豬sncg基因的一個可用於溯源的snp分子標記及其檢測方法

2023-04-27 04:08:41

豬sncg基因的一個可用於溯源的snp分子標記及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記及其檢測方法。所述的SNP分子標記是通過DNA池（pool）測序獲得的，共1599bp，其包含部分第三內含子序列，第984位鹼基處有一個鹼基突變984C-984T，其序列如SEQ?ID?NO?1所示。在包括11個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發現該分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，並且雜合度都大於0.3，初步判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源。
【專利說明】豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬食品安全領域，涉及一種豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]隨著生活水平和保健意識的提高，人們越來越注重食品安全問題。豬肉製品作為人膳食中重要的蛋白質來源，如何確保其安全衛生，保障消費者的身體健康和生命安全已成為全球性的熱點問題。世界各國政府紛紛採取一系列的技術措施來強化對肉產品的安全管理，以期最大程度上減少食品安全事件的發生。我國各大城市也紛紛建立了肉產品的追溯系統，通過肉製品的溯源管理，能夠為消費者提供準確而詳細的有關產品的信息，有利於生產經營者及時發現各環節中存在的不安全隱患，為消費者提供一個獲取有效可靠信息的途徑。更為重要的是，大大加強了政府部門對肉質品質量安全的監管，為國家迅速建立食品安全風險的應對機制提供有效信息，將有助於社會的安定。
[0003]但是我國肉產品追溯系統所採用的標籤技術存在標籤丟失、記錄出差、標記圖案模糊不清以及標籤容易人為改換等缺點；而國外發達國家所採用的DNA溯源技術是基於個體DNA指紋圖譜的生物學技術，有著絕對的不可更改性和唯一性，不受人為因素影響。而且因為DNA溯源技術容易分型、重複性好、檢測手段簡單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認為最具發展潛力和應用價值的快速溯源技術。
[0004]DNA溯源技術的產生源於DNA的遺傳與變異，用於構建個體DNA指紋圖譜的分子標記有AFLP標記(擴增片段長度多態性)、SSR標記(微衛星標記)和SNP標記(單核苷酸多態性)。
[0005]AFLP標記具有高度可靠性和操作簡便性，但卻同時存在著對模板反應表現遲鈍、譜帶可能發生錯配與缺失、成本相對比較高等缺點。相比SNP標記，微衛星標記的等位基因眾多，多態豐富，但也正因如此，使得SSR標記的帶型複雜，給DNA指紋識別自動化和規模化帶來困難。SNP標記是第三代分子遺傳標記，是指基因組同一位點上單個核苷酸的變異，一般表現為二等位基因，非常適宜高通量自動化分析，所以日益成為動物身份識別最受關注的分子標記。
[0006]但是用於肉產品溯源的SNP標記不同於一般的SNP標記，對於單個的SNP標記，它必須至少具有以下特徵:(1)變異度高，在品種或品系中等位基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布頻率差異小；(3)雜合度大於等於0.3。
[0007]在長期的育種工作中，研究者積累了大量的SNP標記，但是這些SNP標記往往集中分布在某些染色體上，如1號染色體，12號染色體等，而另外部分染色體，如5號，8號，14號，18號染色體等則缺乏SNP標記，因此為了滿足對豬肉產品進行DNA溯源的要求，我們進行新SNP標記的研究工作。
[0008]豬SNCG基因位於豬的18號染色體上， 該基因在豬中研究甚少。人的SNCG基因稱為、突觸核蛋白基因(Y-synuclein，SNCG)，近年來研究發現的乳腺癌特異性基因1(Breast Cancer Specific Gene 1,BCSG1)被證實與\突觸核蛋白是同一蛋白，其與乳腺癌和卵巢癌密切相關，在多數進展期的乳腺癌和卵巢癌中特異性的高表達，而與其他腫瘤的關係報導相對較少。SNCG基因是新的人類多種癌症廣譜性生物標記，該論文在世界癌症研究著名雜誌《美國癌症研究雜誌》和《國際腫瘤學雜誌》上刊登。

【發明內容】

[0009]本發明所要解決的技術問題在於提供一種豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記及其檢測方法，該SNP分子標記在商品豬培育中，可以廣泛用於豬肉產品DNA溯源及其檢測，特別是用於豬肉產品的安全性溯源。
[0010]為實現上述目的，本發明採用以下技術方案來實現。
[0011]所述的豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記，共1599bp，包含部分第三內含子序列，且第984位鹼基處有一個鹼基突變984C — 984T，其DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
[0012]所述的SNP分子標記是通過DNA池(pool)測序獲得的，並在包括10個豬品種或品系的試驗群體(共計235個個體)中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發現該分子標記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，初步判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源。
[0013]所述的豬SNCG基因中一個可用於溯源的SNP分子標記的檢測方法，採用PCR-Bpull021-RFLP方法進行，包括以下步驟:
[0014](1)構建豬的 DNA 池(pool);
[0015](2)設計正、反向引物分離S`NCG基因的DNA片段，測序並分析；
[0016](3)PCR-Bpull02I_RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測；
[0017](4)採集10個品種和品系的耳組織樣，共計235個個體；
[0018](5)檢測SNP分子標記在試驗群體的分布，統計分析，並進一步試驗驗證是否適用於豬肉產品溯源中。
[0019]其中，上述檢測方法中，所述的分離SNCG基因的DNA片段的正、反向引物序列如下:
[0020]正向引物:5,-TTTGT GATGG TGCTC TGCGT TT-3' (SEQ ID No 2)
[0021]反向引物:5,-CCCTG CCTGA AGGTG GTTGT-3' (SEQ ID No 3)
[0022]本發明通過DNA池檢測到豬SNCG基因中存在的SNP分子標記，在包括10個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發現該分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，並且雜合度都大於0.3，初步判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源以及豬肉產品的安全性溯源中。
[0023]由於單個SNP溯源標記是無法完成溯源的，因此在溯源模擬試驗中，將本發明獲得的SNCG基因的新SNP分子標記位點與其它現有已公開的SNP分子標記位點結合在一起(共計12個SNP位點)進行溯源實驗。在屠宰場隨機挑選100個個體，檢測每個個體12個SNP位點的基因型，統計每個個體的基因型結果，發現100個個體均擁有各自不通的基因型，能實現個體區分；同時，隨機在這100個個體中挑取20份肌肉樣，同樣檢測統計12個SNP分子標記位點的基因型，然後跟100個個體的基因型進行比對分析，發現均能找到與20份肌肉樣品基因型完全一致的個體，即通過溯源在100個個體中找到20份豬肌肉的來源個體，因此判定本發明的該SNP分子標記可以用於豬肉產品溯源。
【具體實施方式】
[0024]以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。
[0025]實施例1分子標記的查找
[0026](1) DNA 池(pool)的構建
[0027]分別隨機採集杜洛克豬、梅山豬個體各2頭(不分性別)的耳組織，提取DNA後，等量吸取4個個體的DNA放入同一離心管中，混勻待用。
[0028](2)引物設計
[0029]以豬SNCG基因的DNA序列(Genbank:EF104639)為模板，設計引物分離豬SNCG基因(以一頭杜洛克豬的DNA為PCR擴增的模板)，引物如下:
[0030]正向引物:5,-TTTGTGATGGTGCTCTGCGTTT-3' (SEQ ID No 2)
[0031]反向引物:5,-CCCTGCCTGAAGGTGGTTGT-3' (SEQ ID No 3)
[0032]PCR 反應總體積為 20 μ 1，其中豬 SNCG基因組DNA 約 lOOng，含 1 Xbuffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP (上海生工生物公司)終濃度為150 μ mol/L，引物終濃度為
0.2 μ mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。
[0033]PCR 擴增:94°C 4min,(94°C 30s，62°C退火 40s，72°C 40s)循環 30 次，最後 72°C延伸 lOmin。
[0034]PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0035](3)克隆測序分析
[0036]將得到的豬SNCG基因PCR產物按照如下方法進行克隆。
[0037]PCR產物的純化:在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，用PCR產物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)純化。
[0038]連接反應:將純化的PCR產物與pMD18-T載體(大連寶生物公司)連接，連接反應總體積是10μ 1，其中包括5μ 1 solution I (大連寶生物公司)，0.5 μ 1的T載體(大連寶生物公司)，2.5μ 1的純化PCR產物，最後加入2μ 1滅菌水置4°C水浴過夜。
[0039]轉化:無菌狀態下取100-120 μ 1感受態細胞(天根生化科技有限公司)於1.5mlEpendorff管中，將5μ 1的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出後冰浴3_4min，加入400 μ 1無抗生素的LB液體培養基，37°C平放lh後倒置培養。
[0040]菌落PCR鑑定:經菌落PCR鑑定後的菌株在LB培養基37°C培養過夜，隨即挑取多個克隆子送到上海生工生物有限公司測序。
[0041]經測試，該經拼接後的豬SNCG基因的DNA序列共1599bp，包含部分第三內含子序列，序列如SEQ ID No 1所示。經分析發現其第984鹼基處存在一個鹼基突變984C —984T。通過分子生物學軟體分析，發現該第984鹼基處的鹼基突變導致Bpull021-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,即 Bpull02I_RFLP 位點)多態性。[0042](4) PCR-Bpull021-RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測
[0043]酶切反應總體積10 μ 1，其中IXbuffer 10 μ 1，PCR產物3-5 μ 1，限制性內切酶Bpull02I 為 0.5μ 1 (5U)，用 Η2。補足 10 μ 1，37°C 水浴 4h，稱取 0.6g 瓊脂糖溶於 15.75mlDEPC (上海生工生物公司)處理水中，稍冷卻(60°C)，加入5ml的5X甲醛凝膠電泳緩衝液和4.25ml的37%甲醛溶液，混勻制膠，電泳後檢測酶切結果。結果發現:SEQ ID No 1序列中C等位基因只有1599bp —個片段，T等位基因有985bp和6146bp兩個片段，這兩個等位基因可組成三種基因型，CC，CT，TT。且在該SEQ ID No 1序列的第984位鹼基發生突變，C — T。
[0044]實施例2等位基因的分布情況
[0045]( 1)試驗群體的設計
[0046]試驗組:採集皮特蘭(21頭)、申農(17頭)、大白(43頭)、大申(52頭)、長申(16頭)、杜申(23頭)、皮大申(11頭)、長大申(25頭)、杜大申(7頭)和杜皮大申(20頭)個體的耳組織，提取DNA，共計235個DNA樣本。
[0047]試驗群體的目的在於檢測SNP標記在不同品種中的分布情況。
[0048](2)基因檢測
[0049]正向引物:5,-TTTGTGATGGTGCTCTGCGTTT-3' (SEQ ID No 2)
[0050]反向引物:5,-CCCTGCCTGAAGGTGGTTGT-3' (SEQ ID No 3)
[0051]進行擴增(條件如實施例1)，用相同的PCR-Bpull021-RFLP方法檢測試驗群體所有的個體基因型。
[0052](3)統計分析
[0053]記錄所有個體的基因型，並計算等位基因頻率和雜合度，結果如下表1。
[0054]表1
[0055]
【權利要求】
1.一種豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記，是通過DNA池測序獲得的，共1599bp，包含部分第三內含子序列，第984位鹼基處有一個鹼基突變984C — 984T。
2.根據權利要求1所述的SNP分子標記，其DNA序列如SEQID NO 1所示。
3.權利要求1或2所述的豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記的檢測方法，其特徵在於，採用PCR-Bpull021-RFLP方法進行，包括以下步驟: (1)構建豬的DNA池； (2)設計正、反引物分離豬SNCG基因的DNA片段，測序並分析； (3)PCR-Bpull021-RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測； (4)採集豬的10個品種或品系的耳組織樣，共計235個個體； (5)檢測SNP分子標記在試驗群體的分布，統計分析，並進一步試驗驗證是否適用於豬肉產品溯源。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於，分離豬SNCG基因的DNA片段的正、反向引物的序列分別如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.權利要求1或2所述的豬SNCG基因的一個可用於溯源的SNP分子標記在豬肉產品DNA溯源中的 應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589716SQ201210296711
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月17日 優先權日:2012年8月17日
【發明者】吳瀟, 唐雪明, 楊世方, 趙凱, 王金斌, 劉華, 蔣瑋, 何建華 申請人:上海市農業科學院