動物乳腺組織特異性高效表達載體的製作方法
2023-04-27 10:41:31 3
專利名稱：動物乳腺組織特異性高效表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種使外源基因在動物乳腺組織中特異表達的載體，具體地說是一種可以驅動外源基因在動物乳腺組織而不是其它組織合成該基因編碼的蛋白質的生物元件。它包括控制外源基因在乳腺組織特異表達的羊BLG基因的調控序列，驅動外源基因高效合成蛋白質的小鼠STAT序列，便於將外源基因裝入載體的合成DNA片段，以及供載體連同插入其上的外源基因在大腸桿菌中複製的PBluescriptSK序列。
乳腺組織是一群專門化的動物細胞，主要功能是合成乳蛋白。其合成蛋白質的能力非常強，超過動物體任何其它組織。一頭優良奶牛一年可以生產乳蛋白300公斤，一隻綿羊一年可以生產乳蛋白30公斤，即使一隻家免一年也可以生產1.2-1.5公斤蛋白質。因此，如果採用轉基因技術將外源基因，特別是編碼有醫療價值的基因，如人幹擾素基因，人胰島素基因，人生長激素基因或人促紅細胞生成素基因等轉入動物體內，就有可能創造一種生產這些醫用蛋白質的生產體系。其優點是產量高、成本低和產品質量接近天然提取物(Andrew S.et.al.1993，Biotechnology，Vol.11 1263-1269)。但是外源基因轉入動物之後，它的插入地點和表達地點有隨意性，如果外源基因產物有強烈生理功能，如促紅細胞生成素可以刺激造血細胞增殖，外源基因隨意表達會殺死動物，也不能方便地提取出來，達到利用的目的。
本發明的目的是構建一種具有乳腺組織特異性和有高效表達外源基因能力的載體，使外源基因裝在本發明的載體之上並轉入動物時，能在動物乳腺中大量生產該外源基因所編碼的蛋白質。
本發明所構建的載體的獨特之處主要是第一，它包括了綿羊乳球蛋白基因(BLG)的全部調控元件，保證外源基因只在乳腺組織表達，不會在其它任何組織表達；第二，在綿羊乳球蛋白基因的兩側，組裝了小鼠的DNA序列(STAT序列)，此序列的功能是保證外源基因高效率地表達；第三，在綿羊乳球蛋白基因第一個遺傳密碼之前，插入了一段人工合成的DNA，其具體序列為5』AAGTCGACAACCCGGGAAATCGATAA3』，這一段序列中含有Sal I，Sma I和Cla I三個限制性內切酶的位點，保證外源基因插入上述三個酶切位點之中的任何一個之後，可以先於綿羊乳球蛋白基因在乳腺中表達。本載體各種組分的共同作用，是保證裝在它上邊的外源基因在轉入動物或離體培養的乳腺細胞之後，都能得到乳腺組織特異性的和高效率的表達。不論它們插入到動物的哪一條染色體，也不管它插到一條染色體上哪一個具體的位點，其表達的組織特異性和表達高效率的特點均不會消失。載體的其它部分是供載體及其所載的外源基因在大腸桿菌中擴增時所必要，不是本發明特有的。
一.用於鼠和羊乳腺表達的BLG啟動子表達載體(pBCD)參見附圖1圖1是本發明pBCD乳腺組織特異性高效表達載體的結構，載體pBluescript sk的克隆位點為NotI，圖中灰色區域是polylinker接頭(含有SalI，SmaI和CLaI位點)，插入於BLG的PvuII位點。可於此處插入所需表達的外源基因。圖中黑色區域是5』鼠染色體片段(含可使染色體解鏈的STAT序列)，4.6kb。緊挨黑色區域的左斜劃線區是羊BLG5』區域，4.5kb。圖中右斜劃線區域為羊BLG3』區域，8.3kb。圖中的白色區域為3』鼠染色體片段(含可使染色體解鏈的STAT序列)，5.0kb。
本發明pBCD(CGMCC NO 0312)於1997年7月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
二.pBCD的製備1.各部分來源a.多接頭人工合成寡核苷酸5』AAGTCGACAACCCGGGAAATCGATAA3』序列，其中含有Sall，Smal和Clal酶切位點。
b.羊BLG5』和3』區域(分別為4.5kb，8.3kb)常規方法構建染色體組基因文庫(Lambda EMBL3載體)，以一段PCR法合成的BLG啟動子區域的探針進行篩選，分別挑選出含有BLG5』、3』序列的陽性克隆，連接成完整的BLG基因。
以Sall(位於BLG5』末端)和Pvull(位於第一外顯子，部分消化)釋放出BLG5』區域4.5kb片段，克隆於pSP72載體的Sall和Pvull位點，構建成含有BLG5』序列的P5質粒。
以Pvull 位於第一個顯子，部分消化)和Xbal釋放出BLG3』區域6.5kb片段，克隆於pSP72載體的Pvull和Xbal位點，構建成含有BLG3』序列的P3質粒(具體操作參見附圖2)。
c.鼠染色體片段的克隆由一乳腺高效表達人胰蛋白酶基因(AAT)的轉基因鼠系(表達量與整合位點無關，與整合拷貝數成正比且遺傳穩定)，構建其染色體組基因文庫(在Super-cos-1 cosmid載體中)。篩選出含有整合的外源基因的重組子，基因兩側比鄰鼠染色體序列。以NotI和Sall釋放出5』鼠染然體區域(4.6kb)，以NotI和Hindlll釋放出鼠染色體3』區域(5.0kb)，分別進行克隆，命名為SK4.5和SK5.0。(具體操作參見附圖3)2.pBCD的構建(參見附圖4)，圖4中Δ表示此位點處缺失了SK載體的Sall，Clal，HindIII，EcoRI，Pstl和Smal位點。
三.pBCD乳腺表達元件的酶切圖譜(參見附圖5)四.pBCD中polylinker接頭及其附近的DNA序列---TATAA---進入外顯子1---AAGCGACCCCAGGTCGACAA
————BLG的 SallTATA盒CCCGGGAAATCGATCTGCAGCCATGAAGTGC---—— —— ——Smal Clal注使用外源基因本身的翻譯起始密碼子。
五、pBCD載體各部分的功能及使用方法附圖1描述了乳腺特異性高效表達載體的整體結構，附圖2、3、4說明了各功能部分的來源和取得它們的方法，附圖5給出pBCD載體核心部分的限制性內切酶圖譜，表示使用所列舉的限制性內切酶可以將各元件在不同位點切斷。酶切圖譜是描述一段DNA特徵，區別它與其它DNA片斷不同之點的手段之一。因此，附圖5中的酶切圖譜是載體pBCD所特有的，世界上不含有任何一段DNA給出相同的酶譜。
pBCD載體有三個功能元件。圖5中劃斜線的部分是羊乳球蛋白基因及其表達調控序列，包含該基因全部外顯子和內含子，詳細的核苷酸組成見附圖6，附圖6中大寫英文字母代表羊乳球蛋白基因的胺基酸編碼序列(外顯子)，小寫英文字母代表非編碼的內含子和轉錄區以外的部分，pBCD載體中乳球蛋白基因DNA片段長於圖6中所給出的序列，主要是在克隆該基因時連帶著克隆了乳球蛋白基因上遊和下遊的一段序列，這一部分的功能是保證插pBCD載體上的外源基因在乳腺組織特異性表達，因為外源基因是插到乳球蛋白基因啟動子的下遊，而乳球蛋白基因是一個乳腺組織特異性表達的基因。在乳球蛋白基因DNA序列兩翼各裝上一段來自小鼠的DNA(STAT序列)，其5』端片段長4.5kb，3』端片段長5.0kb。這兩個片段的來源是乳腺表AAT基因的轉基因小鼠。該小鼠能高效表達AAT基因，從它的組織中提取的AAT基因連同這兩個片段轉移到許多小鼠中，都得到高效表達，不受插入位點影響，根據基因表達原理，該片段屬於解鏈蛋白粘附的DNA片段，只要有了這個片段，DNA解鏈酶就使染色體由非工作狀態變到工作狀態，在其附近的基因就可以高效表達。這部分DNA序列的內切酶圖譜參見附圖5。處於乳球蛋白基因兩個DNA片段之間的，是一個人工合成的多接頭DNA片段，其核苷酸順序，見圖2所示。這一段DNA的功能主要是含有三個內切酶位點Sal I，Sma I和Cla I，便於任何外源基因在此處插入，這一人工合成片段在載體上的確切位置，是在乳球蛋白基因在此處插入，這一人工合成片段在載體上的確切位置，是在乳球蛋白基因啟動子中的TATA盒下遊到乳球蛋白基因第一個遺傳密碼ATG的上遊(圖7)，附圖7是轉基因小鼠奶的PAGE電泳圖，圖中箭頭所指是外源基因表達的蛋白質。任何完整的外源基因(去掉其本身的啟動子後的基因)，只要插入此處後，都能在乳球蛋白基因啟動子驅動之下，先於乳球蛋白基因表達。內切酶位點Sal I和Cla I將含在酶切後產生粘性末端，Sma I將來生鈍端，使用這三個位點的一個或兩個，可以將任何外源基因經末端修飾後插入此處。都能在乳球蛋白基因啟動子驅動之下，先於乳球蛋白基因表達。內切酶位點Sal I和Cla I將含在酶切後產生粘性末端，Sma I將來生鈍端，使用這三個位點的一個或兩個，可以將任何外源基因經末端修飾後插入此處。關於外源基因插入的操作程序，完全可以參照現有工作手冊中所載的方法進行(分子克隆手冊，曼尼安蒂斯等編著金冬雁等翻譯，科學出版社1996年出版)。
下面用實施例對本發明作進一步說明，本發明的精神和保護範圍在所附的權利要求書中。
實施例1pBCD載體在轉基因小鼠中表達羊乳球蛋白基因本實驗的目的是檢測pBCD乳腺組織特異性高效表達載體有無乳腺組織特異性表達功能，載體轉入動物之後有無不良影響。
表達載體和基因構建實驗使用的表達結構如圖1所示，換句話說就是pBCD載體本身。pBCD的核心部分是羊乳球蛋白基因，其本身就編碼完整的綿羊乳球蛋白。
轉基因小鼠的生產一實驗材料1.實驗動物昆明小白鼠和昆明小鼠與C57 BL的雜交鼠，購自計劃生育研究所動物部2.儀器 倒置相差顯微鏡(日本尼康)顯微操作儀(德國Leitz)拉針儀(日本Narishige PD-5型)解剖顯微鏡(東分公司)二氧化碳培養箱(pharmacia)3.藥品三溴乙醇，60％乳酸鈉，氯化鈣，透明質酸酶、丙酮酸鈉均購自美國Sigma公司，牛血清白蛋白(組分V)購自華美公司，PMSG，HCG購自天津實驗動物研究所，其餘藥品為國產。
4.地高辛DNA標記和檢測試劑盒，Boehringer公司。SephaglasesBandprep kit Phamacia公司。人生長激素放免試劑盒購自301醫院內分泌室。
5.尼龍膜 購自Boehrnger公司。
6.質粒pBCD。
二、方法(一)主要試劑的配製1、20×SSC，在800毫升水中溶解175.3克NaCl和88.2克檸檬酸鈉，NaOH調PH至7.0，加水定容至1升，高壓滅菌。2、變性液 1.5M NaCl，0.5M NaOH。3、中和液 1M Tris，Cl(pH7.4)，1.5M NaCl。4、鼠尾DNA抽提緩衝液50mM Tris，Cl(pH8.0)，100mM EDTA(pH8.0)，100mM NaCl 1％SDS。5、顯微注射用DNA稀釋液7mM Tris.Cl(pH7.4)0.16mM EDTA，三蒸水配製，過濾除菌。(二)M2與M16培養液的配製1.貯存液的配製配製M2與M16培養液的貯存液貯存液 成 分體積克數與濃度 (ml)A 10× 100NaCl 5.534KCl 0.356KH2PO40.162MgSO47H2O 0.293乳酸鈉 2.610或4.349克60％的漿葡萄糖 1.000青黴素 0.060鏈黴素 0.050B 10× 100NaHCO32.101酚紅 0.010C 100× 10丙酮酸鈉 0.036D 100× 10CaCl2.2H2O0.352E 10×100HEPES 5.958酚紅 0.010上述貯存液均過濾除菌，A液-20℃保存二周，其餘4℃保存一周。2.M2與M16的配製。由貯存液配製M2貯存液M2工作液(單位ml)10 50 100A(10×) 1.05.0 10.0B(10×) 0.16 0.8 1.6C(100×) 0.10 0.5 1.0D(100×) 0.10 0.5 1.0E(10×) 0.84 4.2 8.4BSA 40.0mg 200mg 400mg雙蒸水7.80 39.078.0由貯存液配製M16貯存液M16工作液 (單位ml)10 50 100A(10×) 1.0 5.0 10B(10×) 1.0 5.0 10C(100×) 0.1 0.5 1D(100×) 0.1 0.5 1BSA 40.0mg 200mg 400mg雙蒸水7.8039.078.0M2和M16均現用現配(三)轉基因用DNA的製備質粒pBCD轉化大腸桿菌DH52後，用液體培養法培養含pBCD質粒的大腸桿菌DH52。培養量根據需要可為100ml-1000ml。培養完成後用離心法(300轉/分)離心10分鐘收集細菌，用快速抽提法或大規模抽提法製備pBCDDNA(詳細操作參考曼尼安蒂斯主編的分子克隆手冊，或任何一本關於分子克隆的手冊均可)。提取的pBCD DNA用內切酶Notl酶切，TAE瓊脂糖凝膠電泳將得到一個分子量為22.4kb的大片段和一個3.0kb的小片段。22.4kb的片段是pBCD完整序列，將其切下後，再用Sephaglass Babndprep試劑盒純化備註射用。
2.用顯微注射用DNA稀釋液將純化後的DNA稀釋至2μg/ml，離心(12,000rpm，30分鐘)，取1/2體積，分裝，即可用作顯微注射。
(四)轉基因實驗方法1.小鼠的準備轉基因實驗用的小鼠分為四種類型，即供體母鼠、受體母鼠、種公鼠和結紮公鼠。
①供體母鼠，8-10周齡的雌性昆明白鼠和雜交鼠。人工誘導發情後與種公鼠交配，作為超排卵供體母鼠。
②受體母鼠，8-10周齡的雌性昆明白鼠和雜交鼠。人工誘導發情後與結紮公鼠交配，獲得假孕母鼠，可作為顯微注射後受精卵的受體。
③種公鼠，8-10周齡雄性昆明白鼠，購回後單籠飼養，並標號。1-2周後與供體母鼠交配。
④結紮公鼠8-10周齡的雄性昆明白鼠，實驗前三周作雙側輸精管結紮。
2.公鼠的輸精管結紮麻醉2.5％三溴乙醇，(0.017毫升/克體重)，腹腔注射。結紮將小鼠仰臥定於手術板上，下腹部剪毛消毒，打開腹腔，分別找出並結紮左右側輸精管，還納後閉合手術通路，關腹前切口處上少許磺胺粉以防感染。
3.超排卵供體母鼠在明暗循環的動物房中飼養一周，即可作超排卵用。用生理鹽水將PMSG及hCG稀釋為100in/ml，每隻鼠腹腔注射0.1ml，注射時間為1400PMSG，48小時後hCG，注射hCG後分別將每隻供體母鼠放入一種公鼠籠內。排卵時間一般為注射hCG後10-13小時。
4.取卵將有陰栓的供體母鼠挑出，引頸處死，0.2％新結爾滅浸泡全身，在下腹部打開腹腔，暴露兩側輸卵管及卵巢，分別取出兩側輸卵管，將之轉移到盛有M2的培養皿中，將培養皿置解剖鏡下，用尖鑷子將輸卵管壺腹部撕開，將卵輕輕撥出，加入少許透明質酸酶(0.3mg/ml)。用移卵管輕輕的吹打，待卵分散後，將卵轉入M16液滴中，M16洗4次後，放入二氧化碳孵箱中。
5.受精卵的顯微注射①持卵器的製備，取直徑1mm的硬玻璃管，在微火上烤軟，將其拉成80-150μm直徑的細管，在距頸部2cm處折斷，用燒針儀烤平斷口。
②注射針的製備，用拉針儀直徑1mm的玻璃管拉成針尖約1μm直徑的注射針。
③顯微注射，在凹玻片上各滴上M2培養液和DNA注射液(兩者不同混合)，無菌石臘油覆蓋後置顯微鏡的載物臺上。低倍鏡下將注射針吸入適量的DNA注射液。取約10個受精卵注入M2液滴中。用持卵器吸住一枚卵後轉至高倍鏡下。將注射針調至合適的角度，針尖刺入受精卵雄原核中，將DNA注射液注入約1p1，可見雄原核膨脹，迅速抽出注射針，待凹玻片上所有的卵注射完畢後，立即將卵轉移至M16培養基中，CO2孵箱培養30分鐘後即行移卵。
6.受精卵的輸卵管移植①移植用移卵管的製備將細玻璃管在酒精噴燈上燒軟，拉成150μm直徑左右，折斷後將斷端烤平。
②受精卵的準備將受精卵從M16培養液移至M2培養液中，再吸入移卵管中備用。
③受精卵的輸卵管移植選擇有陰栓的假孕母鼠，麻醉，方法同公鼠的輸精管結紮術。將鼠背側酒精消毒，在最後肋骨後約1cm處，沿脊柱作一長1.5cm的縱長切口，打開腹腔，用鑷子夾住卵巢上的脂肪墊，將卵巢和輸卵管輕輕拉出。在解剖鏡下找到輸卵管傘開口，用虹膜剪剪開外層被膜，將移卵管插入傘部後將卵吹入。兩側輸入卵部的移植同法，手術完畢後用小夾子夾住切口，一周後除去夾子。
(五)鼠尾DNA的提取2周齡以上的小鼠，即可用於提取鼠尾DNA1、剪下2cm長的鼠尾，先用70％乙醇洗淨。晾乾後放入Ependorff管中。
2、加鼠尾DNA抽提液0.7ml，將鼠尾剪碎，再加70μl濃度為10mg/ml的蛋白酶K，混勻。
3、55℃水溶18小時，不時顛倒混勻。
4、冷卻至室溫後加RNAmax使終濃度為20μg/ml，37℃水溶1小時。
5、加等體積苯酚，輕輕顛倒混合20分鐘，離心。(4℃，5000rpm，10分鐘)取上清，重複苯酚抽提兩遍，酚/氯仿抽提一遍，24∶1的氯仿∶異戊醇抽提一遍。
6、轉移水相至一新管中，加2倍體積的冷無水乙醇，混勻，沉澱立即出現。
7、將沉澱吸出，70％乙醇洗兩次，晾乾。
8、加500μl TE，室溫溶解48小時，待DNA溶解後4℃保存。
(六)PCR法篩選轉基因陽性鼠模板DNA為1μg鼠尾DNA，引物II為重新設計，其餘條件同實驗第二部分。
(七)Southern雜交鑑定轉基因陽性鼠。
1、鼠尾DNA的酶切取鼠尾DNA 20μg，BamHl酶切，酶切體系為鼠尾DNA20μg10×bufer E 20μlBamHl酶50ul加雙蒸水至200μl37℃酶切過夜2、電泳酶切後的DNA取小量電泳檢查，酶切完全後，將樣品用苯酚/氯仿抽提，乙醇沉澱後溶於20μl TE中，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，3-4v/cm，8小時。
3、轉膜①將轉移槽用清水洗淨，蒸餾水衝洗，鋪上帶窗口的塑料膜。
②剪一塊比窗口大尼龍膜，重蒸水浸泡2分鐘後，蓋於窗口上。
③把凝膠裝置在尼龍膜上，放好後不再移動。
④裝好真空裝置，啟動真空泵。調真空壓強為40mbar保持2分鐘。
⑤吸去膠上鹽酸加變性液，使之覆蓋膠面，保持30-60分鐘。
⑥吸去膠上變性液，加中和液，使之覆蓋膠面，保持20分鐘。
⑦吸去中和液，加20×SSC，調壓至90mbar，保持60分鐘。
⑧轉膜完畢，關閉真空泵，吸去SSC溶液，除去凝膠，取下尼龍膜，整理好真空轉移器及塑料膜。
⑨將尼龍膜用6×SSC漂洗後置濾紙上晾乾，80℃幹烤2小時，DNA即固定在尼龍膜上。
4、探針的標記，雜交均按Dig DNA標高和檢測試劑盒說明書進行。
(八)鼠奶中表達產物的檢測1.小鼠奶樣的製備產後第8天的母鼠先與仔鼠隔離3小時以上，腹腔注射0.3IU的催產素，10分鐘後腹腔注射三溴乙醇。麻醉後，輕輕按摩乳腺，用纏膠布的鑷子輕輕擠奶，用微量加樣器將乳汁吸出。乳汁加無菌雙蒸水5倍稀釋，離心去乳脂。每200μl加4-5μl1N HCl，混勻後離心。上清液即為乳清，可供檢測用。
2.乳清蛋白的SDCpAGE電泳5％三氯乙酸沉澱去脂乳蛋白，離心，去上清，丙酮洗沉澱一次，溶於電泳上樣緩衝液中。6％的濃縮膠，1.5％的分離膠。15v/cm電泳3小時。考馬斯亮藍染色。
電泳結果見圖7表示圖中1、2是部分提純的牛奶，其中出現的譜帶是酪蛋白。3號樣品是牛的全奶，4-6號是轉基因小鼠的奶，7號是牛乳球蛋白標樣品，8號是非轉基因小鼠的奶。從圖中可以看出，4號樣中出現了羊乳球蛋白譜帶，說明綿羊乳球蛋白基因已在小鼠中表達。而5號和6號樣品中無綿羊乳球蛋譜帶，與8號樣品(非轉基因鼠)相同，證明外源基因未在奶中表達出蛋白。
實施例2用pBCD在乳腺培養細胞中表達人的生長激素基因人生長激素基因是一種組織特異性表達的基因，在人和其它哺乳動物，生長激素基因只在腦垂體前葉細胞中表達，不在其它任何組織中表達。為了證實pBCD載體的乳腺組織特異性，將人的生長激素基因組裝到pBCD載體上，用以轉化培養的山羊乳腺細胞。實驗證明，pBCD載體可以驅動人的生長激素基因在乳腺細胞中高效表達。具體實驗程序如下1、用於羊乳腺中表達的人生長激素(hGH)基因的結構與序列----TATAA----(插入BLG外顯子1)----AAGCACGACCCCAGGTCGACAACCC以下進入hGH基因序列GATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACGCTCACCTAGCTGCA ATG GCT ACA G GTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGCACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGACGGGGGCACTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGAGTATCGCCATGTAAGCCCAGTATGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAAACAAACAGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCCCTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAG GC TCC CGG ACG TCC CTG CTCCTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGTGCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT AGTCTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAGGAG TTTGTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGACTTTCCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTCCCGAAGCGAAAATGCAGGCAGATGAGCACACGCTGAGTGAGGTTCCCAGAAAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCGTAGACCTTGGTGGGCGGTCCTTCTCCTAGGAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCATTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATTCCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCCGTGAGTGGATGCCTTGACCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACAGGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAG AAC CTAGAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAGCCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TACGGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAGGAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG GTGGGGGTGGCGCTAGGGGTCCCCAATCTTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTAGAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCCAGGCCCTGACCCAAGAGAACTCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCTAGCCTTTCTCTACACCCTGAAGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAGCAGTACCCAAGCGCTTGGCCTCTCCTTCTCTTCCTTCACTTTGCAG AGG CTG GAA GATGGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAGTTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TACGGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACATTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGCTTC TAG CTGCCC(以下進入pBCD)GGGAAATCGATCTGCAGCCATGAAGTGC------注序列中黑體字母表示外顯子序列。2、表達結構的構想構建人染色體組基因文庫(在Lamda FIX II載體中)，篩選含有人生長激素基因的重組子。以BamH I和Smal(部分消化)釋放出hGH基因片段，補平末端，將其與pBCD的Smal位點連接。得到含有hGH編碼基因的融合結構(pBCD-hGH)，參見附圖8。
3、pBCD-hGH融合基因在山羊乳腺細胞中表達(一)實驗材料實驗動物用產羔24天的泌乳期母山羊。
1.質粒pBCD-hGH2.LipofectinTMReagent，培養基MEM，199，胎牛血清購自BRL公司。
3.膠原酶II型，牛胰島素，Cortisol，催乳素購自Sigma公司。
4.細胞培養瓶購自Corning公司。
(二)主要試劑的配製1.PBS緩衝液(升，PH7.4)Na2HPO4·H2O2.9克，KH2PO40.2克NaCl 18.0克，KCL 0.2克2.MEM，199培養液。重蒸水配製，過濾除菌。
3.雙抗貯存液(100×)結晶青黴素鈉鹽 100萬單位鏈黴素 100萬單位滅菌水 100毫升小瓶分裝，每瓶3-4ml，-20℃保存。
4.胰蛋白酶貯存液(10×)NaCl 2.0克，KCL 0.4克，葡萄糖1.0克NaHCO30.58dqb，EDTA0.2dqb，酚紅0.02克。
胰蛋白酶0.5-0.6克，重蒸水100毫升，過濾除菌。
小瓶分裝，-20℃保存。
5.8％NaHCO3溶液。重蒸水配製，過濾除菌。
6.膠原酶液。10mg/ml，PBS配製，過濾除菌。
7.牛胰島素，用199培養液配成1mg/ml，過濾除菌。
8.催乳素，用199培養液配成1mg/ml，過濾除菌。
9.皮質醇，用乙醇配成2mg/ml，過濾除菌。
10.細胞生長液MEM 45ml 199 45ml雙抗1ml穀氨醯胺1mlNaHCO3(8％)調至粉紅色(PH7.1-7.3)胎牛血清10ml(三)山羊原代乳腺上皮細胞的培養1.殺羊，先用75％酒精擦洗乳腺，切下乳腺後用雙層無菌紗布包好，立即置超淨工作檯內操作。
2.用無菌手術器械剪去脂肪組織，將乳腺組織切成小塊(1cm3/塊)。
3.MEM培養基漂洗3遍。
4.將組織塊剪碎(約1mm3/塊)，加MEM培養基漂洗。
5.離心(室溫，1000rpm7分鐘)，去上清。
6.重複洗三次。
7.向組織沉澱內加入MEM和膠原酶溶液，膠原酶終濃度為1mg/ml。
8.37℃水浴搖床2小時。
9.離心(室溫1000rpm7分鐘)去上清。
10.MEM洗五次。
11.加細胞生長液20ml。
12.得到的混合物分裝至培養瓶，每個培養瓶內接種2-3ml(以鋪蓋瓶底為限)。
13. 37℃，5％CO2培養箱內培養約1小時。
14.加細胞生長液至5ml。
15. 37℃，5％CO2培養箱內培養。
(四)質粒的轉染1.將各培養瓶口之培養液傾出，199洗兩遍，加3ml無血清加穀氨醯胺的MEM/199培養基。
2.取200ul lipofectin與200ul pBCD-hGH質粒混合，室溫靜置15分鐘。
3.每培養瓶加入lipofectin-DNA複合物200ul，逐滴加入，輕搖混合。
4.37℃，5％CO2培養箱培養18小時後取樣檢測。
(五)人生長激素的放射免疫測定培養細胞中人生長激素含量的測定採用放射免疫法，測定所用試劑盒由Clonetech(上海)公司購得，採用的操作方法按廠家的說明書中所描述的方法進行，表達結果見下表所示。
表2-1原代山羊乳腺上皮細胞表達人生長激素放免測定結果(ug/106細胞)激素誘導後小時數乳腺細胞培養液0ND12 48.424 37.5636 41.648 29.56
60 36.6472 171.884 666.098 579.218 496.4ND未測出乳腺細胞裂解液的hGH含量為1.5ng/ml，未經質粒轉染的乳腺細胞的培養液未測出人生長激素。
在無激素誘導的情況下，原代山羊乳腺上皮細胞pBCD-hGH轉染後18小時pBCD-hGH基因不表達(結果未列出)。由表2-1可以看出，激素誘導12小時後，BLG/hGH基因開始表達，72小時表達量突然升高，84小時至最高，其後稍有降低。而且由於測定的是培養液，說明這是產生後分泌到細胞外的人生長激素。從乳腺細胞裂解液的檢測結果可以看出，乳腺細胞內人生長激素含量極低，說明表達產物合成後立即分泌至培養液中，證明乳腺細胞可以將帶有本身引導肽的人生長激素有效地分泌出細胞外。
原代山羊細胞經pBCD-hGH轉化後生長正常，表明外源基因對細胞沒有發生毒害。山羊乳腺細胞在培養狀態下生長情況如圖9所示。
圖1是本發明pBCD乳腺組織特異性高效表達載體的結構圖。
圖2是pBCD的製備操作圖。
圖3是鼠染色體片段的克隆操作圖。
圖4是pBCD的構建圖。
圖5是pBCD乳腺表達元件的酶切圖譜。
圖6是羊乳球蛋白基因的詳細核苷酸組成。
圖7是轉基因小鼠奶的PAGE電泳圖。
圖8是pBCD-hGH融合表達結構圖。
圖9是山羊乳細胞在培養狀態下生長情況。
權利要求
1.一種載體DNA，其特徵在於它含有羊乳球蛋白的基因及其調控序列，驅動外源基因高效合成的小鼠DNA序列(STAT序列)，便於將外源基因插入的合成的多接頭DNA片段，以及PBluescriptSK的序列。
2.根據權利要求1所述的載體DNA，其中所述多接頭DNA片段位於羊乳球蛋白基因第一個遺傳密碼子之前，該多接頭DNA的鹼基序列為5』AAGTCGACAACCCGGGAAATCGATAA 3』。
3.根據權利要求1所述的載體DNA，其中在羊乳球蛋白基因及調控序列兩側裝有小鼠的DNA序列(STAT序列)。
全文摘要
本發明公開了使外源基因在動物乳腺組織中特異表達的載體pBCD,該載體含有控制外源基因在乳腺組織特異表達的羊BLG基因及其表達控制序列,驅動外源基因高效合成蛋白質的小鼠STAT序列,以及便於將外源基因插入載體的位於羊BLG基因啟動子下遊和乳球蛋白基因第一個遺傳密碼子ATG上遊的多接頭DNA片段。本發明還公開了利用該載體在動物乳腺組織中表達外源基因(如人生長激素)的方法。
文檔編號C12N15/85GK1208771SQ9711667
公開日1999年2月24日 申請日期1997年8月15日 優先權日1997年8月15日
發明者陳永福, 陳東, 安曉榮 申請人:中國農業大學