一株硫丹降解菌及其在土壤修複方面的應用的製作方法
2023-05-09 01:14:26 2
專利名稱：一株硫丹降解菌及其在土壤修複方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於環境汙染物生物處理技術領域，具體涉及一株高效降解硫丹的細菌及其在土壤環境汙染修復中的應用。
背景技術：
農藥作為一種重要的農業生產資料，在保護農業生產、提高農業綜合生產能力、促進糧食穩定增產和農民持續增收等方面發揮著極其重要的作用。中國既是農藥生產大國，也是使用大國，年使用量和平均用量分別約為120萬噸和2. 34 kg/ha，位列世界第一。然而，農藥的利用率卻僅為10-20%，其餘部分全部進入土壤、水體和大氣，造成了嚴重的汙染。據統計，全國受農藥殘留汙染的農田約有1300-1600萬公頃，佔可耕面積的10%;近半數蔬菜農藥殘留超標，每年因農殘超標問題蒙受出口損失近80億美元。我國自20世紀50年代開始發展有機氯農藥，主要包括六六六、艾氏劑、狄氏劑、氯丹和七氯等產品，它們曾在工農業生產中發揮重大作用。但由於這類化合物在食物鏈中有著極強的富集作用，是重要的環境類激素和持久性有機汙染物，大部分已停止生產和使用。至今，此類農藥殘留仍在不斷威脅國民健康，制約農業經濟良性發展。硫丹(Endosulfan)由α和b硫丹組成，商品名為賽丹(Thionex)、碩丹(Thiodan)，是一種高效廣譜有機氯殺蟲劑，價格相對低廉，廣泛用於茶葉、棉花、果樹和蔬菜等作物的蟲害防治。硫丹屬高毒農藥，對動物尤其是魚類有毒，會損害動物的中樞神經系統、免疫系統、生殖系統，以及腦、肝和腎等器官。硫丹殘留期長，是有機氯殺蟲劑中環境殘留濃度最高的幾類品種之一，具有生物富集作用，在土壤中的半衰期長達6-11個月。目前，通過人工富集培養等技術，已經分離出許多具有降解有機氯農藥化合物能力的細菌和真菌。其中，細菌由於具有適應能力強、繁殖快和降解快速等特點佔據主要地位。然而，已分離到的具硫丹降解能力的高效降解菌仍十分有限，絕大多數菌株無法於10日內實現對100 mg/L硫丹的完全降解，且降解產物多為毒性更大、殘留期更長和環境危害更大的硫丹硫酸鹽(Endosulf sulfate)。李文等人曾報導過一株具硫丹降解能力的高效蒼白桿菌(C7),但該菌株對50 mg/L硫丹的降解能力在90. 2%左右,無法實現完全降解(降解速率為每日5. 64 mg/L)(李文，彭香，張京順，張琢，聞豔春。硫丹降解菌的篩選及降解性能研究。山東農業科學，2009，I :67-70)。已報導降解速率最高的菌株為綠色木黴(Trichoderma viride) H082,該菌株能夠於7日內高效降解100 mg/L硫丹，降解率達95%(竺利紅，吳吉安，孫東昌，施躍峰。硫丹降解菌H082的分離、篩選和抑菌性能研究)，但無法實現完全降解。此外，菌株H082屬絲狀真菌，與細菌菌株相比，存在以下明顯不足1)生長速率遲緩。細菌工業發酵一般介於2-3天，而絲狀真菌發酵則不少於4日，多介於6-8日。就一般工業發酵而言，細菌發酵液菌體濃度可達l_5X109CFU/mL (CFU，菌落形成單位)，而真菌固體發酵孢子數則要低一個數量級；2)發酵設備通用性差。絲狀真菌發酵多採用固體發酵床或發酵罐，設備通用性差。細菌發酵用發酵罐除可生產菌體外還可用於次生代謝物生產，如抗生素、色素和維生素等，通用性能良好；3)菌劑施用效果相對遲緩。細菌菌劑噴施後，細菌直接作用於農藥殘留，而絲狀真菌孢子則需待萌發、形成菌絲後方可作用。此外，上述二株降解菌的硫丹代謝產物、抗生素抗性和重金屬耐受性等均尚未探明，存在一定的環境施用風險。綜上所述，篩選高效、耐受重金屬、對抗生素敏感，且降解產物非硫丹硫酸鹽的硫丹降解細菌成為了研究熱點。
發明內容
本發明的目的是針對上述現有硫丹微生物對硫丹降解存在的無法於10日內實現對100 mg/L硫丹的完全降解，且降解產物多為毒性更大、殘留期更長和環境危害更大的硫丹硫酸鹽(Endosulf sulfate)的缺陷,提供一種高效硫丹降解菌。本發明的另一個目的是提供上述菌種在修復硫丹汙染土壤中的應用。
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本發明的上述技術問題是通過以下技術方案得以實施的
一株硫丹降解菌，該菌是嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)的菌株LD-6，於2012年3月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No. 5839，該菌具有高效降解硫丹的能力。保藏單位的地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，該菌的分類命名為嗜根寡養單胞菌Stenotrophomonas rhizophila。一種所述硫丹降解菌在受硫丹汙染土壤修復中的應用。作為優選，將所述菌株CGMCC No. 5839接種至含硫丹50-100 mg/L的基礎無機鹽液體培養基中，120 r/min震蕩培養48h以上，所述的基礎無機鹽液體培養基成份為(g/L)MgCl2 O. 2，NH4NO3 1，KH2PO4 2，K2HPO4 7. 5，NaCl 1，硫丹 O. I，去離子水 I L。作為優選，所述的液體培養溫度為25-30°C，基礎無機鹽液體培養基的pH為5. 4-6. 8。作為優選，所述的液體培養溫度為30°C。作為優選，將所述菌株CGMCC No. 5839接種至發酵培養基中30°C恆溫培養24小時以上，得到菌體發酵液，對受硫丹汙染的土壤噴施菌體發酵液進行降解；發酵培養基的成份為(g/L):玉米粉 10 g/L，豆柏粉 8 g/L, (NH4)2SO4 6 g/L，玉米漿 6 g/L，MgSO4 · 7H20 I g/L, K2HPO4 · 3H20 2 g/L, MnSO4 0. 05 g/L, pH 7. 2。本發明所提供的硫丹降解菌SiefloiroMofflmas rhizophila LD_6源自浙江桐廬農藥廠排汙口附近淤泥，經人工富集培養、壓力篩選和分離純化得到。該菌屬嗜根寡養單胞菌，其系統發育地位分析如圖I所示。其生理生化特徵為革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，V. P.試驗陰性，吲哚試驗陰性，專性好養，能夠在4°C生長，但無法存活於40°C，能夠以木糖為碳源，菌體形態為短杆狀，菌落呈淺黃色、圓形、邊緣齊整、光滑溼潤，菌株16SrDNA的GenBank登錄號為JQ670922，於2012年3月2日在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，編號為CGMCC No. 5839。該菌的最適生長條件為pH 7.2,溫度為30 黃萎病菌(Verticillium dahliae)^ 7J'麥赤黴病菌iFusarium eara )和辣椒枯萎病菌(/7W1Saria 呈現明顯抑制作用。可以認為菌體施用後，能夠在一定程度上起到抑制或減輕植物病害發生的作用。該菌對13 種測試金屬離子(Li+、Ag+、Cu+、Cu2+、Hg2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和Co4+)呈現不同程度的耐受性。鑑於我國土壤汙 染現狀一持久性有機汙染物汙染和重金屬汙染並存，農殘降解菌株具備重金屬耐受性能十分重要。可以認為一般土壤環境條件下，該菌體施用修復效果受重金屬抑制影響較小。該菌株在搖瓶降解試驗中(容積為250 mL的三角瓶，裝有100 mL液體無機鹽培養基，硫丹濃度為100 mg/L,搖床轉速為160 r/min,溫度為30°C ),能在10天內將硫丹完全降解(降解速率為每天10 mg/L),代謝產物為硫丹醚和硫丹二醇，二者毒性遠小於硫丹，且環境降解快速。在土壤硫丹含量為50 mg/kg情況下,施用該菌28天可使供試土樣中68. 6%的硫丹發生降解，顯著提升硫丹降解速率、縮短降解時長，具備實際應用意義和價值。該菌是已報導降解菌中，唯一一株具備硫丹降解能力的嗜根寡養單胞菌。綜上所述，本發明和現有技術相比具有如下優點
與現有技術相比，本發明的Stenotrophomonas rhizophila LD-6是第一株具備硫丹降解能力的嗜根寡養單胞菌，可在好氧條件下以硫丹作為唯一碳源和硫源進行生長繁殖，同時將其快速降解。在純培養條件下，它能將濃度為100 mg/L的硫丹在10天內降解完全。與已有硫丹降解菌株相比，該菌在具備更高硫丹降解速率(僅次於上述綠色木黴H082 )的同時，對常用抗生素敏感，能耐受13種重金屬，對多種植物病原微生物存在抑制作用，降解產物低毒或無毒，工業規模化發酵生產便捷、發酵液菌體濃度高(優於綠色木黴H082)，且具備在實際土壤環境條件下發揮硫丹降解作用的能力，該菌株有望在硫丹汙染土壤的生物環境修復中發揮重要作用。
圖I、菌株LD-6的系統發育地位分析。圖2、囷株LD-6的降解能力測試，其中· : ct硫丹；▲ b硫丹； : ct和b硫丹之和。圖3、菌株LD-6 土壤環境中的硫丹降解情況，其中口 滅活土樣中α硫丹含量(對照);■:噴施LD-6菌體滅活土樣中α硫丹含量；Λ :新鮮土樣中α硫丹含量(對照)；▲噴施LD-6菌體新鮮土樣中α硫丹含量； :滅活土樣中b硫丹含量(對照)； :噴施LD-6菌體滅活土樣中b硫丹含量；〇新鮮土樣中b硫丹含量(對照);·噴施LD-6菌體新鮮土樣中b硫丹含量。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發明的實施並不局限於下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護範圍。
在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。實施例I '.Stenotrophomonas rhizophila LD-6的分離與硫丹降解能力
現場採集浙江桐廬農藥廠排汙口附近的淤泥，用150 mL三角瓶盛裝，並迅速帶回實驗室。將取回的樣品置於硫丹選擇性基礎無機鹽液體培養基中馴化培養。培養基成份為(g/L) =MgCl2 O. 2，NH4NO3 1，KH2PO4 2，K2HPO4 7. 5，NaCl 1，硫丹 O. I，去離子水 I L, pH6.8，115°C溼熱滅菌30分鐘後備用。培養條件為28°C，120 r/min震蕩培養，容器裝液量為容器容積的1/3。此後，每隔6-7天將搖瓶靜止片刻，棄上清液，隨後補入等量的新鮮配置的選擇性液體培養基並繼續震蕩富集培養。四周後，將上述培養物均勻塗布於固體選擇性基礎無機鹽培養基(每升液體培養基中再加入20克的瓊脂)上。將塗布好的平板倒置後放入培養箱，28°C培養72小時。用無菌牙籤挑選單菌落或用接種針劃線直至出現單菌落再行轉接至新鮮配置的固體選擇性平板上，並通過氣相色譜法逐一驗證各菌株的硫丹降解能力，結果得到一株硫丹降解菌LD-6。·以OD6tltl值為O. 5的接種量將菌株LD-6接入以100 mg/L硫丹為唯一碳源和硫源的選擇性基礎無機鹽培養基中，300C，160 r/min震蕩培養。隨後，每隔2天對培養基中硫丹的殘留情況進行測試，結果如圖2所示。從中可看出菌株LD-6可以硫丹為唯一碳源和硫源進行生長，同時實現對硫丹的完全降解。本實施例說明分離得到的rhizophila LD-6可利用硫丹作為唯一碳源和硫源進行生長繁殖，並具有高效降解硫丹的能力。實施例2 -,Stenotrophomonas rhizophila LD-6 的抗藥性實驗
採用濾紙片法，選擇四環素和卡那黴素進行測試，以各抗生素濾紙片(30 μ g/片)在培養降解菌LD-6平板上的抑菌圈直徑大小，作為敏感或者耐藥的判定標準。試驗結果表明，抑菌圈直徑分別為24和16 mm，呈中度敏感反應(中度敏感範圍為四環素23-25 mm ;卡那黴素 14-22 _)。本實施例說明當菌體被釋放到自然環境中時，不會因抗(耐)藥性問題而產生超級細菌或在土著菌間傳播，為其今後的實際應用提供了安全保證。家淑紙？>.,Stenotrophomonas rhizophila LD-6 的重金屬最小抑制濃度(MIC)測試
MIC 測試設計參照 Filali 等人的研究進行(Filali B. K.，Taoufik J.，Zeroual Y.，Dzairi F. Z. , Talbi M. , Blaghen M. Waste water bacterial isolates resistant toheavy metals and antibiotics. Current Microbiology, 2000,41 (3) : 151-156),挑取等大、經活化處理的LD-6單菌落於培養試管中，30°C，160 rpm振蕩培養48小時。依菌體長勢判定MICs，每組設3個重複，分別測試該菌對13種金屬離子的耐受情況。結果如表I所示，該菌株具多重耐受性，耐受性強。
權利要求
1.一株硫丹降解菌，該菌是嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)的菌株LD-6，於2012年3月2日在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，編號為CGMCCNo. 5839，該菌具有降解硫丹的能力。
2.權利要求I所述硫丹降解菌在受硫丹汙染土壤修復中的應用。
3.權利要求I所述的應用，其特徵在於將所述菌株CGMCCNo. 5839接種至含硫丹50-100 mg/L的基礎無機鹽液體培養基中，120 r/min震蕩培養48 h以上，所述的基礎無機鹽液體培養基成份為(g/L) =MgCl2 O. 2，NH4NO3 LKH2PO4 2，K2HPO4 7. 5，NaCl 1，硫丹 O. I,去離子水I L。
4.權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的液體培養溫度為25-30°C，基礎無機鹽液體培養基的PH為5. 4-6.8。
5.權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的液體培養溫度為30°C。
6.權利要求2所述的應用，其特徵在於將所述菌株CGMCCNo. 5839接種至發酵培養基中30°C恆溫培養24小時以上，得到菌體發酵液，對受硫丹汙染的土壤噴施菌體發酵液進行降解；發酵培養基的成份為(g/L):玉米粉10 g/L，豆柏粉8 g/L，(NH4)2SO4 6 g/L，玉米漿 6 g/L, MgSO4 · 7H20 I g/L, K2HPO4 · 3H20 2 g/L, MnSO4 0. 05 g/L, pH 7. 2。
全文摘要
本發明公開了一株硫丹降解菌及其土壤修復應用。本發明所提供的硫丹降解菌是嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)的菌株LD-6，於2012年3月2日在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，編號為CGMCC No.5839，該菌可在好養條件下，10日內實現對100mg/L硫丹的完全降解，且降解產物低毒或無毒、環境降解快速；菌株LD-6對常用抗生素四環素和卡那黴素敏感，對13種供試重金屬呈現耐受性，且對能夠抑制若干植物病原菌生長；具備在實際土壤環境下高效降解硫丹的能力，能夠顯著縮短硫丹降解時長，具備實際應用意義和價值。
文檔編號C12N1/20GK102757907SQ20121010622
公開日2012年10月31日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年3月30日
發明者劉暢, 單勝道, 楊萍, 管莉菠, 虞方伯, 駱林平, 龍珍 申請人:浙江農林大學