辣椒CaCOI1.2基因及其重組表達載體和應用的製作方法

2023-05-09 01:14:36

專利名稱：辣椒CaCOI1.2基因及其重組表達載體和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，涉及ー種基因，還涉及該基因的重組表達載體和轉化體，以及該基因的應用和具體應用方法。
背景技術：
辣椒為茄科的ー種重要農作物，在世界範圍內廣泛栽培。辣椒也是ー種重要的調味品，通常和其它調味物共同運用在泡菜、烤肉等食物中。辣椒營養價值高，富含維生素A、
B、C、D、E以及多種礦物質元素如鑰、錳、鉀等。從辣椒中提取的辣椒鹼還具有藥用價值，對腰椎痛、神經痛、風溼痛以及過敏性鼻炎等都有一定治療作用。雖然傳統的植物育種在改良農作物(如質量性狀)的過程中做出了巨大的貢獻，但常規育種在篩選優良品種時難度大、耗時長，已經不能滿足辣椒生產的需要。近年來，隨著基因工程的迅速發展和轉基因技術的日益完善，基因工程育種已成為育種領域的ー個重要分支，在定向改良辣椒特性方面也顯示出極大的潛力。但目前，利用轉基因技術增加辣椒的抗病蟲、抗除草劑和抗鹽鹼性能的報導相對較多，而有關辣椒增產的報導很少。此外，由於辣椒較其它茄科植物而言再生率偏低且不穩定，轉化效率低，目前對大多數辣椒品種和不同的外植體還沒有ー個普遍適合的轉化模式，也相應增加了利用轉基因技術定向改良辣椒性狀的難度。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之ー在於提供ー種與辣椒花器官發育相關的基因，目的之ニ在於提供含有該基因的重組表達載體，目的之三在於提供含有該重組表達載體的微生物轉化體，目的之四在於提供該基因在大果實辣椒植株育種中的應用，目的之五在於提供利用該基因獲得大果實辣椒植株的方法。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案
I.辣椒J基因，開放讀碼框序列由SEQ ID No. I中第186位至第1997位核苷酸組成。進ー步，所述辣椒CaCOIL 基因的mRNA全長序列由SEQ ID No. I中第I位至第2041位核苷酸組成。2.含有所述辣椒CaCOIl. 2基因的重組表達載體。進ー步，所述重組表達載體是將辣椒基因的開放讀碼框序列插入載體PBI121的多克隆位點中而獲得的超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2。3.含有所述重組表達載體的微生物轉化體。進ー步，所述微生物為農桿菌。4.所述辣椒基因在大果實辣椒植株育種中的應用。5.利用所述辣椒CaCOIl. 2基因獲得大果實辣椒植株的方法，包括如下步驟
a.辣椒外植體的製備將辣椒種子用體積分數為75%的こ醇溶液消毒，無菌水衝洗，再用飽和磷酸鈉溶液浸泡，無菌水衝洗，最後用體積分數為1%的次氯酸鈉滅菌，無菌水衝洗，蒸餾水浸泡，播種於1/2 MS培養基上，在溫度為20±2°C、光周期為16 h/d和光照強度為1000-2000 Ix的條件下培養；取培養12天的辣椒幼苗，剪掉子葉的兩端部分，同時將下胚軸剪成長0. 8^1. 2 Cm的小段，選取子葉和下胚軸小段接入預培養培養基上，在20±2°C、黑暗條件下預培養I天，作為外植體；所述1/2 MS培養基含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 6-0. 8%的瓊脂，pH為5. 8 ;所述預培養培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、I mg/L的玉米素和0. 2 mg/L的吲哚こ酸，pH為5. 8 ;
b.辣椒CaCOIl.基因農桿菌工程菌液的製備將含有超表達雙元載體pBI121-CaCOIl. 2的根瘤農桿菌LBA4404菌株接種於YEB固體培養基上，在28±2°C、黑暗條件下培養2天，挑取單菌落，用YEB液體培養基培養2-3天，再按照體積比為0. 01:1將所得菌液加入YEB液體培養基中過夜擴大培養至OD_為I. 8-2. 0 ，室溫下6000 rpm離心，棄上清，用YEB液體培養基重懸菌體，室溫下6000 rpm離心，棄上清，用等體積的MS鹽溶液重懸菌體，即得辣椒CaCOIl. 2基因農桿菌工程菌液；所述超表達雙元載體pBI121-CaCOIl. 2是將辣椒基因的開放讀碼框序列插入載體pBI121的多克隆位點中而獲得；所述YEB固體培養基含有質量分數為I. 5%的瓊脂、50 mg/L的卡那黴素、500 mg/L的鏈黴素和50 mg/L的利福平，pH為7. 0 ;所述YEB液體培養基含有50 mg/L的卡那黴素、500 mg/L的鏈黴素和50 mg/L的利福平，pH為7. 0 ;所述MS鹽溶液的pH為5. 8 ;
c.農桿菌的侵染轉化將步驟a製得的辣椒外植體浸入步驟b製得的辣椒CaCOIl.2基因農桿菌工程菌液中浸染10-23分鐘，接入共培養培養基，在20±2°C、黑暗條件下培養
2-3天，再轉入抗性選擇培養基，在25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時和1000-2000Ix光照強度的條件下培養至長出抗性不定芽，再將抗性不定芽轉入延長選擇培養基，在25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時和1000-2000 Ix光照強度的條件下培養至形成新的植株，再將新的植株切段，所得莖段接入選擇生根培養基，在25±2°C光照16小吋、18±2°C黑暗8小時和1000-2000 Ix光照強度的條件下培養至生根，獲得轉基因辣椒植株；所述共培養培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、I mg/L的玉米素和0.2 mg/L的吲哚こ酸，pH為5.8 ;所述抗性選擇培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、0.2 mg/L的吲哚こ酸、5 mg/L的硝酸銀、5 mg/L的6-節氨基嘌呤、500 mg/L的羧節青黴素和50 mg/L的卡那黴素,pH為5. 8 ;所述延長培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、0. 5 mg/L的生長素、5 mg/L的硝酸銀、5 mg/L的6-節氨基嘌呤、2 mg/L的赤黴素、500 mg/L的羧節青黴素和50 mg/L的卡那黴素，pH為5. 8 ;所述選擇生根培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、0. I mg/L的吲哚こ酸、0. 2 mg/L的萘こ酸和50 mg/L的卡那黴素，pH為5.8 ;
d.大果實辣椒植株的獲得從步驟c獲得的轉基因辣椒植株中篩選出轉基因陽性植株，即得大果實辣椒植株。進ー步，步驟d分別採用PCR和半定量RT-PCR方法篩選轉基因陽性植株，所述PCR方法以超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2中NPTII報告基因的特異性引物NPTII-f和NPTII-r為擴增引物，所述NPTII-f和NPTII-r的序列分別如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；所述半定量RT-PCR方法以辣椒2基因與非轉基因辣椒基因組同源性較低片段的特異性弓I物CaCOI 1-df和CaCOII-dr為擴增引物，並以Actin基因為內參基因，所述CaCOI 1-df和CaCOI 1-dr的序列分別如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示,AcUn基因特異性引物Actin-f和Actin-r的序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。進ー步，所述辣椒品係為新蘇椒王。 本發明的有益效果在於本發明根據擬南芥與番茄的基因對控制花器官發育具有一定影響，且番茄與辣椒親緣關係較近的特點，克隆得到辣椒基因mRNA全長序列和完整開放讀碼框，並通過農桿菌介導將攜帶辣椒基因的超表達載體轉入新蘇椒王品系辣椒，獲得了轉基因陽性植株，結果顯示，所得轉基因陽性植株的辣椒果實大小較非轉基因辣椒植株明顯增大，從而顯著提高了辣椒產量。由於基因為辣椒自身基因，將其轉入辣椒植株中獲得的轉基因植株也不存在影響環境安全和食用安全的問題。此外，本發明構建的辣椒轉基因方法轉化效率高，具有以下特點1)農桿菌工程菌液的濃度影響菌體在植物細胞上的附著，在一定範圍內菌液濃度越大附著率越高，轉化率越大，但超過該範圍，由於菌的毒害作用或生長過快等，會使外植體受到農桿菌過度傷害而導致外植體切ロ褐化腐爛嚴重，且不利於共培養後去除農桿菌，而低於該範圍，較低的菌液濃度會使T-DNA不能有效地整合進植物細胞基因組中，大大降低轉化效果，本發明方法對辣椒CaCOIl. 2基因農桿菌工程菌液的濃度進行了優化，所得優化濃度能夠有效保證超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2的轉化率；2)外植體的浸染時間過短，會導致農桿菌不能充分吸附到細胞上而影響轉化；浸染時間過長，則外植體的傷ロ會褐化，且農桿菌汙染嚴重並在後續實驗中難以控制，本發明方法對辣椒外植體的浸染時間進行了優化，可以充分保障浸染效果；3)外植體和農桿菌的共培養是影響轉化的重要因素，共培養時間過長會使外植體因農桿菌汙染而死亡，時間過短則會使農桿菌感染和DNA轉化不充分，從而降低轉化率，同時也會增加假轉化體的出現，本發明方法對辣椒外植體與辣椒CaCOIl. 基因農桿菌エ程菌的共培養時間進行了優化；4)本發明方法中辣椒外植體在轉接入抗性選擇培養基前經黑暗處理，可在短時間內誘導出較高頻率的轉化再生芽；5)激素是影響再生頻率的主要因素之一，不同的激素組合及激素水平對誘導不同外植體愈傷和出芽的影響不同，由於辣椒苗對卡那黴素(Kan)很敏感，Kan濃度過低，選擇壓不足，易產生非轉基因植株，反之則不利於芽分化，本發明方法中抗性選擇培養基中Kan的濃度優選為50 mg/L ；6)本發明方法還對誘導生芽、延長不定芽、選擇性生根培養的培養條件進行了優化，25±2°C光照16小吋、18±2°C黑暗8小時和1000-2000 Ix光照強度為適宜的培養條件，假陽性植株一般會出現不生長或者生長緩慢現象，僅陽性植株正常生長；7)採用本發明所述選擇生根培養基進行選擇性生根培養，生根率能夠達到60%以上。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖I為CaCOIl. 2基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標準，I為CaCOIl. J基因PCR擴增產物。圖2為超表達雙元載體pBI121_CaC0I1.2的PCR鑑定圖，其中M為DNA分子量標準，I為以超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2為模板獲得的PCR擴增產物。圖3為超表達雙元載體pBI121_CaC0Il. 2的酶切鑑定圖，其中M為DNA分子量標準，I為超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2的酶切產物。圖4為轉基因陽性植株與非轉基因植株基因組DNA PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標準，NT為非 轉基因植株，LI、L2和L3分別為不同株系的轉基因陽性植株。圖5為轉基因陽性植株與非轉基因植株的半定量RT-PCR電泳圖，其中NT為非轉基因植株，LI、L2和L3分別為不同株系的轉基因陽性植株。
具體實施例方式以下將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。優選實施例中使用的辣椒品係為新蘇椒王，由重慶市種子公司提供。pMD18-T載體為Promega公司產品，質粒pBI121 (攜帶CaMV35S啟動子和終止子)和大腸桿菌DH5 a由本實驗室保存。TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3. 0試劑盒、限制性內切酶、Taq酶等為大連TaKaRa公司產品。超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)為TIANGEN公司產品。M13引物為英濰捷基(上海)貿易有限公司產品。5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D半乳糖苷(X-gal)和異丙基硫代一D-半乳糖苷(IPTG)為北京賽百勝公司產品。其餘試劑均為進ロ或國產分析純試劑。一、辣椒CaCOIl. 基因mRNA全長序列的克隆
利用番茄LeCOIl基因的mRNA序列(GenBank登錄號為AY423549 )，在辣椒ESTs庫(http://compbio. dfci. harvard, edu/cgi-bin/tgi/gimain. pl gudb=pepper)中進打BLAST分析，獲得ー個與番茄基因mRNA序列5』端高度一致的辣椒EST序列(GenBank登錄號為CA524065)。以該EST序列設計上遊引物CaCOI l_f，並以番茄ZeOVi基因的mRNA序列設計下遊引物 CaCOIl-r,引物序列如下CaC0Il_f :5』-ttctctctctacatctctccg-3』(SEQ ID No. 2) ;CaC0Il-r :5，-agacctcgaacaacttcactc-3，(SEQ ID No. 3)。以新蘇椒王品系辣椒幼葉總RNA為模板，根據TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3. 0試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成，再以該cDNA第一鏈為模板，以CaCOIl-f 和CaCOIl-r為特異引物進行PCR擴增。PCR擴增體系組成為ddH20 16.5 u 1U0XPCR Buffer2.5 ill、MgCl2 2. 5 u I, dNTP (20 u M) 1.0 yl、上下遊引物各 0.5 yl、模板 1.0 U I,Taq DNA合成酶0. 5 U 1，共25 U I。PCR擴增循環參數為94°C預變性2分鐘；然後94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共35個循環；最後72°C終延伸10分鐘。PCR擴增產物採用瓊脂糖凝膠電泳鑑定，結果如圖I所示，PCR擴增出一條大小為2041 bp的DNA片段。PCR擴增產物採用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收純化，按照試劑盒說明書操作。將純化的PCR擴增產物與pMD18-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，用M13引物進行單菌落PCR鑑定，陽性重組子再委託英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序驗證，獲得重組質粒CaCOIl. 2-pMD18-T。結果顯示，PCR擴增所得的辣椒之基因的mRNA全長序列如SEQ ID No. I中第I位至第2041位核苷酸所示，其開放讀碼框序列如SEQ ID No. I中第186位至第1997位核苷酸所示。ニ、辣椒CaCOIl. 2基因超表達雙元載體的構建
根據辣椒ぬ仍/ム之基因的開放讀碼框序列，設計如下引物CaC0Il_cf :5』 -CRCRRatCC-atggatgaccgtagctcaacg-3』 (SEQ ID 1^0.4,下劃線部分為/^麗71酶切位點)；0&(1)11-。1':5' -cgagctcctattcagcgagaaggtaagttg-3' (SEQ ID No. 5,下劃線部分為 feci 酶切位點)。以重組質粒CaCOIl. 2_pMD18_T為模板，以CaC0Il_cf和CaC0Il_cr為特異引物，PCR擴增CaCOIL 2基因的開放讀碼框片段。PCR擴增體系和循環參數如前所述。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收純化。用BamHl和feci雙酶切從純化的PCR擴增產物中切下CaCOIl. 基因的開放讀碼框片段，再與經同樣雙酶切的載體PBI121連接，獲得超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2。將構建的超表達雙元載體pBI 121-CaCOI I. 2用引物CaCOI l_cf和CaCOI l_cr進行PCR鑑定，結果如圖2所示，從超表達雙元載體pBI 121-CaCOI I. 2中擴增出了長1800 bp的DNA片段，與CaCOIL之基因的開放讀碼框片段大小一致。同時，將構建的超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2用及 /TI和feci進行雙酶切鑑定，結果如圖3所示，超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2的酶切產物分別長12800 bp和1800 bp,與載體pBI121骨架片段與辣椒CaCOIl. 2基因的開放讀碼框片段大小一致。三、辣椒CaCOIl. 2基因農桿菌工程菌株的製備
將超表達雙元載體pBI121-CaC0I I. 2採用液氮冷激法轉化根瘤農桿菌LBA4404感受態細胞，塗布於YEB固體培養基(含有I. 5%(w/w)的瓊脂、50 mg/L的Kan、500 mg/L的鏈黴素(Sm)和50 mg/L的利福平(Rif), pH 7.0)上，在28±2°C、黑暗條件下培養2天，挑取單菌落，用YEB液體培養基(含有50 mg/L的Kan、500 mg/L的Sm和50 mg/L的Rif，pH 7. 0)培養2天，取菌液進行PCR鑑定，陽性重組子即為辣椒CaCOIl. 2基因農桿菌工程菌株，-80°C凍存備用。四、農桿菌介導的辣椒QiCOIL 2基因超表達雙元載體轉化辣椒
將辣椒種子用75%(v/v)的こ醇溶液消毒2分鐘，無菌水衝洗3次，再用飽和磷酸鈉溶液浸泡8-10分鐘，無菌水衝洗3次，再用1% (v/v)的次氯酸鈉溶液滅菌20分鐘，無菌水衝洗10次，最後用蒸餾水浸泡5-8小吋，播種於1/2 MS培養基(含有3%(w/w)的蔗糖和0. 6%(w/w)的瓊脂，pH 5. 8)上，在溫度為20±2°C、光周期為16 h/d和光照強度為1000-2000 Ix的條件下培養。取培養12天的無菌幼苗，剪掉子葉的兩端部分，同時將下胚軸剪成長約Icm的小段，每個幼苗分切為7段。無菌條件下將子葉與下胚軸小段接種至裝有25 ml預培養培養基(MS培養基，含有3%(w/w)的蔗糖、0.8%(w/w)的瓊脂、I mg/L玉米素(ZT)和0. 2 mg/L的吲哚こ酸(IAA)，pH 5. 8)的培養皿中，每個培養皿接種10個截段。接種後的培養皿置20±2°C、黑暗條件下預培養I天，製得辣椒外植體。 將辣椒CaCOIl. 基因農桿菌工程菌株接種於YEB固體培養基(含有I. 5% (w/w)的瓊脂、50 mg/L 的 Kan、500 mg/L 的 Sm 和 50 mg/L 的 Rif，pH 7. 0)上，在 28±2°C、黑暗條件下培養2天，挑取單菌落，用YEB液體培養基(含有50 mg/L的Kan、500 mg/L的Sm和50mg/L的Rif，pH 7.0)培養2天，再按照體積比為0. 01:1將所得菌液加入YEB液體培養基中過夜擴大培養至OD6tltl為I. 8-2. 0，室溫下6000 rpm離心，棄上清，用YEB液體培養基重懸菌體，室溫下6000 rpm離心，棄上清，用等體積的MS鹽溶液(pH 5. 8)重懸菌體，即得辣椒CaCOIl. 2基因農桿菌工程菌液。將辣椒外植體浸入辣椒基因農桿菌工程菌液中浸染10-23分鐘，用無菌吸水紙吸去多餘菌液，接入共培養培養基(MS培養基，含有3%(w/w)的蔗糖、0. 8%(w/w)的瓊脂、I mg/L ZT和0.2 mg/L IAA，pH 5. 8)，在20±2°C、黑暗條件下培養2天，再轉入抗性選擇培養基(MS培養基，含有3%(w/w)的蔗糖、0.8%(w/w)的瓊脂、0.2 mg/L IAA,5 mg/LW AgNO3>5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(6_BA)、500 mg/L的羧苄青黴素(CarB)和50 mg/L的Kan,pH 5. 8)，在25±2°C光照16 h、18±2°C黑暗8 h和1000 Ix光強的條件下培養至長出抗性不定芽，再將抗性不定芽轉入延長培養基(MS培養基，含有3%(w/w)的蔗糖、0. 8%(w/w)的瓊脂、0. 5 mg/L IAA>5 mg/L 的 AgN03、5 mg/L 的 6_BA、2 mg/L 的赤黴素(GA3) >500 mg/ L 的 CarB 和 50 mg/L 的 Kan，pH 5. 8)，在 25±2°C光照 16 h、18±2°C黑暗 8 h 和 1000 Ix光強的條件下培養至形成新的植株，再將新的植株切斷，所得莖段接入選擇生根培養基(MS培養基，含有3%(w/w)的蔗糖、0.8%(w/w)的瓊脂、0.1 mg/L IAA、0. 2 mg/L的萘こ酸(NAA)和 50 mg/L 的 Kan，pH 5. 8)，在 25±2°C光照 16 h、18±2°C黑暗 8 h 和 2000 Ix 光強的條件下培養至生根，即得轉基因辣椒植株。五、轉基因陽性植株的篩選
I、PCR檢測NPTII基因在轉基因植株中的表達
根據超表達雙元載體pBI121-CaC0Il. 2中的NPTII報告基因序列，設計如下引物NPTII_f :5，-gtcactgaagcgggaaggg-3，(SEQ ID No.6) ;NPTII_r D -cggcgataccgtaaagcac-3 (SEQ ID No. Oo將轉基因辣椒植株移栽，分別取不同株系的轉基因辣椒植株及非轉基因辣椒植株，提取基因組DNA，然後以所得基因組DNA為模板，以NPTII-f和NPTII-r為特異引物進行PCR檢測，篩選轉基因陽性植株。PCR擴增體系如前所述。PCR擴增循環參數為94°C預變性5分鐘；然後94°C變性30秒，63°C退火30秒，72°C延伸40秒，共35個循環；最後72°C終延伸10分鐘。結果如圖4所示，不同株系轉基因陽性植株的PCR擴增產物都在500 bp左右有特異性電泳條帶，而非轉基因植株的PCR擴增產物在相應位置沒有出現電泳條帶。2、半定量RT-PCR檢測辣椒CaCOIl. 2基因在轉基因植株中的表達
將辣椒CaCOIl. 基因與非轉基因辣椒基因組(除CaCOIl. 以外的其他基因)進行對比，找出基因中與非轉基因辣椒基因組同源性較低的片段區域，據此設計如下引物CaCOI l_df :5，-ataatgagcaagcaggaaa-3』 (SEQ ID No. 8) ；CaC0Il-dr 5』-tgtcaagaagggcataaag-3』 (SEQ ID No. 9)。以 Acti'/i 基因為內參基因，設計如下引物Actin-f : 5，-agggatgggtcaaaa-ggatgc-3』 (SEQ ID No. 10) ；Actin-r 5' -gagacaacaccgcctgaatagc-3' (SEQ ID No. 11)。分別取不同株系的轉基因陽性植株及非轉基因辣椒植株，提取基因組DNA，然後以所得基因組DNA為模板，分別以CaCOI 1-df和CaCOI l_dr、Actin-f和Actin-r為特異引物進行半定量RT-PCR檢測，進ー步篩選轉基因陽性植株。PCR擴增體系如前所述。PCR擴增循環參數為94°C預變性5分鐘；然後94°C變性30秒，63°C退火30秒，72°C延伸40秒，共35個循環；最後72°C終延伸10分鐘。結果如圖5所示，不同株系轉基因陽性植株的PCR擴增產物都有一條明顯的電泳條帶，而非轉基因植株在相應位置的電泳條帶不明顯。
六、轉基因陽性植株與非轉基因植株的辣椒果實大小比較
分別取轉基因陽性植株株系I號、2號、3號和非轉基因辣椒植株所結的辣椒果實，測量果實大小並進行統計分析。結果如表I所示，轉基因陽性植株株系I號、2號、3號所結果實的平均長度、平均寬度和平均周長都較非轉基因植株所結果實明顯増大。表I轉基因陽性植株與非轉基因植株的辣椒果實大小比較
權利要求
1.辣椒基因，其特徵在於，開放讀碼框序列由SEQID No. I中第186位至第1997位核苷酸組成。
2.權利要求I所述的辣椒基因，其特徵在於，mRNA全長序列由SEQID No. I中第I位至第2041位核苷酸組成。
3.含有權利要求I或2所述辣椒CaCOIl.2基因的重組表達載體。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在於，是將辣椒基因的開放讀碼框序列插入載體PBI121的多克隆位點中而獲得的超表達雙元載體pBI121-CaCOIl. 2。
5.含有權利要求3或4所述重組表達載體的微生物轉化體。
6.根據權利要求5所述的微生物轉化體，其特徵在於，所述微生物為農桿菌。
7.權利要求I或2所述的辣椒CaCOIl.2基因在大果實辣椒植株育種中的應用。
8.利用權利要求I所述的辣椒基因獲得大果實辣椒植株的方法，其特徵在於包括如下步驟 a.辣椒外植體的製備將辣椒種子用體積分數為75%的こ醇溶液消毒，無菌水衝洗，再用飽和磷酸鈉溶液浸泡，無菌水衝洗，最後用體積分數為1%的次氯酸鈉滅菌，無菌水衝洗，蒸餾水浸泡，播種於1/2 MS培養基上，在溫度為20±2°C、光周期為16 h/d和光照強度為1000-2000 Ix的條件下培養；取培養12天的辣椒幼苗，剪掉子葉的兩端部分，同時將下胚軸剪成長0. 8-1. 2 Cm的小段，選取子葉和下胚軸小段接入預培養培養基上，在20 ±2°C、黑暗條件下預培養I天，作為外植體；所述1/2 MS培養基含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 6-0. 8%的瓊脂，pH為5. 8 ;所述預培養培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、I mg/L的玉米素和0. 2 mg/L的吲哚こ酸，pH為5. 8 ; b.辣椒CaCOIl.基因農桿菌工程菌液的製備將含有超表達雙元載體pBI121-CaCOIl. 2的根瘤農桿菌LBA4404菌株接種於YEB固體培養基上，在28±2°C、黑暗條件下培養2天，挑取單菌落，用YEB液體培養基培養2-3天，再按照體積比為0. 01:1將所得菌液加入YEB液體培養基中過夜擴大培養至OD_為I. 8-2. 0，室溫下6000 rpm離心，棄上清，用YEB液體培養基重懸菌體，室溫下6000 rpm離心，棄上清，用等體積的MS鹽溶液重懸菌體，即得辣椒CaCOIl. 2基因農桿菌工程菌液；所述超表達雙元載體pBI121-CaCOIl. 2是將辣椒基因的開放讀碼框序列插入載體pBI121的多克隆位點中而獲得；所述YEB固體培養基含有質量分數為I. 5%的瓊脂、50 mg/L的卡那黴素、500 mg/L的鏈黴素和50 mg/L的利福平，pH為7. 0 ;所述YEB液體培養基含有50 mg/L的卡那黴素、500 mg/L的鏈黴素和50 mg/L的利福平，pH為7. 0 ;所述MS鹽溶液的pH為5. 8 ; c.農桿菌的侵染轉化將步驟a製得的辣椒外植體浸入步驟b製得的辣椒CaCOIl.2基因農桿菌工程菌液中浸染10-23分鐘，接入共培養培養基，在20±2°C、黑暗條件下培養2-3天，再轉入抗性選擇培養基，在25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時和1000-2000Ix光照強度的條件下培養至長出抗性不定芽，再將抗性不定芽轉入延長選擇培養基，在25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時和1000-2000 Ix光照強度的條件下培養至形成新的植株，再將新的植株切斷，所得莖段接入選擇生根培養基，在25±2°C光照16小吋18±2°C黑暗8小時和1000-2000 Ix光照強度的條件下培養至生根，獲得轉基因辣椒植株；所述共培養培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、I mg/L的玉米素和0. 2 mg/L的吲哚こ酸，pH為5. 8 ;所述抗性選擇培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、0.2 mg/L的吲哚こ酸、5 mg/L的硝酸銀、5 mg/L的6-節氨基嘌呤、500 mg/L的羧節青黴素和50 mg/L的卡那黴素,pH為5. 8 ;所述延長培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、0. 5 mg/L的生長素、5 mg/L的硝酸銀、5 mg/L的6-節氨基嘌呤、2 mg/L的赤黴素、500 mg/L的羧節青黴素和50 mg/L的卡那黴素，pH為5. 8 ;所述選擇生根培養基為MS培養基，含有質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0. 8%的瓊脂、0. I mg/L的吲哚こ酸、0. 2 mg/L的萘こ酸和50 mg/L的卡那黴素，pH為5.8 ;d.大果實辣椒植株的獲得從步驟c獲得的轉基因辣椒植株中篩選出轉基因陽性植株，即得大果實辣椒植株。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於步驟d分別採用PCR和半定量RT-PCR方法篩選轉基因陽性植株，所述PCR方法以超表達雙元載體pBI121-CaCOIl. 2中NPTII報告基因的特異性引物NPTII-f和NPTII-r為擴增引物，所述NPTII-f和NPTII_r的序列分別如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；所述半定量RT-PCR方法以辣椒CaCOIl. 2基因與非轉基因辣椒基因組同源性較低片段的特異性引物CaCOIl-df和CaCOIl-dr為擴增引物，並以Ki/ 基因為內參基因，所述CaCOI 1-df和CaCOI 1-dr的序列分別如SEQ ID No. 8和SEQID No. 9所不，Actin基因特異性引物Actin-f和Actin-r的序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11 所示。
10.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述辣椒品係為新蘇椒王。
全文摘要
本發明公開了辣椒CaCOI1.2基因，開放讀碼框序列由SEQIDNo.1中第186位至第1997位核苷酸組成，還公開了含有辣椒CaCOI1.2基因的重組表達載體和轉化體，以及辣椒CaCOI1.2基因在大果實辣椒植株育種中的應用和具體的應用方法，研究結果顯示，通過農桿菌介導將攜帶辣椒CaCOIl.2基因的超表達載體轉入新蘇椒王品系辣椒，所得轉基因陽性植株的辣椒果實大小較非轉基因辣椒植株明顯增大，從而顯著提高了辣椒產量；由於CaCOI1.2基因為辣椒自身基因，將其轉入辣椒植株中獲得的轉基因植株也不存在影響環境安全和食用安全的問題；本發明構建的辣椒轉基因方法轉化效率高。
文檔編號C12N15/84GK102618556SQ20121010650
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者曾華, 楊勇衛, 王貴學, 胡宗利, 胡廷章, 譚麗莉, 陳國平 申請人:重慶大學