高特異性聚合酶鏈式反應技術鑑別中藥材烏梢蛇真偽的方法
2023-04-27 23:19:36
專利名稱：高特異性聚合酶鏈式反應技術鑑別中藥材烏梢蛇真偽的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用DNA分子遺傳標記技術鑑別中藥材烏梢蛇(Zaocys dhumnades)真偽的方法。
背景技術：
經過市場調研及有關專家確認可作為中藥材烏梢蛇的偽品有滑鼠蛇(Ptyas mucosus)黑眉錦蛇(Elaphe taeniura cope)紅點錦蛇(Elaphe refuodorsata)王錦蛇(Elapherefuodorsata)赤鏈華遊蛇(Sinonatrix annula.ris)玉斑錦蛇(Elaphe mandarinus)赤鏈蛇(Dinodon rufozona tum)灰鼠蛇(Ptyas korros)眼鏡蛇(Na ja na ja)三索錦蛇(Elapheradiata)。目前的現有技術中，藥典主要採用性狀鑑別表面黑褐色或綠黑色，密度菱形鱗片背鱗行數成雙，背中央2-4行鱗片強烈起稜，形成兩條縱貫全體的黑線。頭盤在中間，扁圓形，眼大而下凹陷，有光澤。上唇鱗8枚，第4、5枚入眶，頰鱗1枚，眼前下鱗1枚，較小，眼後鱗2枚。脊部高聳成屋脊狀。腹部剖開邊緣向內捲曲，脊肌肉厚，黃白色或淡棕色，可見排列整齊的肋骨。尾部漸細而長，尾下鱗雙行。剝皮者僅留頭尾之皮鱗，中段較光滑。氣腥，味淡。依其外部形態、骨骼和鱗片的特徵進行性狀鑑別，具有一定的主觀性，另外，如果外形不完整、有損傷就很難鑑別，同時也要求鑑別者具備相當豐富的鑑別經驗。僅根據形態特徵來進行鑑別已經不能滿足市場的需求。王義權1999年在《藥學學報》曾報導用DNA分子遺傳標記測序鑑別技術分析烏梢蛇DNA片段的核苷酸序列，已成功地鑑別出烏梢蛇的真偽，但因對DNA進行測序成本較高，操作有一定的難度，所以在藥材鑑別中的適用性較差。
發明內容
本發明的任務是設計了一對用於鑑定中藥材烏梢蛇的高度特異性引物HWL-1和HWH-1。建立簡便準確易於操作的鑑別中藥材烏梢蛇真偽的DNA分子遺傳標記方法。
本發明首先提取烏梢蛇正品及上述10種非正品(紅點錦蛇、玉斑錦蛇、三索錦蛇、灰鼠蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇、赤鏈蛇、赤鏈華遊蛇、眼鏡蛇、滑鼠蛇)的DNA，用12S rRNA通用引物(H1478和L1091)PCR反應擴增出12S rRNA的片段，測序，由於12S rRNA片段中含有種內非常保守，種間差異大的序列片段，根據此片段設計了能鑑別烏梢蛇正品的高特異性引物HWH-1(5』-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3』)和HWL-1(5』-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3』)。其方法是模板DNA的提取選取無黴變和蟲蛀的藥材標本肌肉部分約1g，置於研缽中經液氮速凍後研成粉末，將粉末速轉移至50ml離心管中，加入6ml已滅菌的勻漿緩衝液(蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mmol/L PH＝8.0，Na2EDTA1mmol/L PH＝8.0)進行混勻，加入蛋白酶K至終濃度為150μg/ml，再加入10％SDS至終濃度為0.8％。55℃水浴中3-4h，其間輕搖數次，取出冰浴至4℃，400g離心5min，取上清液，加入等體積Tris飽和酚抽提，混勻10min，兩相成乳狀，5000g離心15min，取上層水相，重複一次，再用CHCl3抽提兩次.CHCl3抽提離心後取上層水相加入兩倍無水乙醇沉澱DNA，-20℃冰箱中過夜.第二天取出，5500g離心15min，沉澱物用70％EtOH洗滌兩次，室溫揮幹EtOH，用適量TE溶解DNA，-20℃備用。PCR擴增PCR反應體系30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/lKCl，0.1％Triton X-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/ldNTPs，兩種高度特異性鑑別引物HWL-1和HWH-1各10pmol/l，DNA模板約100ng，反應在(PTC-100)基因擴增儀上進行擴增；PCR反應條件循環參數95℃預變性4min；95℃變性40S，65℃退火1min，72℃延伸30S；10個循環；95℃變性40S，60℃退火1min，72℃延伸30S；15個循環；72℃延伸5min。電泳檢測PCR實驗中設置無模板DNA的陰性對照，反應完成後，取5μl反應液經EB染色，1.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像觀察，在310bp-320bp範圍內處擴增出明亮唯一條帶的樣品即為正品烏梢蛇，混淆品均應無任何條帶出現。本方法操作簡單、易於掌握、準確性高。
圖1為烏梢蛇及混淆品12srRNA片段擴增(陽性對照)圖2為烏梢蛇高特異性PCR鑑別樣品編號1烏梢蛇 2滑鼠蛇 3黑眉錦蛇 4紅點錦蛇 5王錦蛇 6赤鏈華遊蛇7玉斑錦蛇 8赤鏈蛇 9灰鼠蛇 10眼鏡蛇 11三索錦蛇 12陰性對照MDNAladder(100bp)最亮的條帶為500bp，向下依次為400bp、300bp、200bp具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明1.材料和方法1.1實驗材料實驗用中藥材烏梢蛇及其混淆品11種共23件標本見表1表1Tab1 Number and source of original of 11 species
1.2實驗儀器臺式高速離心機(Eppendorf公司)、PTC-100基因擴增儀、電泳儀、紫外凝膠成像分析儀。
1.3方法模板DNA的提取 選取無黴變和蟲蛀的藥材標本肌肉部分約1g，置於研缽中經液氮速凍後研成粉末，將粉末速轉移至50ml離心管中，加入6ml已滅菌的勻漿緩衝液(蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mmol/L PH＝8.0，Na2EDTA 1mmol/L PH＝8.0)進行混勻，加入蛋白酶K至終濃度為150μg/ml，再加入10％SDS至終濃度為0.8％。55℃水浴中3-4h，其間輕搖數次，取出冰浴至4℃，400g離心5min，取上清液，加入等體積Tris飽和酚抽提，混勻10min，兩相成乳狀，5000g離心15min，取上層水相，重複一次，再用CHCl3抽提兩次.CHCl3抽提離心後取上層水相加入兩倍無水乙醇沉澱DNA，-20℃冰箱中過夜。第二天取出，5500g離心15min，沉澱物用70％EtOH洗滌兩次，室溫揮幹EtOH，用適量TE溶解DNA，-20℃備用。
2.PCR引物及反應條件PCR反應體系30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/l KCl，0.1％Triton X-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/ldNTPs，兩種高度特異性鑑別引物(HWL-1和HWH-1)各10pmol/l，DNA模板約100ng，反應在(PTC-100)基因擴增儀上進行擴增.
循環參數95℃預變性4min；95℃變性40S，65℃退火1min，72℃延伸30S；10個循環；95℃變性40S，60℃退火1min，72℃延伸30S；15個循環；72℃延伸5min。PCR實驗中設置無模板DNA的陰性對照，反應完成取5μl反應液經EB染色，1.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像觀察。
3結果在約320bp處擴增出明亮唯一條帶的樣品即為正品烏梢蛇。混淆品均應無任何條帶出現。用12srRNA通用引物(L1091和H1478)進行擴增的陽性對照，均應在約430bp處出現明亮的單一擴增條帶。
權利要求
1.一種高特異性聚合酶鏈式反應(PCR)技術鑑別真偽烏梢蛇的方法，其特徵在於DNA模板提取、PCR擴增、電泳檢測三個步驟。模板DNA的提取選取無黴變和蟲蛀的藥材標本肌肉部分1g，置於研缽中經液氮速凍後研成粉末，將粉末速轉移至50ml離心管中，加入6ml已滅菌的勻漿緩衝液(蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mmol/L PH＝8.0，Na2EDTA 1mmol/L PH＝8.0)進行混勻，加入蛋白酶K至終濃度為150μg/ml，再加入10％SDS至終濃度為0.8％。55℃水浴中3-4h，其間輕搖數次，取出冰浴至4℃，400g離心5min，取上清液，加入等體積Tris飽和酚抽提，混勻10min，兩相成乳狀，5000g離心15min，取上層水相，重複一次，再用CHCl3抽提兩次。CHCl3抽提離心後取上層水相加入兩倍無水乙醇沉澱DNA，-20℃冰箱中過夜。第二天取出，5500g離心15min，沉澱物用70％EtOH洗滌兩次，室溫揮幹EtOH，用適量TE溶解DNA，-20℃備用PCR擴增PCR反應體系30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/l KCl，0.1％TritonX-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/ldNTPs，兩種高度特異性鑑別引物HWL-1即5』-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3』和HWH-1即5』-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3』，各10pmol/l，DNA模板約100ng，反應在(PTC-100)基因擴增儀上進行擴增；循環參數95℃預變性4min；95℃變性40S，65℃退火1min，72℃延伸30S；10個循環；95℃變性40S，60℃退火1min，72℃延伸30S；15個循環；72℃延伸5min。電泳檢測PCR實驗中設置無模板DNA的陰性對照，反應完成後，取5μl反應液經EB染色，1.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像觀察，在310bp-320bp範圍內處擴增出明亮唯一條帶的樣品即為正品烏梢蛇，混淆品均應無任何條帶出現。
全文摘要
本發明是利用DNA分子遺傳標記技術鑑別中藥材烏梢蛇真偽的方法。設計了一對高特異性鑑別引物，通過高特異性聚合酶鏈式反應(PCR)技術鑑別中藥材烏梢蛇與市場上常見的偽品滑鼠蛇、黑眉錦蛇、紅點錦蛇、王錦蛇、赤鏈華遊蛇、玉斑錦蛇、赤鏈蛇、灰鼠蛇、眼鏡蛇、三索錦蛇。使用此方法鑑別烏梢蛇的真偽，只通過簡單的烏梢蛇及其偽品的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測三步即可完成對藥材真偽的鑑別。操作簡單、易於掌握、準確性高。
文檔編號C12Q1/68GK1560272SQ20041000637
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月1日 優先權日2004年3月1日
發明者黃璐琦, 馮成強, 唐曉晶 申請人:中國中醫研究院中藥研究所