治療肌肉和心血管病症的組合物和方法

2023-05-09 02:46:36

專利名稱：治療肌肉和心血管病症的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及在肌肉和心血管病症中涉及的新的小RNA(microRNA)、mir-208-2。 本發明還涉及寡核苷酸治療劑(反義寡核苷酸和/或雙鏈寡核苷酸)及其在治療由 mir-208-2失調導致的肌肉和心血管病症中的用途。
背景技術：
小RNA(miRNA)是一類非編碼的RNA基因，其終產物是約22nt的功能性RNA分子。 它們是從內源編碼的不完全髮夾前體加工而成的單鏈RNA。它們似乎通過對靶標mRNA的 3』-非翻譯區(UTR)鹼基配對經由翻譯抑制而起作用(Griffith-Jones等人,2006、Nucleic Acids Research,卷 34、D140-D144)。小RNA(miRNA)的生物生成是個複雜、多步驟的過程。由RNA聚合酶II轉錄的初級miRNA轉錄物大小範圍在幾百至幾千個核苷酸長度(pri-miRNA)。MiRNA可以追溯為兩種基因組來源。一些miRNA位於蛋白質編碼基因的內含子區域內。其它的位於非編碼RNA 的內含子或外顯子之中。有趣的是，pri-miRNA能夠編碼單個miRNA，也可以含有成簇的多個miRNA。其後,通過核內核糖核酸酶III (RNaseIII)內切核酸酶Drosha將pri-miRNA加工為 70nt髮夾(pre-miRNA)。然後通過Exporin5/RanGTP將pre-miRNA從核內運輸出來進入細胞質。在細胞質中，第二 RNaselll，Dicer，連同其dsRBD蛋白質配偶體一起切割 pre-miRNA的髮夾的莖區域，由此釋放 21核苷酸的RNA-雙螺旋。miRNA雙螺旋的一條鏈進入抑制靶基因表達的蛋白質複合體，即，RNA-誘導的沉默複合體(RISC)，而另一鏈被降解。鏈的選擇依賴於該miRNA雙螺旋的局部熱力學穩定性。其5』末端較不穩定配對的鏈被載入RISC複合體。載入RISC複合體的miRNA似乎通過鹼基配對於靶標mRNA的3』-非翻譯區(UTR)經由翻譯抑制起作用。Du、T. Zamore>P. D.等人micro-Primer the biogenesis and function of microRNA. Development (2005) 132、4645_4652。目前在miRBase (http:// microrna. sanger. ac. uk)保藏了 462條人miRNA序列，且看來這一目錄將達到800。迄今為止，大量miRNA的鑑定表明，它們可能在調節和精細調節生物過程中起到複雜的作用。事實上，已經有幾種miRNA牽涉到細胞增殖控制(mir-125b和let_7)、造血B-細胞譜系命運 (mir-181)、B_細胞存活(mir_15a和mir-16-l)、腦模式發育(mir_430)、胰細胞胰島素分泌 (mir-357)、脂肪細胞發育(mir_375)和肌肉增殖和分化(miR-1和miR-133)。許多miRNA 位於涉及癌症的基因組區。例如，在大多數B-細胞慢性淋巴細胞性白血病中含有mir-16-l 和 mir-15 的族缺失或下調(B-CLL ;Calin、G.A.,等人。MicroRNA-cancer connection The beginning of a new tale. Cancer Res. (2006)66、7390_7394)。對於可能由失調的microRNA引起的疾病或病症，一直存在著尚未滿足的對其進行有效治療的需要。本發明提供滿足這一需要並賦予其它益處的化合物。本發明的化合物是能夠特異性靶向和治療失調的小RNA的核酸。一類是反義DNA或RNA ;另一類是雙鏈 RNA(dsRNA)，其也包括稱為短幹擾RNA(siRNA)的類型。siRNA是新型的治療劑，其已經顯示可以以一種稱為RNA幹擾(RNAi)的高度保守的調節機制阻斷基因表達。W099/32619(Fire 等人)公開了使用長度至少為25個核苷酸的dsRNA在秀麗隱杆線蟲(C.elegans)中抑制基因表達。已經表明，siRNA可以在其它生物體中降解靶標RNA，包括植物(見，例如， WO 99/53050, Waterhouse 等人；和 WO 99/61631, Heifetz 等人)，果妮(Drosophila)(見， 例如，Yang, D.等人，Curr. Biol. (2000) 10 :1191_1200)，和哺乳動物(見 WO 00/44895、 LimmerjPDE 101 00 586. 5,Kreutzer等人)。這一天然機制現在已經成為開發用於治療由異常或不需要的基因調節引起的病症的新型治療劑的焦點。儘管在RNAi領域的顯著進展，仍然需要各種類型的、能夠治療由新的分子病理學，例如失調的小RNA引起的疾病的藥劑。發明概述本發明人已經鑑定到滿足以上需要的新的miRNA,mir-208-2。因此,本發明涉及少於500個核苷酸的分尚的核酸分子,其特徵在於所述分尚的核酸分子包含mir-208-2 (SEQ ID NO 7) ο在一個實施方案中，例如，對於靶向pri-miRNA，包含mir-208-2 (SEQ ID NO:
7)的該分離的核酸分子長度少於200個核苷酸。在另一實施方案中，例如，對於革巴向 pre-miRNA，包含mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的該分離的核酸分子長度少於80個核苷酸。本發明的特定實施方案是選自由SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3和SEQ ID N0:4組成的組，或由SEQ ID NO 7組成的組的分離的核酸分子。本領域技術人員將立即意識到，本發明的範圍也包括由少於500個核苷酸的核酸序列組成的分離的核酸分子，所述核酸序列與上述之一互補。例如，由SEQ ID NO :8組成的分離的核酸。本發明的另一實施方案是長度在8和50個核苷酸之間的分離的核酸分子，所述分子能夠在生理條件下，例如，在細胞內(細胞質或核)，或在模擬這類條件的條件下，雜交於上述分離的核酸分子，由此抑制mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的功能，例如mir-208-2對其靶標的結合。這類分子的具體的實例是選自由SEQ ID N0:10至SEQ ID NO :77組成的組的分離的核酸分子。對於本領域技術人員而言，顯而易見的是上述分離的核酸分子能夠帶有一個或多個化學修飾，例如，選自aW帽子、bW帽子、c)修飾的核苷間鍵，或d)修飾的糖或鹼基部分。包含上述核酸和至少一個載體增殖序列的核酸載體也是本發明的實施方案。本發明還涉及包含上述核酸和至少一個載體增殖序列的核酸載體。本發明的分離的核酸分子，或本發明的核酸載體可以在例如基於液體或聚合物的治療遞送體系中做為藥物使用。本發明的這類藥物可以在患有肌肉病症的受試者中用於治療肌肉病症。這類肌肉病症的一個具體的實施方案是心血管病症。因此，本發明的藥物用於在受試者中治療心血管病症，或用於製備治療肌肉病症或心血管病症的藥物。本發明還包括用於診斷心血管病症或確定其治療策略的試劑盒。典型的，所述試劑盒包含核酸試劑，該核酸試劑含有RNA、DNA、混合的RNA或DNA形式的本發明核酸分子， 和任選地任何化學修飾。根據本發明的核酸分子也可以用於任何其它的目的，諸如，實驗的目的。因此，本發明也包括減少或增加mir-208-2表達的任何方法，其中例如在細胞內使用根據本發明的分離的核酸分子。相似的，根據本發明的核酸分子也可以用作診斷探針或用作實驗探針。本發明人還認識到兩個其它的miRNA,mir-208和mir-499,的表達與mir-208-2的表達密切關聯。因此，本發明也涉及特徵在於包含mir-208 (SEQ ID NO 6)的少於500個核苷酸的分離核酸分子、和/或特徵在於包含mir-499 (SEQ ID NO 9)的少於500個核苷酸的分離核酸分子、和/或包含mir-208 (SEQ ID NO 6)或mir-499 (SEQ ID NO 9)的互補序列的少於500個核苷酸的分離核酸分子，用於製備藥物的用途，所述藥物用於治療肌肉病症或心血管病症、或用於診斷肌肉病症或心血管病症。附圖簡述圖I.含有人mir-208的MYH6內含子與含有mir-208-2的斑馬魚、人、黑猩猩、狗和大鼠的MYH7內含子的比對。圖2.在從不同發育階段的小鼠心臟分離的RNA中對MYH6、MYH7和18S的RT-PCR。圖3.在從不同發育階段的小鼠心臟分離的RNA中用northern印跡法分析 mir-208、mir-208-2、mir-499 和 mir-206。使用 U6 snRNA 作為加樣對照。第 11-14 道對應於50pg合成的miRNA。發明詳述本發明涉及與肌肉和心血管病症有關的新的microRNA, mir-208-2的發現。也涉及寡核苷酸治療劑(反義DNA/RNA和/或雙鏈RNA)及其用於治療肌肉和心血管病症的用途，所述病症是由於mir-208-2的失調而產生的。Mir-208-2是位於MYH7基因的內含子30 中的基因。MYH7(基因庫登錄號NM_000257 :在14號染色體)。MYH7是由球形頭部(含有肌動蛋白和ATP結合位點)繼之以杆狀的尾序列組成的運動收縮蛋白，是構建粗肌絲的結構單元之一。每個肌球蛋白絲含有兩個重鏈和四個輕鏈。心肌收縮的速率由肌球蛋白分子頭部區域中三磷酸腺苷酶(ATPase)活性的程度控制。肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性的主要決定因素和，因此肌肉收縮的速度，取決於兩個肌球蛋白重鏈同種型，MYH 6和MYH 7的相對的量。呈現高三磷酸腺苷酶活性的MYH6同種型，具有超過MYH7約四倍的酶活性。在人心臟中MYH6和MYH7以不同量表達。在衰竭的人心臟中，MYH6 mRNA和蛋白質水平被下調而MYH7被上調。Mir-208-2的轉錄與MYH7轉錄緊密相連，因為其沒有獨立的啟動子。因此僅當產生MYH7的轉錄物時，其才被轉錄。據信當加工pre-mRNA和移出內含子時，mir-208-2小 RNA從MYH7轉錄物釋放。然後內含子30的殘留內含子序列經過進一步加工而產生全長的 mir-208-2οMir-208-2在脊椎動物中是高度保守的，圖I顯示在多個物種之間mir-208-2的比對。與mir-208 (位於MYH6的內含子28中的不同小RNA)的相似性也被圖示。由本發明人鑑定的Mir-208-2基因具有下列序列(包括側翼區實際的 mir-208-2序列以粗體和下劃線表示)智人(Homo sapiens)51 -SEQ ID NO 1
CCCCACCTCCTTCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGAATTATGTTTCTGATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG~3/黑猩猩(Pantroglodytes)5' -SEQ ID NO 2CCCCACCTCCTTCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGAATTATGTTTCTGATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG-3'家犬(Canis familiar is)5' -SEQ ID NO 3CCCCAGCTCCTTCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGCGTTATGTTTCTCATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG-3'褐家鼠(Rattus norvegicus)5' -SEQ ID NO 4CCCCACCTCCTGCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGCGTTATGTTTCTCATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG-3'斑馬魚(Daniorerio)5' -GTAAGACGAACAAAAAGTTTTT-3' SEQ ID NO 5為了序列比較，還提供先前已知的來自MYH6內含子28的mir-208智人mir-2085' -ATAAGACGAGCAAAAAGCTTGT-3' SEQ ID NO 6

圖1圖示在脊椎動物物種之間mir-208-2的顯著保守性。從這一比對，可以鑑別 這一小RNA的最高保守的部分，推斷其為如下的功能性引導和反引導序列引導序列(mir-208-2):5' -ATAAGACGAACAAAAGGTTTGT-3' (SEQ IDN0 7)反引導序列5'-ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT-3' (SEQ ID NO 8)與MYH6和MYH7不同，MYH7B(基因庫登錄號NM_020884 :在20號染色體)較少被 表徵。基於其與MYH7的高度同源性，MYH7B被歸類為慢MYH同種型。至今，在文獻中沒有對 MYH7B功能的清楚描述。此外，沒有疾病聯繫被歸因於MYH7B功能障礙。有趣的是，與MYH6 和MYH7相似，MYH7B在其內含子之一中也還含有miRNA即mir-499。智人mir-4995' -TTAAGACTTGCAGTGATGTTTAA-3' SEQ ID NO 9以下包括的生物信息學分析和實施例表明新型小RNA mir-208-2參與調節與心肌 肥大有關的信號轉導通路。因此，這一小RNA的一個重要用途是作為治療可能與之有關的 病症和疾病的靶標。本發明人在這裡公開了具有治療用途的多個方法和組合物。概括而言，認為在一 些情況下減少靶標小RNA的水平可以提供治療益處。可以通過使用反義核酸分子，例如直 接結合於靶標miRNA，例如mir-208-2的反義DNA，容易地實現此減少。在其它情況下，靶標 microRNA,例如mir-208-2水平的增長將提供有益效果。可以通過使用有義核酸分子和一 些dsRNA分子，例如一些siRNA (其結合於miRNA的靶標因此與所述miRNA協同作用)，容易 的獲得這類增長。本發明因此涉及兩種類型的治療劑。在本說明書和權利要求中使用下列定義。「分離的核酸分子」意指該物質從其最初環境(例如，如果其是天然存在的，則自然 的環境)中移出。例如，在活的動物中存在的天然存在的多核苷酸不是分離的，但是從該天然系統中的一些或全部共存在的物質中分出的相同的多核苷酸或多肽是分離的，即使接下來被重新導入該天然系統。這類多核苷酸可以是載體的一部分和/或這類多核苷酸可以是組合物的一部分，且因為這類載體或組合物不是其天然環境的一部分，故仍然是分離的。「核酸載體」是設計在暴露於細胞環境，例如細胞裂解物或全細胞時被增殖和/或轉錄的核酸序列。「基因治療載體」指如下核酸載體，其還帶有用於轉染進入全細胞的功能方面，意在用於增加一個或多個基因和/或蛋白質的表達。在每個情況下，這類載體通常含有「載體增殖序列」，其通常是被細胞識別的複製起點以允許在細胞內增殖載體。大量的核酸載體和基因治療載體是本領域技術人員所熟悉的。如這裡所使用，術語「治療有效量」和「預防有效量」指在治療、預防或控制由 mir-208-2失調介導的病理過程中提供治療益處的量。治療有效的該特定量可以通過普通的醫師容易的確定，並可以根據本領域已知的因素，諸如，病理過程的類型、患者的病史和年齡、病理過程的階段和與其它物質的組合施用，而改變。如這裡所使用，「藥物組合物」包含藥理學有效量的本發明治療劑和藥物可接受的載體。如這裡所使用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡單地「有效量」指有效產生預期的藥理學、治療或預防效果的量。例如，如果當與疾病或病症有關的可測量參數降低至少 25%時一個給定的臨床治療被認為有效，則對於治療該疾病或病症而言藥物的治療有效量是實現所述參數的至少25%降低所需的量。術語「藥物可接受的載體」指用於施用治療劑的載體。這類載體包括，但不限於，鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語尤其排除細胞培養基。對於口服施用的藥物，藥物可接受的載體包括，但不限於藥物可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣、和乳糖，而玉米澱粉和海藻酸是合適的崩解劑。粘合劑可以包括澱粉和明膠，而潤滑劑，如果存在的話，通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果期望的話，片劑可以用例如單硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯的材料包被，以延遲在胃腸道中的吸收。如這裡所使用，表述「肌肉病症」包括，但不限於，心臟病理。這一表述涉及任何類型的變性肌肉病症，其原發病理可以是喪失橫紋肌肌肉和/或功能。這將包括，但不限於， 肌肉營養不良、創傷和重症肌無力。如這裡所使用，「轉化的細胞」是已導入了可表達dsRNA分子的載體的細胞。包含外源提供的核酸，例如本發明物質，的細胞，無論是瞬時轉染或穩定轉染的，也被認為是轉化的細胞。初級miRNA轉錄物由RNA聚合酶II轉錄並且其長度大小範圍可以從幾百至幾千個核苷酸(pri-miRNA)。pri-miRNA可以編碼單個的miRNA但是也可以含有數個miRNA的簇。接著，由核內的核糖核酸酶III (RNaseIII)核酸內切酶，Drosha，加工該pri-miRNA為 70nt的髮夾(pre-miRNA)。因此，取決於預期的靶標，本發明的分離的核酸分子將具有各種優選的長度。當靶向pri-miRNA時，可以使用約500個核苷酸，例如，499、450、400、350、300、 250個核苷酸的優選的長度。當靶向pre-miRNA時，優選的長度為100至200個核苷酸，例如100、120、150、180或200個核苷酸。在細胞質中，第二 RNase III，Dicer，與其dsRBD蛋白質配偶體一起，切割pre-miRNA的髮夾的莖區域，由此釋放 21個核苷酸的RNA-雙螺旋。因此，在本發明的一個實施方案中也考慮例如長度為80、70、60、50、40、30、25、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8個核苷酸的分離的多核苷酸。本發明人已經發現將mir-208-2的抑制劑注射入斑馬魚(Dario rerio)的受精卵導致心臟功能(血液循環、心臟搏動等)的顯著下降。因此，可以用這一測定法或相似的測定法來評估「mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的功能」。評估「mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的功能」 的另一可能方案是mir-208-2與其靶標的相互作用，例如與其的結合。在實施本發明時，可以使用分子生物學、微生物學、和重組DNA中的許多常規技術。這些技術是眾所周知的，並闡述在，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology, 卷 I, II,和 III, 1997 (F. M. Ausubel 編輯)；Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor,N. Y. ；DNA Cloning A Practical Approach,卷 I 和 II, 1985(D. N. Glover編輯)；01igonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait 編輯)；NucleicAcid Hybridization, 1985, (Hames 和 Higgins) !Transcription andTranslation,1984(Hames 和 Higgins 編輯)；Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney 編輯)；Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press) ；Perbal,1984, A Practical Guide to Molecular Cloning ；Methods inEnzymology 系列(Academic Press, Inc. ) ；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells, 1987(J. H. Miller和M. P. Calos編輯，Cold SpringHarbor Laboratory) jPMethods in Enzymology 卷 154 和卷 155 (分別由 Wu 和 Grossman,和 Wu 編輯)。治療劑(治療物質)本發明的某些治療劑在這裡被描述為用於增加或減少細胞中mir-208-2活性的、 包含mir-208-2的反引導和引導序列的siRNA。本發明的其它治療劑是用於減少細胞中 mir-208-2活性的反義DNA或RNA組合物。dsRNA 治療根據本發明的siRNA分子介導RNA幹擾("RNAi")。術語"RNAi"是本領域眾所周知的，通常理解為意指由具有互補於靶標基因的區域的siRNA抑制細胞中的一個或多個靶標基因。測試dsRNA介導RNAi的能力的多種測定法是本領域公知的(見，例如Elbashir 等人，Methods 26 (2002)、199-213)。根據本發明的dsRNA對基因表達的影響通常導致，相對於未用根據本發明的RNA分子處理的細胞而言，靶標基因的表達被抑制至少10%、33%、 50%、90%、95%或99%。根據本發明的"siRNA"或"小幹擾核糖核酸"具有本領域公知的意義，包括下列方面。siRNA由兩條核糖核苷酸鏈組成，其在生理條件下沿著互補區雜交。 這些鏈通常是分開的。因為兩條鏈在細胞中具有不同的功能，一條鏈被稱為「反義」鏈，也稱為「引導」序列，用於作用於RISC複合體來弓I導其至正確的mRNA進行切割。因為涉及RNA 化合物，「反義」的這一使用與在本說明書其它處提及的反義DNA化合物不同。另一鏈被稱為「反引導」序列並因為其含有與靶標序列相同的核苷酸序列，稱為有義鏈。在某些實施方案中可以由分子接頭將這些鏈連接在一起。核糖核苷酸個體可以是未修飾的天然存在的核糖核苷酸、未修飾的天然存在的脫氧核糖核苷酸或者它們可以是化學修飾的或合成的(如在本文其它處所述的)。在本說明書中使用的dsRNA包含兩個基本的類型。有如上所述的siRNA。再有，當兩條鏈是一個更大分子的一部分，並由此兩條鏈在一條鏈的3』-末端和另一鏈的5』末端之間通過連續的核苷酸鏈連接而形成雙螺旋結構時，該連接的RNA鏈被稱為「髮夾環」、「短髮夾RNA」或「shRNA」。shRNA通常從核酸載體轉錄並在目的靶標細胞中表達。如權利要求中定義的，本發明的核酸分子可以是包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO: 8並靶向與mir-208-2相同的細胞mRNA和/或mir-208-2本身的任何dsRNA。引導序列5' -ATAAGACGAACAAAAGGTTTGT-3' (SEQ ID NO : 7)反引導序列5' -ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT-3' (SEQ ID NO 8)本發明核酸分子包含基本上與靶標基因的mRNA的區域相同的區域。與靶標基因的對應序列有100%同一性的區域是合適的。這一情況稱為「完全互補」。然而，考慮到 miRNA及其作用機制的特性，取決於待靶向的mRNA的區域的長度，與靶標基因的對應區域相比，本發明核酸分子的該區域也可以含有一個、兩個或三個或更多的錯配，並由此可以是不完全互補的。然而，最重要的特徵是所述分子能夠在生理條件下，例如在細胞中，特異性的結合mir-208-2，在一個實施方案中，本發明的RNA分子特異性靶向一個給定的基因。為了僅靶向所期望的mRNA，siRNA試劑可以與靶標mRNA具有100%同源性，並與細胞或生物體中的全部其它基因有至少2個錯配核苷酸。分析和鑑定具有足夠序列同一性以能夠有效抑制特定靶標序列表達的siRNA的方法是本技術領域公知的，例如在WO 2005/059132中所述方法。可以通過本技術領域中公知的序列比較和比對算法(見Gribskov和Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991,和其中引用的參考文獻)，並通過例如BESTFIT軟體程序中執行的Smith-Waterman算法使用默認參數(例如，University of WisconsinGenetic Computing Group)計算核苷酸序列之間的百分比差異，從而優化序列同一I"生。根據本發明，與靶標互補的siRNA區域的長度可以是10-100個核苷酸、12-25個核苷酸、14-22個核苷酸或15、16、17或18個核苷酸。在與對應靶標區域有錯配的情況，互補區域的長度通常需要稍微更長一些。因為siRNA可以帶有突出的末端(其可以與靶標互補或不互補)、或與其本身而非革巴標基因互補的額外的核苷酸，故siRNA的每個鏈的總長度可以是10-100個核苷酸、15-49 個核苷酸、17-30個核苷酸或19-25個核苷酸。短語「每條鏈是49個核苷酸或更少」意指在該鏈中的連續核苷酸的總數，包括全部修飾的或未修飾的核苷酸，但不包括可以被加入該鏈的3』或5』末端的任何化學部分。插入該鏈的短的化學部分不被計算在內，設計連接兩個分開鏈的化學接頭不被認為產生連續的核苷酸。術語「在5』末端或3』末端的至少一個上的1-6個核苷酸突出」指在生理條件下由兩個分開的鏈形成的互補siRNA的結構。如果末端核苷酸是siRNA雙鏈區的一部分,認為該siRNA為平末端。如果在末端的一個或多個核苷酸是不配對的，則產生突出端。通過突出核苷酸的數目測量突出端長度。突出核苷酸可以在任一鏈的5』末端或3』末端。根據本發明的SiRNA表現高體內穩定性，並可以通過在至少一條鏈中包括至少一個修飾的核苷酸而特別適合口服遞送。因此，根據本發明的siRNA可以含有至少一個修飾的或非天然的核糖核苷酸。許多已知的化學修飾的詳細描述在公開的PCT專利申請 WO 200370918中給出和在這裡不再贅述。對於遞送而言合適的修飾包括選自aW帽子、 bW帽子、c)修飾的核苷間鍵；或d)修飾的糖或鹼基部分的化學修飾。合適的修飾包括，但不限於對糖部分的修飾(即，糖部分的2』位置，諸如，2' -0-(2-甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等人，HeIv. Chim. Acta，1995，78，486-504)， 即，烷氧基烷氧基基團)或對鹼基部分的修飾(即非天然的或修飾的鹼基，其保留與另一核苷酸鏈中的另一特定鹼基配對的能力)。其它的修飾包括所謂的「骨架」修飾，包括，但不限於，替換磷酸酯基團(用例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接相鄰的核糖核苷酸)。本文有時稱為3』帽子或5』帽子的末端修飾可以是有意義的。帽子可以由簡單加入的額外核苷酸，例如「τ-τ」(其已經被發現能賦予SiRNA穩定性)組成。帽子可以是本領域技術人員公知的更複雜化學。在一個實施方案中，3 』帽子是經由3 』碳綴合於3 』末端的化學部分，其選自式I的化合物
R13*O-P-R1 ' ' [式 I]
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X其中X 是 O 或 SRl和1 2獨立地是0!1、順2、5!1、烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基，其中烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基可以被另外的雜原子和官能團取代，優選的，雜原子選自Ν、0或 S，或官能團選自0H、NH2、SH、羧酸或酯；或Rl和R2可以是式Y-Z，其中Y是0、N、S，Z是H、烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基，其中烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基可以被另外的雜原子取代，優選雜原子選自N、 O或S。在糖部分的修飾的實例包括2,烷氧基核糖核苷酸、2'烷氧基烷氧基核糖核苷酸、鎖式核酸核糖核苷酸(LNA)、2'-氟代核糖核苷酸、嗎啉代核苷酸。也可以修飾核苷間鍵。核苷間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和醯胺鍵。Rl 可以是 0H。Rl和R2 一起可以包括1-24個C-原子、1-12個C原子、2-10個C原子、1-8或2-6 個C原子。在另一實施方案中，Rl和R2獨立地是0H、低級烷基、低級芳基、低級烷基-芳基、低級芳基-烷基，其中低級烷基、低級芳基、低級烷基-芳基、低級芳基-烷基可以被如上定義的另外的雜原子和官能團取代。在另一實施方案中，Rl和R2不都是0H。術語「低級」與有機基團或化合物連用時意指化合物或基團可以是分支的或不分支的，具有不超過且包括7個碳原子，優選1-4個碳原子。低級烷基代表，例如，甲基、乙基、 正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和分支的戊基、正己基和分支的己基。燒氧基的實例包括0_Met、O-Eth> 0-prop> 0_but、0-pent、0_hex。合成siRNA，包括含有至少一個修飾的或非天然的核糖核苷酸的siRNA，的方法是眾所周知的，可以由本領域技術人員容易的獲得。例如，多種合成化學法在公開的PCT專利申請W02005021749和W0200370918中有描述，通過參考將兩文獻併入此處。反應可以在溶液、或優選的在固相進行，或通過使用聚合物支持的試劑來進行，接著在可以形成能介導 RNAi的siRNA分子的條件下混合合成的RNA鏈。本發明也包括含有至少一個修飾的核苷酸的siRNA，所述SiRNA適於口服遞送。在功能性術語中，這意指當口服施用時，SiRNA具有合適的藥代動力學和生物分布來實現遞送至關心的靶標組織。特別地，這需要血清穩定性、缺乏免疫反應、和藥物樣行為。可以基於在本文其它處公開的標準胃酸試驗和標準血清試驗預期siRNA的這些特徵中的多種。儘管特定治療劑的設計可以採取多種形式，但某些功能性特徵可以將優選的 dsRNA與其它dsRNA區分開來。具體的，可以測試特徵例如良好的血清穩定性、高效力、缺少誘導的免疫應答、和良好的藥物樣行為(全部可以通過本領域技術人員測量)，以鑑定本發明的優選的dsRNA。在一些情況下，這些功能方面並不是全部都存在於優選的dsRNA中。 但是本領域中的技術人員能夠優化這些變量和其它變量以選擇本發明的優選的化合物。可以使用任何方法來施用本發明的dsRNA於含有失調mir-208-2的哺乳動物。例如，施用可以是局部的(例如，陰道的、經皮的等等)；口服的；或胃腸外的(例如，通過皮下、心室內、肌肉內、或腹膜內注射、或通過靜脈滴注)。施用可以是快速的(例如，通過注射)、或可以在一段時間發生(例如，通過緩慢輸注或施用緩釋製劑)。例如，可以將用或不用脂質體配製的dsRNA直接局部應用於目的組織。為了局部施用，可以將dsRNA分子配製成組合物，例如無菌的和非無菌的、水溶液、在常用溶劑， 例如乙醇中的非水性溶液、或在液態或固態油基質中的溶液。這類溶液也可以含有緩衝劑、稀釋劑、和其它合適的添加劑。局部施用的組合物可以配製為透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體、和粉末。可以使用本技術領域公知的聚合物和促透劑 (pemeabiIizer)來配製凝膠和霜劑。對於胃腸外、鞘內或心室內的施用，可以將dsRNA分子配製成組合物，例如無菌的水溶液，其還可以含有緩衝劑、稀釋劑和其它合適的添加劑(例如，通透增強劑、載體化合物和其它藥物可接受的載體)。此外，可以使用非病毒方法，例如生物或非生物的手段，如在例如美國專利 6，271，359中所述，將dsRNA分子施用於哺乳動物。非生物遞送可以通過多種方法完成，包括，不限於，(I)在脂質體上裝截本文提供的dsRNA核酸分子；(2)使dsRNA分子與脂質或脂質體複合以形成核酸-脂質或核酸-脂質體複合物；或(3)提供基於聚合物的治療遞送系統。這些技術是本技術領域眾所周知的。簡述如下。脂質體可以由通常用於體外轉染細胞的陽離子脂質和中性脂質組成。陽離子脂質可以與帶負電荷的核酸複合(例如，電荷結合)來形成脂質體。陽離子脂質體的實例包括，不限於，lipofectin、lipofectamine、Iipofectace和D0TAP。形成脂質體的操作是本技術領域眾所周知的。可以例如從磷脂醯膽鹼、二肉豆蘧醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蘧醯磷脂醯甘油或二油醯基磷脂醯乙醇胺形成脂質體組合物。眾多親脂物質是可商購的，包括 Lipofectin. RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) 和Effectene. TM. (Qiagen, Valencia, Calif·)。此外，可以使用可商購的陽離子脂質，例如DDAB或DOTAP來優化全身遞送方法，所述陽離子脂質均可以與中性脂質，例如DOPE或膽固醇混合。在一些情況下，可以使用例如由Templeton等人(Nature Biotechnology, 15 647-652 (1997))所述的脂質體。在其它實施方案中，可以使用多聚陽離子，例如聚乙烯亞胺執行體內和離體的遞送(Boletta等人，J. Am Soc. Nephrol. 7 :1728 (1996))。關於使用脂質體遞送核酸的另外的信息可以在美國專利6，271，359、PCT公開WO 96/40964和Morrissey， D.等人 2005. NatBiotechnol. 23(8) :1002-7 中找到。10/24 頁可以通過多種方法實現生物遞送，包括，但不限於，病毒載體的使用。例如，可以使用病毒載體(例如，腺病毒和皰疹病毒載體)來遞送shRNA分子於皮膚細胞和宮頸細胞。可以使用標準的分子生物技術將本文提供的一個或多個shRNA導入先前開發的許多不同病毒載體之一來遞送核酸至細胞。可以使用由此產生的病毒載體通過例如感染將一個或多個 dsRNA遞送至細胞。可以在藥物可接受的載體或稀釋劑中配製本發明的dsRNA。「藥物可接受的載體」(這裡也稱為「賦形劑」)是藥物可接受的溶劑、懸浮劑、或任何其它藥理學惰性載體。 藥物可接受的載體可以是液體或固體，並可以依據計劃的施用方式選擇從而提供期望的大小、稠度和其它有關的運輸和化學特性。典型的藥物可接受的載體包括例如，但不限於水； 鹽水溶液；粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖和其它糖類、明膠或硫酸鈣)；潤滑劑(例如，澱粉、聚乙二醇或乙酸鈉)；崩解劑(例如，澱粉或澱粉乙醇酸鈉)；和溼潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。此外，可以將本發明的dsRNA配製成含有該dsRNA的組合物，其中該dsRNA與其它分子、分子結構或核酸混合物混合、被之包囊化、與之綴合、或以另外方式結合。例如，含有本發明的一個或多個dsRNA物質的組合物也可以與在治療相似病症中使用的其它治療劑組合。可以在細胞培養物或實驗動物中利用標準藥學方法，例如，用於確定LD50(致死群體的50%的劑量)和ED50 (對群體的50%具有療效的劑量)的方法，來確定這類化合物的毒性和治療功效。在毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，其可以表達為LD50/ED50 比。優選呈現高治療指數的化合物。可以使用從細胞培養試驗和動物研究獲得的數據配製人用劑量範圍。本發明組合物的劑量通常在如下循環濃度範圍內，所述範圍包括ED50且幾乎沒有或完全沒有毒性。由使用的藥物劑型和施用途徑決定，劑量可以在此範圍內變動。對於本發明方法中使用的任何化合物，可以最初從細胞培養試驗估計治療有效劑量。可以在動物模型中配製劑量以獲得該化合物或，如果合適的話，靶標序列的多肽產物的如下循環血漿濃度範圍(例如，獲得降低濃度的多肽)，所述範圍包括在細胞培養物中確定的IC50(即，獲得症狀的半最大抑制的測試化合物濃度)。可以使用這類信息更精確的確定在人中有用的劑量。可以例如通過高效液相色譜法測量在血漿中的水平。無論如何，給藥的醫師都能夠根據在本領域已知的或本文描述的標準功效測量法中觀察到的結果，調整dsRNA的施用量和施用時間。反義DNA治療劑可以設計本發明的反義寡核苷酸(這裡有時稱為「反義分子」)以靶向mir-208-2 和減少其轉錄物的水平。同樣地，該反義分子可以靶向這一 mir-208-2的任何部分以在細胞中減少其水平。反義化合物通常被用作研究試劑和診斷劑，多年來一直是治療研究的對象。反義寡核苷酸能夠以精細的特異性抑制基因表達，常被本領域普通技術人員用於闡明特定基因的功能。也可以使用反義化合物，例如以區別生物途徑的多個成員的功能。反義分子的特異性和靈敏性也被本領域技術人員用於治療用途。已經應用反義寡核苷酸作為治療動物和人的疾病狀態的治療部分。反義寡核苷酸已經安全和有效的施用於人，並且目前正在進行多個臨床試驗。由此確立了寡核苷酸可以是有用的治療形式，可以對
12其進行配置以用於治療細胞、組織和動物、特別是人的治療方案中。在本發明中，術語「反義」指脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚體或多聚體。這一術語包括由天然存在的核苷鹼基、糖和共價核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及以相似方式行使功能的具有非天然部分的寡核苷酸。這類修飾的或取代的反義分子通常由於期望的性質，例如，增加的細胞攝取、提高的核酸靶標親和性和在核酸酶存在下增加的穩定性，而比天然形式更為優選。儘管反義寡核苷酸是反義化合物的優選的形式，但本發明也考慮其它的寡聚反義化合物，包括但不限於例如如下所述的寡核苷酸模擬物。根據本發明的反義化合物優選包含約8至約30個核苷鹼基(nucIeobase)。特別優選的是包含約8至約30個核苷鹼基(即， 約8至約30個連結的核苷)的反義寡核苷酸。如在本技術領域公知的，核苷是鹼基-糖的組合。核苷的鹼基部分通常是雜環鹼基。這類雜環鹼基的兩個最普遍的類型是嘌呤和嘧啶。 核苷酸是還包括共價連接於核苷的糖部分上的磷酸基團的核苷。對於包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基團可以連接於糖的2'、3'或5'羥基部分。在形成寡核苷酸時，磷酸基團使相鄰核苷彼此共價連接以形成線性聚合化合物。該線性聚合結構的相應末端又可以進一步連接以形成環狀結構，然而，一般優選開放的線性結構。在寡核苷酸結構內，磷酸基團通常參與形成寡核苷酸的核苷間骨架。DNA的正常連接或骨架是3'到5'磷酸二酯連接。在本發明中有用的優選反義化合物的特定實例包括含有修飾的骨架或非天然核苷間鍵的寡核苷酸。如在本說明書中定義的，具有修飾的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。出於本說明書的目的，和如有時在本技術領域所提及的，在核苷間骨架中沒有磷原子的修飾的寡核苷酸也可以被認為是寡核苷。優選的修飾的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3』 -亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯(phosphinate)、磷醯胺酯(phosphoramidate)(包括3』 -氨基磷醯胺酯和氨基烷基磷醯胺酯)、硫逐磷醯胺酯、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)(這些具有普通3』 -5』連接)、它們的2' -5*連接的類似物和具有反轉的極性的那些(其中相鄰對的核苷單位是3' -5'至5' -3'或2' -5"至 5' -2'連接)。還包括多種鹽、混合的鹽和游離酸形式。用於合成含有具有上述修飾的骨架或非天然核苷間鍵的寡核苷酸的反義化合物的技術，為本領域技術人員所熟知，並可以使用常規方法學實現。教導上述含磷鍵的製備的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利號3，687，808 ;4，469，863和5，625050 ;每一均以其整體被併入此處作為參考。其中不包括磷原子的優選的修飾的寡核苷酸骨架，可以具有這樣的骨架，其由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合的雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵、或一個或多個短鏈雜原子的或雜環的核苷間鍵形成。這些包括具有嗎啉代鍵(部分地從核苷的糖部分形成) 的骨架；娃氧燒骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亞甲基formacetyl和thioformacetyl骨架；含有鏈烯的骨架；氨基磺酸酯(sulfamate)骨架； 亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；和其它具有混合的N、
O、S和CH2組成部分的骨架。可以由本領域技術人員根據常規方法，例如，在美國專利號 5，034，506 ;5，166，315或5，677，439所述，完成這類寡核苷酸的合成，所述專利各自以其整體被併入作為參考。在其它優選的寡核苷酸模擬物中，由新的基團代替糖和核苷間鍵兩者，即核苷酸單元的骨架。保持鹼基單位以便與合適的核酸靶標化合物雜交。已經被證實具有優秀的雜交特性的一個這樣的寡聚化合物，寡核苷酸模擬物，被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架由含有醯胺的骨架，特別是氨基乙基甘氨酸骨架所代替。核苷鹼基被保留並直接或間接結合於骨架的醯胺部分的氮雜氮原子上。教導製備PNA化合物的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利號5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，其各自以其整體被併入作為參考。PNA化合物的另外的教導可以在Nielsen等人，Science，1991，254， 1497-1500 中發現。本發明的最優選實施方案是如在美國專利號5，034，506中所述的具有嗎啉代骨架結構的寡核苷酸。還優選具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架的寡核苷， 所述雜原子骨架尤其是如在美國專利號5，489，677中所述的-CH2-NH-0-CH2-、-CH2_N(CH3 )-0-CH2-[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI 骨架]、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N( CH3) -CH2-和-O-N (CH3) -CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯骨架表示為-0-P-0-CH2-]，和如在美國專利號5，602，240中所述的醯胺骨架。修飾的寡核苷酸也可以含有一個或多個取代的糖部分。優選的寡核苷酸在2』位置包含下列之一 0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-鏈烯基；0-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、鏈烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至ClO烷基或C2至ClO 鏈烯基和炔基。特別優選的是 0[(CH2)n 0]m CH3、0(CH2)n 0CH3、0(CH2)n NH2、0(CH2) nCH3、0(CH2)n 0NH2 和 0(CH2)n 0N[(CH2)n CH3) ] 2，其中 n 和 m 是 I 到約 10。其它優選的寡核苷酸在2』位置包含下列之一 C1至ClO低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、 O-烷芳基或 O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02 CH3、0N02、N02、 N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、多聚烷基氨基、取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報導基團、嵌入劑、用於改善寡核苷酸的藥代動力學特性的基團、或用於改善寡核苷酸的藥效學特性的基團、和具有相似特性的其它取代基。優選的修飾包括2,-甲氧基乙氧基 (2' -0-CH2 CH20CH3，也稱為 2' _0_ (2-甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等人，HeIv. Chim. Acta，1995，78，486-504) S卩，烷氧基烷氧基。再一優選的修飾包括2' -二甲基氨基氧基乙氧基，即，0(CH2)2 0N(CH3)2基團，也稱為W -DMA0E。此類的其它優選的修飾是如在 Rajwanshi 等人，Angew. Chem. Iht 編輯 2000，39，1656-1659 所述統稱為 LNA (鎖式核酸) 的二環類修飾。其它優選的修飾包括2'-甲氧基(2' -0-CH3)、2'-氨基丙氧基(2' -0CH2CH2 CH2NH2)和2'-氟(2' -F)。還可以在寡核苷酸的其它位置上進行相似的修飾，特別是 3』末端核苷酸上或在2』 -5'連接的寡核苷酸中的糖的3』位置，和5'末端核苷酸的5' 位置。寡核苷酸還可以具有糖模擬物，例如代替呋喃戊糖的環丁基部分。本領域的技術人員可以使用常規方法產生這類修飾的糖結構。教導製備這類修飾的糖結構的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利號4，981,957 ;5，118,800和5，700，920，其各自以其整體被併入作為參考。反義寡核苷酸還可以包括核苷鹼基(在本技術領域通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如這裡所使用，「未修飾的」或「天然的」核苷鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤㈧和鳥嘌呤(G)、和嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷鹼基包括其它的合成和天然的核苷鹼基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-滷代尿嘧啶和胞嘧啶、 5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮雜(azo)尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫脲嘧啶，8-滷代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-滷代特別是5-溴代、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。更多的核苷鹼基包括在美國專利號3，687，808中公開的那些，在 The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,pages 858-859, Kroschwitz, J. I.編輯 John Wiley & Sons, 1990 中公開的那些，由 Englisch 等人，Angewandte Chemie, InternationalEdition, 1991, 30,613 公開的那些，和由 Sanghvi, Y. S. , Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke,
S.T.和Lebleu，B.編輯，CRC Press，1993公開的那些。這些核苷鹼基中的一些對於增加本發明的寡聚化合物的結合親和力是特別有用的。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經表明，5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙螺旋穩定性O. 6-1. 2攝氏度(Sanghvi，Y. S.、 Crooke,S. T.和Lebleu,B.編輯,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton, 1993,pp. 276-278)，是目前優選的鹼基取代，尤其是當與2' -O-甲氧基乙基糖修飾組合時甚至更為優選。根據本技術領域眾所周知的方法，本領域技術人員能夠製備修飾的核苷鹼基。例如，教導製備某些上述修飾的核苷鹼基以及其它修飾的核苷鹼基的代表性的美國專利，包括，但不限於，以上提到的美國專利號3，687，808，以及美國專利4，845，205 ;5，130，302和 5，134，066，其各自以其整體被併入作為參考。本發明的寡核苷酸的另一修飾涉及化學連接於寡核苷酸的一個或多個部分或綴合物，其增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取。這樣的部分包括，但不限於，脂質部分，例如膽固醇部分(Letsinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86,6553-6556)、膽酸(Manoharan 等人，Bioorg. Med. Chem. Let. , 1994,4,1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醚(Manoharan 等人，Ann. N. Y. Acad. Sci.，1992,660, 306-309 ；Manoharan 等人， Bioorg. Med. Chem. Let. , 1993, 3, 2765-2770)、硫代膽固酉享(Oberhauser 等人,Nucl. Acids Res. , 1992, 20, 533-538)、脂肪鏈，例如，十二燒二醇或十一燒基殘基(Saison-Behmoaras 等人，EMBO J.，1991，10，1111-1118 ;Kabanov 等人，FEBS Lett.，1990，259，327-330 ; Svinarchuk等人，Biochimie, 1993, 75,49-54)、磷脂，例如，雙十六燒基-外消旋-甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或 I, 2_ 二 _0_ 雙十六燒基-外消旋-甘油-3_Η_ 膦酸三乙銨(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett. , 1995, 36, 3651-3654 ;Shea 等人，Nucl. Acids Res. , 1990,18, 3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等人，Nucleosides & Nucleotides, 1995，14，969-973)或金剛燒乙酸(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett., 1995，36，3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra 等人，Biochim. Biophys. Acta, 1995，1264， 229-237)、或十八燒基胺或己基氨基-羰基-氧基膽固醇部分(Crooke等人,J. Pharmacol. Exp. Ther.，1996，277，923-937)。教導這類寡核苷酸綴合物的製備的代表性美國專利包括， 但不限於，美國專利號4，828，979 ;4，948，882和5，688，941，其各自以其整體被併入作為參考。不需要在給定化合物中的全部位置均一的修飾，實際上可以在寡核苷酸內單個化合物中或甚至在的單個核苷上摻入一種以上的上述修飾。本發明還包括反義化合物，其為嵌合的化合物。在本發明下，「嵌合的」反義化合物或「嵌合體」是這樣的反義化合物(特別是寡核苷酸)，其含有兩個或更多個化學不同區域，每一個區域均由至少一種單體單元 (即，在寡核苷酸化合物的情況下核苷酸)組成。這些寡核苷酸通常含有至少一個如下區域，其中該寡核苷酸被修飾從而賦予該寡核苷酸對核酶降解的增加抗性、增加的細胞攝取、 和/或對靶標核酸增加的結合親和力。寡核苷酸的另外區域可以充當能夠切割RNA:DNA或 RNA = RNA雜合體的酶的底物。例如，RNase H是細胞內切核酸酶，其切割RNA = DNA雙螺旋的 RNA鏈。因此，RNase H的活化導致RNA靶標的切割，由此大大增加寡核苷酸對基因表達的抑制效率。所以，與雜交於相同靶標區域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，當使用嵌合的寡核苷酸時，用更短的寡核苷酸經常可以獲得可比的效果。可以以如上所述的兩個或更多寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的複合結構形式，形成本發明的嵌合反義化合物。這樣的化合物在本領域中也稱作雜合體或gapmer。本領域技術人員可以根據常規方法製備這些雜合體結構。教導這類雜合體結構的製備的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利號5，013，830 ;5，149，797和 5，700, 922，其各自以其整體被併入作為參考。可以通過眾所周知的固相合成技術方便和常規的製備根據本發明使用的反義化合物。這類合成儀器由多家售賣，例如，應用生物系統(FosterCity、Calif.)。可以另外的或備選的使用在本技術領域公知的用於這類合成的任何其它手段。使用相似技術製備寡核苷酸，例如硫代膦酸酯和烷基化衍生物是眾所周知的。此外，技術人員將立即理解，本發明的反義分子不必須靶向mir-208-2本身，而也可以祀向包含 mir-208-2 的 mRNA,例如 pri-miRNA 或 pre-miRNA。表I給出下調mir-208-2的優選的反義序列。可以將這裡公開的任何化學修飾應用於這些序列。表I
權利要求
1.分離的核酸分子，其包含第一鏈，其中，該第一鏈的序列為SEQIDNO :9的序列、相應於SEQ ID NO 9的RNA序列、或與SEQ ID NO 9完全互補的序列。
2.權利要求I的分尚的核酸分子，其中所述分尚的核酸分子還包括與第一鏈完全互補的第二鏈。
3.包含第一鏈和第二鏈的分離的核酸分子，其中第一鏈和第二鏈各自長度不超過大約 50個核苷酸，且第一鏈的序列包含SEQ ID NO :9的序列或相應於SEQ ID NO :9的RNA序列； 且其中第二鏈的序列包含與SEQ IDNO 9完全互補的序列。
4.權利要求I或3的分離核酸分子，其是反義寡脫氧核苷酸(ASO)或雙鏈寡核糖核苷酸(dsRNA)，可選地包括一個或多個化學修飾，所述修飾選自a) 3'帽子；b)5'帽子、c)修飾的核苷間鍵；和d)修飾的糖或鹼基部分。
5.核酸載體，其包含或編碼權利要求1-3之任一項的分離核酸分子、還包含至少一個載體增殖序列。
6.藥物組合物，其包含權利要求1-4之任一項的分離的核酸分子和藥物可接受的載體。
7.組合物，其包含權利要求1-4之任一項的分離核酸分子和基於脂質或聚合物的治療遞送體系。
8.藥物組合物,其包含根據權利要求5的核酸載體和藥物可接受的載體。
9.細胞,其包含權利要求5的核酸載體。
10.權利要求1-4之任一項的分離的核酸分子的用途，其用於製備治療肌肉病症或心血管病症的藥物。
11.用於診斷心血管病症或確定心血管病症的治療策略的試劑盒，其包含含有權利要求I或3的分尚核酸分子的核酸試劑,所述分尚核酸分子任選地還包括一個或多個化學修飾，所述修飾選自a)3'帽子；b)5'帽子、c)修飾的核苷間鍵；和d)修飾的糖或鹼基部分。
12.在細胞中減少或增加mir-499的表達的方法，包括向細胞施用包含根據權利要求 1-4之任一項的分離的核酸分子的組合物。
全文摘要
本發明涉及新型小RNA，mir-499。本發明也涉及寡核苷酸治療劑(反義寡核苷酸和/或雙鏈寡核苷酸，例如dsRNA)及其在治療肌肉和心血管疾患中的用途。
文檔編號C12N15/63GK102604951SQ201210049950
公開日2012年7月25日 申請日期2007年12月13日 優先權日2006年12月14日
發明者C·施內爾, F·塞盧卡, I·伯文克, J·哈爾, J·魏勒, M·申克-布勞恩, M·米勒 申請人:諾瓦提斯公司