鬱金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針的製作方法

2023-04-27 10:38:16

專利名稱：鬱金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針的製作方法
技術領域：
本發明涉及鬱金香花色苷合成途徑中的關鍵酶及其編碼基因和探針，具體地，涉及一種鬱金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針。
背景技術：
花是植物重要的生殖器官，花色是植物正常繁育後代的前提，也是觀賞植物重要經濟價值所在。研究花色物質代謝的分子機理是為選育新異花色花卉品種的基礎。花朵的顏色是花色素積累的結果。花色素主要包括類黃酮、類胡蘿蔔素以及甜菜鹼類。類黃酮的生物合成途徑是目前研究的最深入的代謝途徑之一。類黃酮生物合成途徑主要由兩類基因控制:結構基因和調節基因。其中，結構基因直接編碼與類黃酮次生代謝生物合成有關的各種酶類，而調節基因則是控制結構基因表達強度和表達方式的一類基因。調節基因編碼的轉錄因子能夠通過與結構基因啟動子中含有的能被其識別的順式作用元件結合，從而激活類黃酮生物合成途徑中多個基因的表達，有效地啟動類黃酮生物合成途徑。因此，調節基因能一定程度上調節特定次生代謝物的形成。儘管利用轉基因技術將控制類黃酮次生代謝的關鍵酶基因或其反義序列導入植物能促進或抑制該基因的表達，改變了類黃酮次生代謝途徑，改變花色，但植物類黃酮生物合成途徑複雜，涉及酶種類繁多，並不是個別關鍵酶所控制。通過轉錄因子作用，有可能激活類黃酮次生代謝途徑中多個結構基因的表達，達到的效果將比導入某個結構基因的作用更明顯。目前已在一些植物中發現了調控類黃酮生物合成途徑的調節基因，並且用轉座子標籤法等技術克隆了部分編碼轉錄因子的基因，其中MYB類轉錄因子家族是研究的最為廣泛的，它能調控類黃酮合成途徑中多個結構基因的轉錄水平。MYB轉錄因子家族成員的共同特徵是含有MYB結構域，MYB結構域在不同物種之間是高度保守的。鬱金香遺傳分子基礎研究很少，目前NCBI上只登記鬱金香屬(Tulipa) 245條核酸序列，其中與花色相關的基因有5個。鬱金香中MYB蛋白編碼基因序列及表達模式尚不清楚，也未有任何與鬱金香MYB蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報導。

發明內容
本發明的目的在於填補鬱金香MYB基因家族成員的克隆、表達模式分析以及鬱金香MYB蛋白的空白，提供了一種鬱金香MYB蛋白TfMYB2，本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針；本發明公開了鬱金香TfMYB2蛋白及其核酸序列在鬱金香不同器官、不同發育階段的表達模式。通過分析TfMYB2基因與類黃酮合成途徑中結構基因的表達模式，推測TfMYB2基因編碼的轉錄因子與結構基因的轉錄水平相關。本發明為利用基因工程技術，通過調節TfMYB2基因的表達，從而調控類黃酮生物合成途徑中多個結構基因的表達水平，或將TfMYB2基因在另外不同的植物中進行轉化，有效地提高或降低轉基因植物中類黃酮的含量，達到改變花色的目的提供了基礎，具有重要的應用價值。
一方面，本發明提供了一種具有鬱金香MYB蛋白活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香MYB蛋白活性的蛋白質。該蛋白質在花朵的不同發育階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.4所示胺基酸序列經過I 50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個以內胺基酸而得到的序列。進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.4所示胺基酸序列中I 10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。另一方面，本發明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。優選的，所述核酸序列具體為:(a)鹼基序列如SEQ ID N0.3第I 657位所示；或(b)與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(0)能與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸進行雜交的序列。優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸序列中I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸形成的序列。此外，本發明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸序列8 100個連續核苷酸的核酸分子，該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼鬱金香MYB蛋白相關的核酸分子。在本發明中，「分離的DNA」、「純化的DNA」是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。在本發明中，術語 「鬱金香TfMYB2蛋白編碼序列」指編碼具有鬱金香MYB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示的第I 657位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID N0.3所示的第I 657位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQID N0.3所示的第I 657位核苷酸序列同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ IDN0.4所示的序列。該術語還包括與SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼天然鬱金香MYB蛋白的相同功能、SEQ ID N0.3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內核苷酸。在本發明中，術語「鬱金香TfMYB2蛋白」指具有鬱金香TfMYB2蛋白活性的SEQIDN0.4所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然鬱金香TfMYB2蛋白相同功能的、SEQIDN0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I 50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括鬱金香TfMYB2蛋白的活性片段和活性衍生物。本發明的鬱金香TfMYB2蛋白的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與鬱金香TfMYB2相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用鬱金香TfMYB2蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發明中，「鬱金香TfMYB2保守性變異多肽」指與SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列相比，有至多10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行替換而產生。表I
權利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由如SEQID N0.4所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (b)SEQID N0.4所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香TfMYB2蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.按權利要求1所述的蛋白質，其特徵是，所述蛋白質為SEQID N0.4所示胺基酸序列經過I 50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個以內胺基酸而得到的序列。
3.按權利要求2所述的蛋白質，其特徵是，所述蛋白質為SEQID N0.4所示胺基酸序列中I 10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權利要求1所述蛋白質的核酸序列。
5.按權利要求4所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體為: Ca)鹼基序列如SEQ ID N0.3第I 657位所示； 或(b)與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸進行雜交的序列。
6.按權利要求4所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體為SEQID N0.3第I 657位所示的核酸序列中I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5 ^和/或:V端添加60個以內核苷酸形成的序列。
7.一種用於檢測如權利要求4所述核酸序列的探針，其特徵在於，所述探針為包含有所述核酸序列8 100個連續核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本發明提供了一種鬱金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針，所述蛋白質為如下(a)或(b)的蛋白質(a)由如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香MYB蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質。本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列，以及檢測上述核酸序列的探針；本發明為利用基因工程技術，通過調節TfMYB2基因的表達來調控類黃酮生物合成途徑中多個結構基因的表達，或將TfMYB2基因在另外不同的植物中進行轉化，有效提高或降低轉基因植物中類黃酮的含量，達到改變花色的目的提供了基礎，具有重要應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103087168SQ20131000261
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月5日 優先權日2013年1月5日
發明者袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請人:上海交通大學