黑槌蟲草真菌及其生產方法和用途的製作方法

2023-04-27 04:13:26 6

專利名稱：黑槌蟲草真菌及其生產方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及真菌及其工業發醇領域，特別涉及的是蟲草菌種的獲得及其工業化生產方法和產品的用途。
黑槌蟲草(Cordyceps gracilis)也是以蝠蛾屬(Hepialus)幼蟲為寄主的藥、食兩用蟲草，此與中國冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)相同，所含主要化學成分二者十分相似。在人工培養基上得到黑槌蟲草的無性世代羽束梗孢(Paraisaria)，最先是通過該蟲草次生子囊孢子的純分離培養而獲得，後人又從生於僵蟲體外的孢梗束上採集分離到，但從不長子座的蟲草菌核內進行分離，以及以工業生產為目的而選育出性狀優良和穩定的典型菌株的方法還未見到。
目前，從冬蟲夏草(C.sinensis)已分離到十多個無性型菌種，主要有葡萄穗黴(Stachybotry)，中國擬青黴(Paecilomyces sinensis)，蟲草頭孢菌Cephalorium sinensis)，蝙蝠蛾擬青黴(P.hepial)，蝙蝠蛾被孢黴(Mortierella hepial)，圓柱菌(Scydalium)等。因而認為冬蟲夏草的菌物複合體中的菌不是一種而是複雜的真菌系，常常發生特異的寄生、互生或共生關係。國內廠家都是採用其中某一菌種進行發酵培養，開發出冬蟲夏草的多種菌絲體產品。它們的藥理、毒理及成分等與天然冬蟲夏草有相似之處，但各菌種間不盡相同，且還未見反映出冬蟲夏草的全部功效。例如，″至靈膠囊″(被孢黴)主治慢性腎炎，″寧心寶″(頭孢菌)治心律失常，″金水寶″(擬青黴)用於慢性支氣管炎、高脂血症和陽萎。而且有試驗證明，中國擬青黴的毒性(LD50為準)比天然蟲草大八倍以上，其與蝙蝠蛾擬青黴在臨床試用中，都曾發生噁心、口乾、腸胃不適等現象。上述冬蟲夏草菌種經發酵形成的菌球，常易發生自溶現象和產生代謝產物，而且使濾清物帶有異味，不宜直接口服；其中如被孢黴發酵培養的菌絲體，需經多次清洗，才適於烘乾加工成產品。因此，它們的發酵醪液不能100％地得到利用。
本發明的目的是提供一種新的獲取羽束梗孢真菌的方法；本發明的另一目的是提供一種用於工業發酵生產的羽束梗孢CGMCC新槌12菌株；本發明的又一個目的是提供一種適合於CGMCC新槌12菌株進行工業化生產，並且發酵醪液100％可利用的培養基；本發明還有一個目的是提供一種採用CGMCC新槌12進行工業化生產所得發酵醪液的用途。
本發明的技術方案是用常規技術從天然黑槌蟲草中分離培養出羽束梗孢(Paraisaria)的方法，是通過取不長子座的蟲草菌核組織為接種材料，在培養基上培養獲得。
以不長子座的黑槌蟲草菌核組織為接種材料，在培養基上培養分離並選育出羽束梗孢用於工業發酵生產的優良菌株為CGMCC新槌12。
CGMCC新槌12菌株的菌落呈半球形拱起，前期蜂窩狀，後期孔窩張裂，形成絹條狀的孢梗束叢，束端平切，多層次展開如潔白的菊花，直徑達25～30毫米。
利用黑槌蟲草的羽束梗孢真菌進行工業發酵生產，其搖瓶和發酵罐的培養基配方是葡萄糖1～3％，黃豆餅粉2～3％，玉米粉1～2％，蛋白腖或蠶蛹粉0.1～0.3％，磷酸二氫鉀0.1～0.3％，硫酸鎂0.03～0.1％，消泡油適量，其餘為水。
發酵醪液100％利用，其濾清液與天然蟲草的浸出液一致，味苦而純正，氣微香，適於人們直接口服，具有廣泛的治療、滋補和保健功能。
發酵醪液的濾清液製成品和菌絲體製成品，單用一種或兩者合用，對於哮喘病的防治有顯著效果。
本發明的技術效果是1.提供了一種獲取羽束梗孢屬真菌的新方法。
2.將從黑槌蟲草分離和培養的羽束梗孢典型菌株新槌12，回接室內繁殖的健康的蝠蛾幼蟲，結果獲得了與天然蟲草相同的外生孢梗束的僵蟲體，同時排除了其他偶然分離到的雜菌，從而確定羽束梗孢為該蟲草真菌唯一的無性型。新槌12菌株的性狀優良而穩定，因此，它的人工發酵產物能夠相對完整地反映天然蟲草的功效和作用。
3.根據羽束梗孢的生理特性，經試驗本發明培養基中蛋白腖或蠶蛹粉的用量，比現有冬蟲夏草菌發酵培養的用量要低。為滿足氮素營養的需要，相應提高了黃豆餅粉的用量，並混合一定比例的玉米粉，這不僅提高了生理效應，使之適合該黑槌蟲草真菌的生長，而且它們含有豐富的營養物質，有利於發酵醪液成分的轉化，同時增添了產品的風味。
4.新槌12菌株用於發酵形成的菌球，繼續培養一個月或更長時間，也不會發生自溶現象，同時不產生有害代謝產物，因而發酵醪液100％可利用。發酵醪液能夠相對完整地反映天然蟲草的藥性。味苦而純正，菌絲體黃白色至淡棕黃色(與蟲草菌核內部組織色澤一致)，而且表現出相當或高於天然蟲草的功效。其濾清液味苦而純正(與天然蟲草浸出液一致)，氣微香，適於人們直接口服，療補範圍和功效相當或高於天然蟲草，作用比菌絲體要快，而且可配製其他飲品。因此廣泛適用於食品、飲料、美容和製藥行業。
5.本發明蟲草菌醪液對哮喘病的防治有顯著效果。據藥理研究，發酵醪液能明顯增強機體免疫功能，並能增強腎上腺皮質功能。止咳、祛痰、平喘，抗病毒，凡服用者幾乎不會患感冒。對於多種哮喘病疾患，濾清液的作用快，短期可控制症狀，菌絲體起鞏固療效的作用。長期服用濾清液或菌絲體都有效果，而兩者合用，更解決了哮喘防治中最關鍵的問題。
下面通過實例對本發明作進一步的詳細說明本發明涉及的微生物菌種，已於1997年2月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏菌種新槌12菌株，CGMCC編號0291，它的分類命名是羽束梗孢(Paraisariadubia)。
本發明是取自自然界不長子座的黑槌蟲草的新鮮菌核組織為接種材料，在培養基中培養獲得。其具體的分離過程是將採自新疆阿勒泰地區的不長子座的黑槌蟲草的新鮮菌核(體外孢梗束尚未形成)，用清水洗淨，投入0.1％的升汞溶液中浸泡5分鐘，再用無菌水清滌乾淨。然後切取內部白淨接於PDA斜面培養基上，置於25～28℃的溫箱中培養1～2周，可見長出白色或灰白色的短絨狀菌絲。經轉管移植，在10～20℃的溫度下培養，1～2個月形成圓形或橢圓形的菌落，直徑達10毫米，質地較硬，邊緣整齊。繼續培養2～4周，多數菌落為中央隆起，長出白色成叢的孢梗束，刺狀或羽毛狀，不甚整齊，高達5～8毫米。但從中發現個別的菌落最初呈半球形拱起，其前期蜂窩狀，後期孔窩張裂，形成絹條狀的孢梗束叢，束端平切，多層次展開，宛如潔白的菊花，直徑可達25～30毫米。背面色素為黃褐色-絳紅色。此時可見典型的產孢結構為瓶梗基部(約佔全長2/3)膨大為柱狀或球形，上部(約佔全長1/3)突然收縮成窄細的小梗。瓶梗從菌絲上直接生出，或生於短杆上，單生、叉狀雙生，或聚生成輪枝。分生孢子短杆狀，兩端鈍圓，透明，5～7.5×1.5～2.2微米，直或中央稍彎；其幼時為圓形膠狀體所包嵌，成熟後膠狀體自動消解。根據其產孢結構及分生孢子大小等特徵，鑑定為羽束梗孢真菌。同時，從前述菌落成半球形拱起的菌株中，進一步選出其性狀穩定，生長勢強的菌株，代號新槌12，作為進行工業化發酵生產的代表菌種。
將新槌12菌株採用人工回接直接證明的作法，接種於室內繁殖的健康的蝠蛾幼蟲，結果形成了與天然蟲草相同、外生孢梗束的僵蟲體，同時採用同樣試驗排除了其他偶然分離到的雜菌，從而確定該羽束梗孢是新疆產黑槌蟲草真菌唯一的無性型。
產於新疆阿勒泰的黑槌蟲草，其在自然界與冬蟲夏草的發生形態截然不同。該蟲草子座罕見，其無性階段羽束梗孢在產地土中一年四季都有，形成以分生孢子獨立傳代的遺傳特性。該羽束梗孢生長緩慢，生於僵蟲體外的菌絲扭結成繩束，內部形成的菌絲塊即菌核堅實，絕少中空，生於地下3～5年不腐爛。而冬蟲夏草多帶子座，以子囊孢子傳代為特徵。其在僵蟲表面是形成膜狀的菌絲組織，並與泥土粘結成一混合層。此時若不及時採收，當年六月份即漸漸變軟變空，以至腐爛解體。因此，兩者進行發酵生產的方法，產品用途和功效，都有很大不同。
經多年試驗，篩選出適合於羽束梗孢新槌12生長的液體培養基，用於搖瓶和發酵罐的生產培養。該培養基的配方是葡萄糖1～3％，黃豆餅粉2～3％，玉米粉1～2％，蛋白腖或蠶蛹粉0.1～0.3％，磷酸二氫鉀0.1～0.3％，硫酸鎂0.03～0.1％，食用油(用於消泡)適量，其餘為水。
本發明上述培養基中的蛋白腖或蠶蛹粉，比現有的冬蟲夏草發酵的用量要低。據試驗，蛋白腖或蠶蛹粉的濃度較高會對羽束梗孢的菌絲生長有抑制作用。因為蛋白腖和蠶蛹粉都是較大的肽，羽束梗孢對它們的利用受到膜運輸的限制，不能完整的進入細胞；滯留在菌體表面，影響通透性，而且會給發酵液帶來異味。為滿足氮素營養的需要，培養基中提高了黃豆餅粉的用量，混合一定比例的玉米粉，不僅提高了生理效應，適於羽束梗孢的生長，而且它們含有豐富的維生素E、不飽和脂肪酸和胡蘿蔔素，以及礦物元素硒、鐵、鈣、鎂等，有利於發酵醪液營養成份的轉化，並增添了產品的風味，氣微香，菌絲體為黃白色至棕黃色，而現有冬蟲夏草菌絲體一般為棕褐色。
新槌12菌株用於發酵培養7～10天即形成菌球(乾重得率達2.5～3.8％)，此後若繼續培養一個月或更長時間，菌球也不會發生自溶現象，發酵液保持澄清，這與該蟲草菌核在自然界3～5年不致腐爛和解體的特性一致。加之分生孢子成熟極晚(初期為膠狀體包嵌)，發酵當中也不產生有害代謝產物。因此，生產的蟲草菌醪液百分之百地可以利用。其濾清液味苦而純正(與天然蟲草浸出液一致)，氣微香，可不經提取和單另加工，適合人們直接口服。經數百人次試服，反映其功效相當或高於天然蟲草，而作用比菌絲體要快。也可用於配製其他保健飲品。因此，廣泛應用於食品、飲料、美容和製藥行業。
現有冬蟲夏草菌絲體產品對慢性支氣管炎有作用，但對多種病因可引起的哮喘未反映有特殊的療效。本發明蟲草菌醪液經藥理研究，能明顯增強機體免疫功能，並能增強腎上腺皮質功能。尤其在試用中，濾清液的平喘、止咳和祛痰作用都比菌絲體快，而且治感冒。因此，對哮喘病人，短期內常能控制症狀；菌絲體作用較慢，卻可起鞏固療效的作用。長期服用濾清液和菌絲體中的一種，都能改善患者體質，促成質變，收到治療效果。而兩者合用，更解決了哮喘防治中最關鍵的問題。許多患者治癒，多年來未見復發。
按常規技術進行工業發酵生產的工藝流程可概括為斜面菌種→一級搖瓶種子→二級搖瓶種子→一級種子罐→二級種子罐→發酵罐
下面是黑槌蟲草新槌12真菌工業發酵生產過程的實施例一.首先對菌種進行擴大培養1.製作PDA斜面培養基取馬鈴薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀3克，硫酸鎂1克，維生素B110克，瓊脂18～20克，蝙蝠蛾幼蟲浸出液適量。將馬鈴薯切片煮沸30分鐘去渣，與其他成分混合，加水到1000毫升，調節PH值至5～6，在壓力1公斤/平方釐米下滅菌30分鐘，取出後擺成斜面。
2.斜面培養方法挑取一小塊新槌12母種菌絲體，轉接在空白斜面上，於10～20℃下培養(如選取12℃、20℃進行培養)1～2個月，即可作為種子在4℃下冷藏備用。
二.搖瓶種子的培養1.製作搖瓶液體培養基培養基按表1所列的三個實施例的配方進行配製。按每批分別製作5瓶計算、稱樣。將各成分混合後，加水到規定體積，PH值自然。然後分裝到容積為1000毫升的三角瓶中，每瓶裝量不超過500毫升。在壓力1.1公斤/平方釐米下，滅菌30分鐘。此為一級搖瓶種子培養液。二級種子的培養液不改變各實施例的配方，按需配製量稱取各成分，製作方法同上。
2.搖瓶培養條件將原種菌絲體少量分別接入各實施例的一級搖瓶中，在室溫下靜止培養3～7天，再置於往復式搖床上，在23～27℃下振蕩培養，頻率80～100次/分，振幅5釐米，培養7～10天。然後按10～14％的接種量倒入二級搖瓶中，培養6～9天即可。
三.種子罐配料及工藝1.種子罐培養液的製作按前述搖瓶培養液的配方實施例，除用等量的蠶蛹粉代替蛋白腖，另添加適量食用油消泡之外，其他成份和配方不變。裝液量為罐體總容量的75％，壓力1公斤/平方釐米，滅菌30分鐘。
2.種子罐培養條件當罐內溫度降到30℃以下時，將搖瓶種子液按10％接種量接人一級種子罐中，在23～28℃下培養，氣體環流攪拌，風量1∶1(V/V/Min)，罐壓0.5～0.7公斤/平方釐米，培養時間6～8天然後按10％接種量，通過壓差打入二級種子罐中，照同樣方法繼續培養6～8天。
四.發酵罐配料及工藝1.發酵罐培養液的製作發酵罐培養液各實施例的配方及製作同種子罐。罐體裝液量為總容積的75％，壓力為1公斤/平方釐米，滅菌30分鐘。
2.發酵罐培養條件將種子罐培養的種子液，按10％接種量，通過無菌管道轉入發酵罐中。培養溫度23～28℃，氣體環流攪拌，風量1∶0.5～1(V/V/Min)，罐壓0.5～0.7公斤/平方釐米，培養時間7～10天。
3.放罐標準待發酵液變成澄清透明的淡棕黃色，菌球顆粒直徑2～3毫米，大小均勻，無雜菌，味苦而無其他異味，殘糖不超過0.5％，即可終止發酵。
經檢測，按表1培養液配方的三個實施例(每瓶從搖瓶至發酵罐不少於三批)，所得發酵醪液質量均符合規定，即濾清液味苦而純正(與天然蟲草浸出液一致)，菌絲體得率達2.5％，胞內蟲草多糖含量在5％以上，紫外分析在256nm處最大吸收峰。因而說明本發明的培養基和發酵工藝適合於黑槌蟲草真菌的生長。
五.後處理工藝1.收集濾清液將發酵好的醪液壓入儲罐中，保壓儲存不超過24小時，通過離心機或板框壓濾機收集濾清液，再經精濾澄清，然後滅菌分裝或經濃縮、冷存備用。
2.收集菌絲體將經過離心和過濾收集的溼菌絲體放入烘房氣流乾燥，烘乾溫度70～80℃，烘至含水量5％左右，粉碎包裝備用。
如果發酵罐容積達到20,000立升的規模，接種量10％抵消發酵過程中的消耗，最後裝量仍按75％計，可產醪液15,000立升。其中濾清液得率按90％計，為13,500立升；菌絲體得率按2.5％計，為375公斤。
新疆黑槌蟲草菌的發酵醪液，經自治區防疫站根據″食品衛生法″及″食品安全性毒理學評價程序″的規定，對其進行安全性試驗，結果是雕雄大小鼠LD50均大於31.6g/kg·BW，屬無毒級，無蓄積毒性；三項致突變試驗精子畸形，微核和Amess試驗均為陰性，未顯示有致突變作用。因此作為保健食品是安全的。
新疆藥物研究所對本發明蟲草菌絲體(乾粉)進行了毒理研究。其急毒性試驗，因所用菌粉配成最大濃度(33.33％)，給小鼠灌胃，常規不超過0.25ml/10g，故無法測出口服的半數致死量，而作最大耐受量試驗。結果日服量16.5g/kg，連續七日，總給藥量115.5g/kg，仍未見毒性反應。其長期毒性試驗大鼠日服劑量4g/kg，連續90天後與對照組比較，結果對大鼠生長、造血系統、肝、腎功能都無明顯影響，各重要臟器及胸腺、胰腺均未見藥物引起的組織學改變。
本發明蟲草菌醪液經新疆藥物研究所進行藥理作用的研究，結果是能明顯延長小鼠耐缺氧時間，並能提高負重小鼠的運動耐力。能減少小鼠自發活動，說明對中樞神經有鎮靜作用。可使小鼠胸腺減輕，大小鼠脾臟增重，提高小鼠吞噬指數，對用氧化可的松處理小鼠，能提高其溶血素水平，說明對機體非特異性免疫功能和體液免疫功能有增強作用。能提高血紅蛋白含量，說明有補血作用；並能明顯降低大鼠血清膽固醇的含量。能使大小鼠睪丸明顯增重，並能使腎上腺和子宮增重，說明其有壯陽作用。能使呼吸道酚紅分泌量增加，說明有祛痰作用。
本發明蟲草菌粉和天然黑槌蟲草經氣相色譜分析比較，兩者所含化學成分相同。經測定，蟲草菌絲體中17種胺基酸的含量為17.9％，腺苷含量為0.059％，D-甘露醇含量為10.11％，蟲草胞內多糖含量為5.3～5.7％。此外，含有維生素B1、B2、C、E和鋅、硒、鐵、鈣、磷等十多種無機元素。其中，維生素E(33.08mg/100g)、鋅(60PPM)、硒(3PPM)和D-甘露醇等的含量，經比較高於冬蟲夏草菌絲體，其他成分也都相當或略高於後者。此外，這兩種蟲草對茚三酮試驗的反應不一致，前者為紫色，後者為藍紫色，說明二者所含蛋白質的性質並不完全相同。有資料表明蟲草多糖能提高機體免疫功能，調節細胞生長，增強人體對肝炎、流感等病毒的抵抗力。腺苷能有力的清除致人衰老的羥自由基。甘露醇類物質有擴張心、腦血管的作用。人體代謝中有80多種酶的活性與鋅有關，缺鋅可使抵抗力下降。硒能抑制或抵消誘癌因素，缺硒與腫瘤發生有關。維生素E為抗不育因子，對改善微循環，防止動脈硬化和減緩衰老等都有作用。重要的是，上述成分在本發明的發酵濾清液中都或多或少地存在，很多是作為可溶性物質或特殊游離態分散於其中。如胞外蟲草多糖含量為0.8～1.0mg/ml，17種胺基酸含量為1.64mg/ml，維生素E含量0.26mg/100ml，B1含量3.06mg/100ml。
本發明蟲草菌絲體乾粉(裝入膠囊)和濾清液(經濃縮製成口服液)，經新疆藥品檢驗所按照衛生部″藥品衛生檢驗方法″等進行全檢，結果各項指標均符合規定。
本發明產品蟲草菌粉(裝入膠囊)和濾清液(直接口服)，通過民間小範圍(數百人份)的服用，反饋的情況表明兩者單用對神疲乏力、頭暈目眩、耳鳴失眠、畏寒盜汗、心悸氣短、久咳略血、慢性支氣管炎、哮喘、肺氣腫、頻發性感冒、頑固性高血壓、高血脂、冠心病、腦血栓、心律失常、陽萎早洩、腰膝酸軟、兩腿浮腫、便秘、老人斑、夜尿頻多、慢性腎炎、更年期綜合症等，都收到過很好的治療效果。克拉瑪依市總醫院選擇B肝病人作臨床驗證，結果表明對B肝有明顯療效。對於其中許多病例(如哮喘、感冒、高血壓、陽萎早洩等)，濾清液表現的作用比菌絲體要快。兩者合用，效果尤佳。比之同類冬蟲夏草菌絲體產品，本發明產品對哮喘病的防治尤其有特殊作用。
下面所錄三個典型病例，都是患哮喘十餘年，或從小就患哮喘，多方求醫，效果不佳，反覆發作。例一李某，女，70歲，在過去五六年裡，因哮喘不能出門。僅服用濾清液兩周，即感覺胸部輕鬆，咳喘明顯減輕，能外出。繼續服用兩個月，至今近一年未發作。例二蔡吉連，男，五十歲，林場工人，對花粉、棉布等十二種物質過敏，咳嗽，氣短，夜間不能平臥，每當秋季需住院急救，完全喪失勞動能力。自服用蟲草菌粉20多天後，哮喘減輕，腿部消腫，可參加勞動。繼續服用菌粉四個月後，症狀完全消失，現已康復。例三萬長林，男，64歲，運輸公司退休職工。哮喘病越來越重，96年因胸部淤痰，咳嗽，送到醫院急救時，兩個管子都輸不進氧。偶知本發明產品，其子來要，用濾清液和蟲草菌粉(膠囊)合用，竟有意想不到的效果，十天便出院。醫生和病人十分驚詫。繼服兩個月未再發病，連手上的老年斑也消失了。從上述實例說明，本發明的確對哮喘病的防治有特殊效果。表1搖瓶液體培養基的實施例配方(按重量百分比計)
權利要求
1.一種用常規技術從天然黑槌蟲草中分離和培養出羽束梗孢屬(Paraisaria)真菌的方法，其特徵在於以不長子座的蟲草菌核組織為接種材料，在培養基上培養獲得。
2.一種根據權利要求1所述方法培養的羽束梗孢真菌，其特徵在於用於工業化生產的優良菌株為CGMCC新槌12。
3.如權利要求2所述的羽束梗孢屬真菌，其特徵在於新槌12菌株的菌落呈半球形拱起，前期蜂窩狀，後期孔窩張裂，形成絹條狀的孢梗束叢，束端平切，多層次展開，直徑達25～30毫米。
4.一種用權利要求2或3所述的羽束梗孢屬真菌按常規技術進行工業發酵生產的方法，其特徵在於液體培養基的配方是葡萄糖1～3％，黃豆餅粉2～3％，玉米粉1～2％，蛋白腖或蠶蛹粉0.1～0.3％，磷酸二氫鉀0.1～0.3％，硫酸鎂0.03～0.1％，消泡油適量，其餘為水。
5.一種用權利要求4所述的工業發酵方法生產的黑槌蟲草菌醪液，其特徵在於該醪液100％可利用，其濾清液與天然蟲草的浸出液一樣，味苦、氣微香，可直接口服，用於治療、滋補和保健。
6.一種如權利要求5所述的黑槌蟲草菌醪液，其特徵在於該醪液的濾清液製成品和菌絲體製成品可用於防治哮喘病。
全文摘要
本發明公開了從黑槌蟲草菌核組織中分離和培養羽束梗孢(Paraisaria)新槌12菌株的方法,及進行工業發酵生產的方法和用途。篩選出適合於該黑槌蟲草真菌生長的培養基,所得發酵醪液百分之百可利用,其濾清液味苦而純正,適合人們直接口服。本發明產品的化學成分和藥理作用等,與天然蟲草基本相同。濾清液單服或與菌絲體合用,可防治多種疾病,尤其對哮喘病的防治有顯著效果。
文檔編號C12N1/14GK1201828SQ9710446
公開日1998年12月16日 申請日期1997年6月9日 優先權日1997年6月9日
發明者趙恆 , 艾秀蓮, 屈新蘭, 常煒 申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所