通過檢測hla-dr表達量評估cd14陽性細胞抗原呈遞能力的方法

2023-04-27 20:39:46

通過檢測hla-dr表達量評估cd14陽性細胞抗原呈遞能力的方法
【專利摘要】本發明涉及臨床檢測領域，旨在提供一種通過檢測HLA-DR表達量評估CD14陽性細胞抗原呈遞能力的方法。該方法包括：從感染甲型H7N9的患者外周靜脈血中篩選出CD14和HLA-DR這一組特徵性細胞表面分子標記；通過流式細胞術檢測CD14和HLA-DR在外周血中的表達量；當HLA-DR佔CD14陽性細胞的比例為63.16%～95.32%時，表示CD14陽性細胞抗原呈遞能力處於正常範圍；當HLA-DR佔CD14陽性細胞的比例低於63.16%時，表示CD14陽性細胞呈遞能力弱。本發明通過檢測感染甲型H7N9患者的外周靜內的CD14和HLA-DR的表達量來指示患者血液CD14陽性細胞的抗原提呈能力，能夠更精準地提示患者感染的嚴重程度，為後期的診治工作提供數據支持。
【專利說明】通過檢測HLA-DR表達量評估CD14陽性細胞抗原呈遞能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及臨床檢測領域，具體為通過檢測外周血液內CD14陽性細胞表面的HLA-DR表達量來評估⑶14陽性細胞抗原呈遞能力。
【背景技術】
[0002]CD14是一種主要存在於單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，是外周血單個核細胞重要的表面分子標記。人類編碼CD14的基因位於人5號常染色體的長臂端5q23_q31，約含有1338個核苷酸殘基。從核苷酸的第76位到1200位，編碼一段有375個胺基酸殘基的多肽鏈。根據結構和性質，CD14糖蛋白可分為兩類:膜表面的CD14(mCD14)與可溶性的⑶14(s⑶14)。mCD14分子量為55kDa，其蛋白質部分由包括356個胺基酸殘基組成的多肽鏈和一個由19個胺基酸殘基組成的末端多肽鏈構成，其末端強疏水性多肽鏈通過糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨固於細胞膜。s⑶14蛋白質結構與mCD14基本相同，但s⑶14不含有PI結構，故分子量較mCD14小，約為48kDa。在體外單核細胞培養中，糖皮質激素能夠抑制單核細胞表達和釋放CD14;。在體內，急性炎症患者接受糖皮質激素治療時，血清s⑶14濃度和外周血單核細胞表面mCD14的表達都被顯著抑制。臨床上給予病人類固醇激素治療時，因其抑制mCD14的表達和sCD14的釋放，可能會增加感染的危險性。CD14生物學功能主要是識別、結合外來抗原分子(特別是細菌抗原)，介導單核細胞活化，在炎症、內毒素血症等病理反應中起重要作用。已應用於臨床檢測內毒素血症、內毒素休克等。
[0003]HLA-DR是MHC-1I類分子，含有2個分子量分別為36kD和27kD的亞基(α亞基和β亞基)，該分子主要表達於B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、活化T淋巴細胞、活化NK淋巴細胞和人祖細胞上。HLA-DR用於外周血B淋巴細胞及單核細胞的計數；鑑定淋巴瘤及白血病；活化T淋巴細胞上HLA-DR抗原的表達及外周血、淋巴組織中樹突狀細胞亞群的研究。
[0004]據世界衛生組織數據顯示，從2013年4月I日我國衛生和計劃生育委員會向世界衛生組織首次通報發生了三起人感染甲型Η7Ν9禽流感到2014年2月7日截止，我國一共發生298起人感染Η7Ν9禽流感病例，其中死亡57例。
[0005]甲型Η7Ν9禽流感病毒由Η7的HA基因和Ν9的NA基因以及甲型Η9Ν2病毒的6個內部基因片段組成的重配病毒。到目前為止，所有來自人、禽和環境中的Η7Ν9病毒具有較高的同源性，對金剛烷類抗病毒藥物耐藥，部分患者病毒體外研究表明，病毒對奧司他韋和扎那米韋敏感，且多數來自患者的病毒的相關突變(ΡΒ2基因的Ε627Κ)使其更加適應對於哺乳動物的感染。感染患者的最常見的首發症狀和體徵為流感伴隨的典型表現但不包括鼻塞和流涕，對於臨床和實驗室確診的患者，目前採取神經氨酸酶抑制劑和支持治療以外，沒有有效可靠的治療方法。在實驗室確證Η7Ν9患者的過程中，患者外周血中白細胞和淋巴細胞均減少，免疫功能受到影響。此外，在膿毒血症等重度感染患者的外周血中HLA-DR隨感染嚴重程度急劇下降。在感染和病原體清除過程中，抗原提呈是免疫應答激活的中心環節。抗原呈遞過程包括吞噬、加工處理抗原，並將處理過的抗原呈遞給效應細胞。因此，找到與患者重度感染時抗原提呈能力相關的中心點，將會為臨床治療重度感染提供幫助。
[0006]現有技術中，對⑶14陽性細胞抗原呈遞能力的檢測主要是通過普通流式細胞術實現的，多用於膿毒血症等細菌引起的感染性疾病。但該方法尚未得到確切的量化，在病毒感染的疾病中的應用也尚未明確提出，檢測方法的準確性尚待進一步加強。因此，尋找一套替代方案是十分必要的。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種通過檢測HLA-DR表達量評估CD14陽性細胞抗原呈遞能力的方法。
[0008]為解決技術問題，本發明提供以下技術方案:
[0009]提供一種通過檢測HLA-DR表達量評估⑶14陽性細胞抗原呈遞能力的方法，包括以下步驟:
[0010](I)從感染甲型H7N9的患者外周血中篩選出⑶14和HLA-DR這一組特徵性細胞表面分子標記；
[0011](2)通過流式細胞術檢測⑶14和HLA-DR在外周血中的表達量；
[0012](3)當HLA-DR佔CD 14陽性細胞的比例為63.16%?95.32% (是指平均值79.24%的95%可信區間)時，表示CD14陽性細胞抗原呈遞能力處於正常範圍；當HLA-DR佔CD14陽性細胞的比例低於63.16%時，表示⑶14陽性細胞呈遞能力弱。
[0013]與現有技術相比，本發明的有益效果在於:
[0014]本發明通過檢測感染甲型H7N9患者的外周靜內的⑶14和HLA-DR的表達量來指示患者血液⑶14陽性細胞的抗原提呈能力，能夠更精準地提示患者感染的嚴重程度，為後期的診治工作提供數據支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為流式細胞術檢測患者外周血中，⑶14陽性細胞中HLA-DR的表達水平圖。
[0016]圖2為吞噬細菌後外周血分離的單個核細胞中⑶14陽性細胞的HLA-DR的表達水平圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施進一步闡述本發明，應理解，以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的保護範圍。
[0018]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
[0019]統計學方法:採用SPSS19.0統計分析軟體分析，各樣本均數的比較採用Studentttest分析。
[0020]全血樣本採集管，流式上樣管和人紅細胞裂解液均購自BD公司，ant1-⑶14-PE抗體和ant1-HLA-DR-FITC抗體，細菌培養的LB培養基粉末購自生工生化，人淋巴細胞分離液、多聚甲醛購自上海盛兆生物科技有限公司，DAPI染料購自碧雲天生物；細菌培養箱購自上海福瑪，抗體孵育冰箱購於青島海爾公司，離心機購自Thermo公司，流式細胞儀購自Beckman coulter公司。有關血樣均由供血機構採集並提供，本發明不涉及採血行為本身。
[0021]本發明中，通過檢測HLA-DR表達量評估外周血⑶14陽性細胞抗原呈遞能力的方法，包括以下步驟:
[0022](I)從感染甲型H7N9的患者外周血中篩選出⑶14和HLA-DR這一組特徵性細胞表面分子標記；
[0023]該步驟的具體實施過程如下:
[0024]A、H7N9患者血的收集:
[0025]收集重症H7N9患者的外周血全血樣本至少10例、輕症H7N9患者的外周血全血樣本至少10例；(患者已通過年齡，體溫等指標及根據臨床表現評估的APACHE II和PMEWS評分明確診斷患有重症或輕症H7N9病毒感染)；另外收集國際健康保健中心健康體檢對照者全血。
[0026]B、檢測指標的抗體染色:
[0027]將H7N9患者的外周血全血樣本50微升加入流式管，隨後加入流式抗體ant1-CD14-PE，10微升，ant1-HLA-DR-FITC, 10微升，待血液和抗體充分混勻後置於4度環
境靜置孵育30分鐘。
[0028](2)通過流式細胞術檢測⑶14和HLA-DR在外周血中的表達量；
[0029]A、白細胞懸液的製備:`[0030]將已經孵育製備的樣本取出，加入人紅細胞裂解液(HLA) I毫升，充分混勻並不間斷輕微震蕩至液體澄清，加入PBS約3毫升，終止裂解反應。離心1200rpm，5分鐘後，棄掉上清液體，打散底部細胞，再加入500微升製備成白細胞懸液。
[0031]B、流式檢測外周相應指標:將製備好的白細胞懸液樣本置於流式細胞儀上樣架，選擇FLl和FL2通道上機檢測HLA-DR和⑶14指標的表達量。
[0032](3)當HLA-DR佔CD 14陽性細胞的比例為63.16%~95.32% (是指平均值79.24%的95%可信區間)時，表示CD14陽性細胞抗原呈遞能力處於正常範圍；當HLA-DR佔CD14陽性細胞的比例低於63.16%時，表示⑶14陽性細胞呈遞能力弱。並且，該比例數據與患者的
感染嚴重程度呈負相關。
[0033]該步驟中，據以判斷的數據來源是--叢2013年4月到2014年2月共收集健康人、感染科病人(包括除患有甲型H7N9禽流感的病人)共148例，兩組群體年齡呈正態分布，比較，兩組間特異性指標後歸納總結得出具有正常呈遞能力CD14陽性細胞的HLA-DR表達量:平均79.24% (95%可信區間:63.16%~95.32%)，低於範圍最低值的視為呈遞能力弱。
[0034]應用實施例1:
[0035]一、H7N9患者血的收集:收集浙江大學醫學院附屬第一醫院感染科就診的重症H7N9患者10例、輕症H7N9患者10例的全血樣本(患者已通過年齡，體溫等指標及根據臨床表現評估的APACHE II和PMEWS評分明確診斷患有重症或輕症H7N9病毒感染);另外收集國際健康保健中心健康體檢對照者全血。
[0036]二、檢測指標的抗體染色:抽取的外周血50微升加入流式管，隨後加入流式抗體ant1-CD14-PE，10微升，ant1-HLA-DR-FITC, 10微升，待血液和抗體充分混勻後置於4度環
境靜置孵育30分鐘。
[0037]三、白細胞懸液的製備:將已經孵育製備的樣本取出，加入人紅細胞裂解液(HLA)I毫升，充分混勻並不間斷輕微震蕩至液體澄清，加入PBS約3毫升，終止裂解反應。離心1200rpm，5分鐘後，棄掉上清液體，打散底部細胞，再加入500微升製備成白細胞懸液。
[0038]四、流式檢測外周相應指標:將製備好的白細胞懸液樣本置於流式細胞儀上樣架，選擇FLl和FL2通道上機檢測⑶14和HLA-DR指標的表達量。
[0039]經檢測，感染甲型H7N9病毒的重症病人的⑶14陽性細胞中HLA-DR表達量在12.99%?36.15%之間，其數據顯著低於感染甲型H7N9病毒的輕症患者的36.48%?50.55%這一數據(結果如圖1所示)。
[0040]應用實例2:
[0041]利用檢測HLA-DR表達量評估外周血單個核細胞吞噬細菌後其中⑶14陽性細胞抗原呈遞能力的方法，包括以下步驟:
[0042](I) H7N9患者血的收集；
[0043]該步驟與具體實施例1的內容相同。
[0044](2)從感染甲型H7N9的患者外周血中分離出外周血單個核細胞PBMC ；
[0045]將收集到的全血樣本，置於離心機中3000rpm離心5分鐘。吸出血漿後，將剩餘血細胞液加入到已放入等體積PBS的15毫升離心管中充分混勻。將混勻後的液體沿離心管壁緩慢加入到已放入與PBS等體積的人淋巴細胞分離液，注意不要與淋巴細胞分離液混合。上述操作完成後，將離心管置入離心機2000rpm離心20分鐘,取出後，吸取中間「白毛」層到已放入PBS的離心管中，洗去多餘雜質。
[0046](3 )通過流式細胞檢測HLA-DR的表達量；
[0047]該步驟具體包括:
[0048]A、細菌懸液的製備和細菌核的染色:將大腸桿菌菌株接種至LB培養板，於37攝氏度孵箱培養24小時後收集細菌，洗去雜質和死菌,棄去上清液體,加入配置好的4%多聚甲醛固定20min，洗去固定液後配置成109/ml細菌懸液，每毫升細菌懸液中加3微升DAPI染色液染色lOmin，隨後待PBS洗淨染色液後，製備成濃度為109/ml的細胞懸液。
[0049]B、單核細胞對細菌抗原的吞噬作用:將上述分離的PBMC以106/ml的濃度與細菌以1:10的比例按需加入培養板中，共分成兩孔，置於37攝氏度培養3小時。
[0050]C、單核細胞吞噬細菌後的抗原呈遞能力的流式檢測:將前一步驟中培養的PBMC和細菌混合液取出，PBS洗去多餘雜質，加入流式抗體ant1-⑶14-PE，10微升，ant1-HLA-DR-FITC, 10微升，待血液和抗體充分混勻後置於4度環境靜置孵育30分鐘。洗去抗體後，定容成500微升加入流式管置於流式細胞儀上樣架，選擇相應通道上機檢測⑶14、HLA-DR和大腸桿菌指標的表達量。
[0051]經檢測，感染甲型H7N9病毒的重症病人的單個核細胞吞噬細菌後，⑶14陽性細胞中HLA-DR表達量均為17%，其數據顯著低於感染甲型H7N9病毒的輕症患者的84.2%均值這一數據(結果如圖2所示)。
[0052]基於上述檢驗及數據比對，醫生可以對病人抗原呈遞能力進行分析。基於該分析結論，可以對病人感染嚴重程度加以判斷，為後續採取相應減輕病人感染的措施提供量化依據。
【權利要求】
1.通過檢測HLA-DR表達量評估CD14陽性細胞抗原呈遞能力的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)從感染甲型H7N9的患者外周靜脈血中篩選出⑶14和HLA-DR這一組特徵性細胞表面分子標記； (2)通過流式細胞術檢測⑶14和HLA-DR在外周血中的表達量； (3)當HLA-DR佔⑶14陽性細胞的比例為63.16%?95.32%時，表示⑶14陽性細胞抗原呈遞能力處於正常範圍；當HLA-DR佔⑶14陽性細胞的比例低於63.16%時，表示⑶14陽性細胞呈遞能力弱。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(I)的具體實施過程如下: A、H7N9患者血的收集: 收集重症H7N9患者的外周靜脈血全血樣本至少10例、輕症H7N9患者的外周靜脈血全血樣本至少10例；患者已通過年齡、體溫指標及根據臨床表現評估的APACHE II和PMEWS評分明確診斷患有重症或輕症H7N9病毒感染；另外收集健康體檢對照者全血； B、檢測指標的抗體染色: 將H7N9患者的外周靜脈血全血樣本50微升加入流式管，隨後加入流式抗體ant1-⑶14-PE10微升和ant1-HLA_DR-FITC10微升；待血液和抗體充分混勻後置於4度環境靜置孵育30分鐘。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)的具體實施過程如下: A、白細胞懸液的製備: 將已經孵育製備的樣本取出，加入人紅細胞裂解液HLAl毫升，充分混勻並不間斷輕微震蕩至液體澄清，加入PBS約3毫升，終止裂解反應；離心1200rpm，5分鐘後，棄掉上清液體，打散底部細胞，再加入500微升製備成白細胞懸液； B、流式檢測外周相應指標: 將製備好的白細胞懸液樣本置於流式細胞儀上樣架，選擇FLl和FL2通道上機檢測⑶14和HLA-DR指標的表達量。
【文檔編號】G01N15/10GK103852407SQ201410099263
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月18日 優先權日:2014年3月18日
【發明者】刁宏燕, 陳佳寧, 楊介鑽, 魏應鳳, 崔光瑩, 丁玉龍 申請人:浙江大學