結合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3』 )，X 為 Nt. B stNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3』 ) ,B為合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』-TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，T為擴增產生與miR-14一致的DNA序列(5』 -TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3』 )，R為合成螢光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3』)，C 為 Nt. BstNBI 核酸內切酶,D 為VentR (exo-)DNA 聚合酶。附圖2中，F為miR-141標準溶液在644nm處的螢光值，F0為空白樣本(不含有miR-141)在644nm處的螢光值，(F/F0-l)表示miR-141標準溶液的螢光改變值。附圖3中，F為靶標microRNA溶液在644nm處的螢光值，F0為空白樣本(不含有microRNA)在644nm處的螢光值，(F/F0-l)表示microRNA溶液的螢光改變值。 附圖4 中，miR-21 為 5』 -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3』，A 為靶標 miR_21 結合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3』)，X 為 Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3』)，B 為合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，T為擴增產生與miR-21一致的DNA序列(5，-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3』 )，R為合成螢光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3』)，C 為 Nt. BstNBI 核酸內切酶,D 為VentR (exo-)DNA 聚合酶。附圖5 中，let-7a 為 5』 -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3』，A 為靶標 let_7a 結合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3』)，X 為 Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3』)，B 為合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，T為擴增產生與let_7a一致的DNA序列(5』 -TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3』 )，R為合成螢光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3』)，C 為 Nb. BbvCI 核酸內切酶，D 為VentR (exo-)DNA 聚合酶。附圖6 中，miR-646 為 5，-AAGCAGCUGCCUCUGAGGC-3』，A 為靶標 miR-646 結合序列(5，-GCCTCAGAGGCAGCTGCTT-3』)，X 為 Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3』)，B 為合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』 )，T為擴增產生與miR-646一致的DNA序列(5』 -AAGCAGCTGCCTCTGAGGC-3』)，R/R』 合成螢光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3』)，C 為 Nb. BbvCI 核酸內切酶，D 為 phi29DNA 聚合酶。附圖7 中，miR-141 為 5 』 -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3 』，miR_21序列為 5』 -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3』，A 為靶標 miR-21 結合序列(5，-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3』)，X 為 Nt. B stNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3』 )，E 為靶標 miR-141 結合序列(5』 -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3』)，B 為合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，F為合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -ATCGGGGGCGA-3』)，T為擴增產生與miR-21 —致的 DNA 序列(5，-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3』)，U 為擴增產生與 miR-141 — 致的DNA序列(5，-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3，)，R為合成螢光納米銀簇的DNA序列(5，-ATCGCCCCCGAT-3』)，S 為合成螢光納米銀簇的 DNA 序列(5』 -CCCACCCACCCGCCCAA-3』)，C為Nt. BstNBI核酸內切酶，D為VentR (exo-)DNA聚合酶。
具體實施實例
通過下述實施例將有助於理解本發明，但是不能限制本發明的內容實施實例I :利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測miR-141 (5』 -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3，)的分析方法，檢測原理如附圖I所示。採用VentR (exo-) DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸內切酶。DNA擴增模板上的序列排布為靶標miR-141結合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3，)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3，)，miR-141結合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3』 ) ,Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3』)，以及合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，3』端磷酸化。下面對miR-141檢測的具體實施來進一步說明本發明。其中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。本發明中的室溫是指進行實施操作的實驗室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4yL DNA擴增模板溶液(200nM)中加入I μ L靶標miR-141溶液，反應緩衝溶液為25mMTriS-HNO3，50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM二硫蘇糖醇，pH為7. 9。於88°C孵育10分鐘後，然後加入恆溫擴增混合液5 μ L，包括VentR (exo-) DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸內切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和 dNTP (250 μ Μ)，反應緩衝液為 IOmM 硝酸鈉、20mM 硝酸銨、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸鎂和O. 1% Triton X-100，pH為8. 8。於53°C孵育反應50分鐘，然後於90°C孵育5分鐘終止反應。向上述反應液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩衝溶液(20mM，pH 7. O)，震蕩混勻後，12，000轉離心10分鐘後取上清溶液，於黑暗中放置15分鐘後，加入新鮮配製的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液,混勻，於黑暗中放置I小時，測定溶液的突光信號。工作曲線的製作分別準備已知濃度的miR-141標準溶液，濃度分別為laM，IOaM, IOOaM, IfM, IOfM, IOOfM, IpM, IOpM, IOOpM,和 InM,以及空白樣本(不含有 miR-141,即miR-141濃度為0)，按照上述步驟進行操作，測定各個反應液的螢光光譜，如圖2(A)所示。計算其螢光改變值(F/Ffl)，即miR-141標準溶液在644nm處的螢光值(F)與空白樣本(不含有miR-141)在644nm處的螢光值(Ftl)的比值減1，然後根據miR-141標準溶液的濃度和其螢光改變值(F/Ffl)製作標準工作曲線，如圖2(B)所示，miR-141標準溶液的濃度對數值與其螢光改變值(FAVl)在IaM InM範圍內呈線性關係，線性方程為Y =
10.57+1. 251gX。圖3所示為該本發明方法的特異性實驗，選取miR-429，miR_200b，let_7d，miR-21作為miR-141對照樣本(檢測濃度為IpM)，以及空白樣本(不含有miR-141，即miR-141 濃度為 0)，miR-429 序列為 5』 -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3』，miR-200b 序列為5』 -UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3』，let_7d 序列為 5』 -AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3』，miR_21序列為5』 -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3』，如圖3(A)為各個靶標反應液的螢光光譜，如圖3(B)為各個靶標反應液的螢光改變值(F/Ffl)的柱狀圖，實驗結果表明該方法特異性強。實施實例2 利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測miR-21 (5 』 -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3，)的分析方法，檢測原理如附圖4所示。採用VentR (exo-) DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸內切酶。DNA擴增模板上的序列排布為靶標miR-21結合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3，)，miR-21結合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3』)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3』)，以及合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，3』端磷酸化。下面對miR-21檢測的具體實施來進一步說明本發明。其中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。本發明中的室溫是指進行實施操作的實驗室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4 μ LDNA擴增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶標miR-21溶液，反應緩衝溶液為25mMTris_HN03，50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM 二硫蘇糖醇，pH為7.9。於88°C孵育10分鐘後，然後加入恆溫擴增混合液5 μ L，包括VentR (exo-) DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸內切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反應緩衝液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mMTris-HN03、2mM硝酸鎂和0.1% Triton X-100，pH為8. 8。於53°C孵育反應50分鐘，然後於90°C孵育5分鐘終止反應。向上述反應液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩衝溶液(20mM, pH 7. O)，震蕩混勻後，12，000轉離心10分鐘後取上清溶液，於黑暗中放置15分鐘後，加入新鮮配製的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液，混勻，於黑暗中放置I小時，測定溶液的 突光信號。工作曲線的製作分別準備已知濃度的miR-21標準溶液和空白樣本(不含有miR-21,即miR-21濃度為O)，按照上述步驟進行操作，測定各個反應液的螢光光譜，計算其螢光改變值(F/Ffl)，即miR-21標準溶液在644nm處的螢光值與空白樣本在644nm處的螢光值的比值減I，然後根據miR-21標準溶液的濃度和其螢光改變值(F/Ffl)製作標準工作曲線。實施實例3 利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測I et_7a (5 』 -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3』 )的分析方法，檢測原理如附圖5所示。採用phi29DNA聚合酶和Nb. BbvCI核酸內切酶。DNA擴增模板上的序列排布為靶標let-7a結合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3』 ) ,Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3』 )，let_7a 結合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3』)，Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3』)，以及合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，3』端磷酸化。下面對let_7a檢測的具體實施來進一步說明本發明。其中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。本發明中的室溫是指進行實施操作的實驗室溫度23 28V。具體操作步驟如下在4μ L DNA擴增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶標let-7a溶液，反應緩衝溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM 二硫蘇糖醇，pH為7. 9。於88°C孵育10分鐘後，然後加入恆溫擴增混合液5 μ L，包括phi29DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nb. BbvCI 核酸內切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和 dNTP (250 μ Μ)，反應緩衝液為 IOmM 硝酸鈉、20mM 硝酸銨、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸鎂和O. 1% Triton X-100，pH為8. 8。於37°C孵育反應50分鐘，然後於90°C孵育5分鐘終止反應。向上述反應液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩衝溶液(20mM，pH 7. O)，震蕩混勻後，12，000轉離心10分鐘後取上清溶液，於黑暗中放置15分鐘後，加入新鮮配製的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液,混勻，於黑暗中放置I小時，測定溶液的突光信號。工作曲線的製作分別準備已知濃度的let_7a標準溶液和空白樣本(不含有let-7a,即let_7a濃度為0)，按照上述步驟進行操作，測定各個反應液的螢光光譜，計算其螢光改變值(F/Ffl)，即let-7a標準溶液在644nm處的螢光值與空白樣本在644nm處的螢光值的比值減1，然後根據let-7a標準溶液的濃度和其螢光改變值(F/F^l)製作標準工作曲線。實施實例4 利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測miR-646 (5』-AAGCAGCUGC⑶⑶GAGGC-3』)的分析方法，檢測原理如附圖6所示。採用phi29DNA聚合酶和Nb. BbvCI核酸內切酶。DNA擴增模板上的序列排布為靶標miR-646結合序列(5』-GCCTCAGAGGCAGCTGCTT-3』)，Nb. BbvCI酶切序列(5』 -GCTGAGG-3』)，合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5，-GGGTGGGTGGGCGGGTT-3』 )，Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3』 )，以及合成螢光納米 銀簇的DNA互補序列(5』 -GGGTGGGTGGGCGGGTT-3』)，3』端磷酸化。下面對miR-646檢測的具體實施來進一步說明本發明。其中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。本發明中的室溫是指進行實施操作的實驗室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4 μ LDNA擴增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶標miR-646溶液，反應緩衝溶液為25mMTris_HN03，50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，
O.5mM 二硫蘇糖醇，pH為7. 9。於88°C孵育10分鐘後，然後加入恆溫擴增混合液5 μ L，包括 phi29DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nb. BbvCI 核酸內切酶(O. 4U μ L-1) ,RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反應緩衝液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mMTris-HN03、2mM硝酸鎂和0.1% Triton X-100，pH為8. 8。於37°C孵育反應50分鐘，然後於90°C孵育5分鐘終止反應。向上述反應液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩衝溶液(20mM, pH 7. O)，震蕩混勻後，12，000轉離心10分鐘後取上清溶液，於黑暗中放置15分鐘後，加入新鮮配製的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液，混勻，於黑暗中放置I小時，測定溶液的突光信號。工作曲線的製作分別準備已知濃度的miR-646標準溶液和空白樣本(不含有miR-646,即miR-646濃度為O)，按照上述步驟進行操作，測定各個反應液的螢光光譜，計算其螢光改變值(F/Ffl)，即miR-646標準溶液在644nm處的螢光值與空白樣本在644nm處的螢光值的比值減I，然後根據miR-646標準溶液的濃度和其螢光改變值(F/F^l)製作標準工作曲線。實施實例5 利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針多重檢測miR-141 (5』 -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3』 )和 miR-21 (5』 -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3』 )的分析方法，檢測原理如附圖7所示。採用VentR (exo-)DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸內切酶。DNA擴增模板I上的序列排布為靶標 miR-141 結合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3』 )，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3，)，miR-141 結合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3』 )，Nt. BstNBI酶切序列(5，-TCTTGACTC-3』)，以及合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5』 -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，3』端磷酸化。DNA擴增模板2上的序列排布為革巴標 miR-21 結合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3』)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3』)，miR-21 結合序列(5』 -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3』)，Nt. B stNBI酶切序列(5』 -ACGTGACTC-3』)，以及合成螢光納米銀簇的DNA互補序列(5，-TTGGGCGGGTGGGTGGG-3』)，3』 端磷酸化。下面對miR-141、miR-21檢測的具體實施來進一步說明本發明。其中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。本發明中的室溫是指進行實施操作的實驗室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4 μ LDNA擴增模板I和DNA擴增模板2的混合溶液(各200ηΜ)中加入I μ L靶標miR-141或者miR-21或者二者的混合溶液，反應緩衝溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM 二硫蘇糖醇，pH為7. 9。於88°C孵育10分鐘後，然後加入恆溫擴增混合液5 μ L,包括VentR (exo-)DNA聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸內切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8U μ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反應緩衝液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mMTriS-HNO3、2mM硝酸鎂和 O.1% Triton X-100，pH為8. 8。於53°C孵育反應50分鐘，然後於90°C孵育5分鐘終止反應。上述反應液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩衝溶液(20mM，pH 7. O)，震蕩混勻後，12，000轉離心10分鐘後取上清溶液，於黑暗中放置15分鐘後，加入新鮮配製的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液,混勻，於黑暗中放置I小時，測定溶液的螢光信號。工作曲線的製作分別準備已知濃度的miR-141和miR-21標準溶液和空白樣本(不含有miR-141和miR-21)，按照上述步驟進行操作，測定各個反應液的螢光光譜，計算其螢光改變值(F/Ffl)，即miR-141標準溶液在其特徵性發射峰644nm處的螢光值與空白樣本在644nm處的螢光值的比值減1，miR-21標準溶液在其特徵性發射峰625nm處的螢光值與空白樣本在625nm處的螢光值的比值減I，然後根據miR-141和miR-21標準溶液的濃度和其螢光改變值(F/Ffl)分別製作標準工作曲線。
權利要求
1.一種利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針檢測HiiCT0RNA的分析方法，其特徵在於，利用IESmicroRNA與DNA擴增模板結合後,誘導恆溫擴增反應和nicking核酸內切酶特異性的酶切反應得到大量單鏈DNA產物，該單鏈DNA產物與加入的硝酸銀溶液在硼氫化鈉還原作用下製備螢光納米銀簇探針，測定反應體系中的螢光信號並計算螢光信號改變值，與標準工作曲線比對，推算出祀標microRNA的濃度。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述螢光納米銀簇探針粒徑為I 10nm，激發波長為500 680nm，發射波長為510 900nm。
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的靶標microRNA檢測包括以下操作步驟 步驟I將靶標microRNA加入到DNA擴增模板溶液中，進行孵育反應； 步驟2向步驟I中所得的反應液中加入恆溫擴增混合液，孵育反應後，熱失活酶，終止反應; 步驟3向步驟2中所得的反應液中加入硝酸銀溶液，混勻後，離心取上清，然後加入硝酸銀溶液和新鮮配製的硼氫化鈉溶液，在黑暗中反應合成螢光納米銀簇； 步驟4測定步驟3中所得的螢光納米銀簇溶液的螢光信號。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟I中靶標microRNA來自於組織、血液或細胞的生物樣本。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟I中的孵育反應在37°C 55°C和反應緩衝溶液中，步驟I中的DNA擴增模板反應液和靶標microRNA的體積比為O. I 10，反應時間為5 50分鐘，所述的DNA擴增模板濃度為10 800nM ;所述的靶標microRNA濃度為IaM IOOnM ;所述的DNA擴增模板和靶標microRNA所述的DNA擴增模板含有三種功能序列與靶標microRNA結合序列，nicking核酸內切酶酶切序列和合成螢光納米簇的DNA互補序列，所述的反應緩衝溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，0. 5mM 二硫蘇糖醇和pH為6. O 8. 9。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟2的孵育反應是在35°C 55°C和反應緩衝液中，步驟I所得的反應液和恆溫擴增混合液體積比為0. I 10，反應20 200分鐘，恆溫擴增混合液中含有恆溫聚合酶、nicking核酸內切酶、RNase抑制劑和dNTP ;所述的恆溫聚合酶濃度為Ο.Ο υμΙ^-Ι.Ου μ L'nicking核酸內切酶濃度為0. IU μ L—1 I. OUμ ΙΛ RNase抑制劑濃度為0. IU μ Γ1 I. OU μ Λ dNTP溶液濃度為80 500 μ M ;所述的反應緩衝液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mM 1^8-順03、21111硝酸鎂和0. I % TritonX-IOO和pH為6. O 8. 9。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述恆溫聚合酶為商品化的VentR (exo-)DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶或Klenow Fragment聚合酶。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述nicking核酸內切酶為商品化的Nt. CviPII、Nb. BbvCI、Nb. BtsI、Nt. BsmAI、Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. AlwI 或 Nt. BstNBI。
9.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟3中硝酸銀濃度為10 800μ Μ，硼氫化鈉溶液為新鮮配製，其濃度為10μΜ IOmM,反應溫度為25°C 55°C,反應時間為20 120分鐘。
10.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的標準工作曲線，是由已知濃度的靶標microRNA的標準溶液，按照所述操作步驟反應後，測定反應體系中的螢光信號並計算螢光改變值，然後根據標準 溶液中microRNA的濃度和體系中螢光改變值製作標準工作曲線。
全文摘要
本發明提供一種利用恆溫擴增反應合成螢光納米銀簇探針定量檢測microRNA的分析方法。該方法是，設計一條含有三種功能序列的DNA擴增模板與靶標microRNA結合序列，nicking核酸內切酶酶切序列和合成螢光納米簇的DNA互補序列。當靶標microRNA與DNA擴增模板結合後，誘導恆溫擴增反應和nicking核酸內切酶特異性的酶切反應，得到大量單鏈DNA產物，其中合成螢光納米銀簇的DNA序列與硝酸銀溶液在硼氫化鈉的還原作用下製備螢光納米銀簇探針，測定反應體系的螢光信號並計算螢光改變值，與標準工作曲線比對，推算出靶標microRNA的濃度。該方法具有靈敏度高、特異性強、線性檢測範圍寬、背景信號低、操作簡單等特點，可廣泛應用於組織，血液或細胞的生物樣本中microRNA檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102719526SQ20121010745
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者劉玉強, 葉邦策, 尹斌成 申請人:華東理工大學