確定流體凝結時間的微流體裝置和方法

2023-04-27 07:12:11 2

專利名稱：確定流體凝結時間的微流體裝置和方法
技術領域：
本發明涉及用於測定流體介質凝結時間、特別是用於測定血液凝結時間的晶片實 驗室型(lab-on-a-chip)裝置和方法。它還涉及與本發明的晶片實驗室聯合使用的測量裝 置，例如凝度計。
背景技術：
健康個體中，血液粘度和稠度由稱為止血的過程所調節。這種機制阻止從血管系 統失血。血液凝固由終止體內發生的任何出血的複雜過程所調節。穩定的凝塊通過凝血蛋 白因子、血管和血小板的相互作用形成。該過程在癒合後繼續，這時血液凝塊被溶解。在凝塊形成的第一階段，血小板聚集，同時激活了稱為血液級聯的現象。這個過程 中，可溶性血漿蛋白纖維蛋白原轉化為不溶性血纖維蛋白網或血凝塊。這種轉化由凝血酶 催化，該酶通常以其非活性形式即凝血酶原存在於血液中。血液病症起因於止血失衡。這些可以是遺傳來源的，例如血友病或Von Willebrand病；由其它狀況如抗磷脂抗體症候群、腸易激症候群或癌症所觸發；或通過外 源因素獲得患者口服抗凝劑治療或預防血栓形成病症、心臟或血管疾病。諸如華法林的口服抗凝療法被廣泛使用，並且由於其窄治療指數而需要頻繁監 測。應定期調整劑量，以避免血栓形成或出血風險。對於這些以及具有諸如不活動、肥胖、幹預(mediation)、或經歷手術或牙科治療 的已知誘因狀態的其他患者而言，使他們能在家中定期地監測血凝的可靠檢測的可用性代 表了對目前可利用的臨床凝血檢測的方便、快捷和廉價的替代手段。這類檢測也可以用作 止血病症診斷中的初步輔助手段。世界上最常用的凝結分析為所謂的國際標準化比率(INR)。該比率通過凝血酶原 時間(PT)計算，凝血酶原時間為從凝血劑激活化到凝血開始所經過的時間。激活劑為組織 因子或促凝血酶原激酶，這種機制稱為「外源性」途徑。由於組織因子(其為生物學上獲得 的產品)不同批次和製造商的差異，因而想出用INR使結果標準化。INR為以國際敏感度指 數(ISI)值(針對所用的對照樣品)為冪的患者凝血酶原時間與至少20健康正常人的平 均凝血酶原時間(MNPT)的比率。每一製造商都給出用於任何商品化的組織因子的ISI，表 明與國際標準化樣品相比的具體批次組織因子情況。還有另一種但較不經常使用的分析類型，其由經由「內源性」途徑的類似凝血機制 構成，稱為活化部分凝血酶原時間(APTT)。這兩種分析在本申請中都看作是凝結時間。在歐洲，這些分析傳統上在實驗室內進行，其中通常在確定PT之前需要製備血液 樣品。最近幾年，出現了護士或醫師直接使用或患者自主使用POint-Of-Care(P0C)裝置或 也稱為Nearly-Patient-Testing (NPT)的裝置的趨勢，並在很大程度上替代了傳統方法。最初開發的且在本領域中已知的方法需要通過靜脈穿刺提取大體積或精確體積 的血液，隨後在進行檢測之前處理血液以及需要專業人員實施該方法並分析結果。相反， 也稱為便攜凝度計的Point-of-care凝度計需要通過手指穿刺獲取全血血滴，並快速提供INR結果。專利申請W0 92/21028描述了基於鐵磁性的檢測方法。該裝置包括凝結室和對照 室，每一個都配備了攪拌葉片，它們在振動磁場中旋轉。隨著凝血開始並對葉片移動施加阻 力，凝血室中葉片的旋轉變慢。凝血時間測定為小室中攪拌葉片的相對移動有變化的時間。其它裝置，例如美國專利US 5，110，727中的那些，包含在其中分散了金屬顆粒的 血液樣品。當施加振蕩磁場時，誘導顆粒前後運動，其隨著血液凝結而減慢。速度的降低與 血液樣品粘度的增加或凝結開始相關。專利申請W0 00/06761和WO 02/48707A2都描述了配備有與靜止血液樣品接觸的 電極的裝置，並分別測量血液粘度增加時的電導率和電流變化。WO 2004/059316A1描述了用於確定血液凝結時間的低成本、一次性裝置。該裝置 配備了至少部分地與流體接觸的微傳感器並測量血液凝結和流動停止時通道中血液的阻 抗和電容。但是，與這些裝置相關的高生產成本限制了它們作為一次性部件的應用。因此，仍亟需用於P0C和/或NPT凝結時間確定的精確、低成本的一次性晶片和檢 測方法。由於材料科學以及電子和光學方法的進步，已有更小體積檢測方面的進展，僅需 要更少的和不可測量的全血樣品(微升級別)。專利申請WO 2007/025559A1公開了用於確定血漿或全血樣品中凝結的多層裝 置，其包括一個或多個檢測區域，它們都具有至少一種凝結刺激試劑。專利申請US2007/0122849A1公開了微流體晶片中用於定量分析和檢測分析物的 樣品測定結構。EP 0394070B1描述了單毛細管通道的微流體裝置，其優化了對體積為40 y L且停 留時間為200s的全血樣品中的APTT的確定。該裝置將用於活化部分凝血活酶時間測量的 活化劑的混合物和磷脂混合物用作試劑。通過毛細管道採用的該檢測方法為視覺的或光學 的，例如LED，並在血流沿該裝置停止時確定APTT。US 6，900，021描述了微流體裝置，其在體外進行該反應和各種化合物對細胞的影 響的研究。採用泵、壓力差或電場來控制流體流動，而不是通過微流體通道中的毛細管作 用。有兩個相交叉並與主流路匯合的輸入流路，以使得反應能發生。因此，主流路不包括含 試劑的區域。另外，試劑不存在於晶片中，而是在不同點和時間加入，這使得晶片能用於具 有不同試劑的不同反應測定。儘管有這些進展，但是當前使用的point of care凝度計仍具有重大缺陷-儘管所使用的晶片或測試條的大多數為一次性的，但是它們包括幾種組件，例如 收集血液樣品的器件、測量電導率變化的器件或測量粘度變化的器件。諸如電化學觸體或 檢測條中振蕩顆粒的有源組件的存在使得一次性晶片的生產複雜且昂貴。另外，不能在不 損害檢測條質量情況下減小尺寸。-儘管在檢測所需的血液樣品的量方面有所進展，但是最佳情況下體積仍在 10yl的範圍，這對於患者仍是不方便的。相比而言這不夠理想，例如與用於諸如葡萄糖測 量的其它檢測的量相比，葡萄糖測量可用lPl或更少的血液樣品來精確地完成。-與已知檢測條或晶片一起使用的檢測和測量儀器仍相當複雜。在一些情況下，它
6們需要其它的器件來傳送或移動血液樣品，例如磁場或泵。另一些情況下，該裝置需要幾個 檢測器件需要校準晶片的測量樣品中的某些性能變化的電化學或磁性器件，以及其它的 檢測器件來閱讀其它的板上(on-board)質量控制系統。這增加了複雜性並由此增加了便 攜裝置的成本。鑑於這些缺陷，本發明的目的是提供用於確定諸如血液或血漿的流體介質中凝結 時間的微流體裝置和方法，其僅涉及最少的步驟，成本低，並由此可由患者自主使用。本發 明的另一目的是提供與該微流體裝置一起使用的測量裝置如凝度計，以便檢測和監測樣品 的凝結時間以及存在於微流體裝置中的質量控制，其易於製造、緊湊且可由患者自主使用。
發明概述 在第一方面，根據獨立權利要求1，本發明提供了用於確定諸如血液或血漿的流體 介質中凝結時間的低成本微流體裝置。在第二方面，根據獨立權利要求19，本發明提供了凝度計裝置，其包括用於引入微 流體裝置的槽，檢測和/或監測流體介質的至少一種性能的器件以及用於處理所述檢測和 /或監測裝置傳送的數據以確定所述流體的凝結時間的器件。在第三方面，根據獨立權利要求25，本發明提供了用於確定流體介質中凝結時間 的方法。在其它方面，根據獨立權利要求26，本發明提供了製造用於確定流體介質中凝結 時間的微流體裝置的方法。在從屬權利要求中定義了本發明的有利實施方案。這樣，本發明提供了用於確定流體的凝結時間的低生產成本和易於使用的改進微 流體無源裝置(passive device)，其因此可為一次性的。另外，本發明的微流體裝置(檢測 條)、測量裝置(凝度計)和方法提供了以最少血液樣品確定凝血酶原時間的精確手段，並 因此可由患者容易和自主地使用，而無需靜脈穿刺。本發明的這些和其它方面因下文描述的實施方案而顯而易見且參照這些實施方 案進行闡釋。附圖簡述通過參照以下的附圖，結合所附說明書，可更好地理解本發明，並且其多個目的和 優點將對本領域技術人員而言更顯而易見，其中

圖1顯示本發明裝置的實施方案的分解立體圖，顯示了分開的兩層。圖2顯示圖1實施方案的裝置的俯視圖(圖的左邊部分)和側視圖(圖的右邊部 分)。圖2A顯示該微流體裝置的另一實施方案的俯視圖。圖3顯示凝結和對照通道中流動前緣位置重疊的圖解表示。圖4顯示凝結和對照通道中流動前緣速度重疊的圖解表示。圖5顯示圖1實施方案中凝結之前的示意性流動前緣位置。圖6顯示圖1實施方案中凝結之後的示意性流動前緣位置。圖7顯示血液相對波長的吸收係數。圖8顯示LED的發射光譜。
圖9顯示經優化以檢測綠光波長的光電二極體的響應曲線。圖10顯示在對凝結和對照通道的兩不同尺寸晶片中檢測到的相對時間的電流強度。圖11顯示圖10的電流強度曲線的導數。圖12顯示圖1實施方案的蛇形部分與像素尺寸19X 19 ii m的(XD陣列的重疊。圖13至16顯示用於通過理論曲線確定凝結時間的方程式方程式的曲線圖。圖17顯示來自實際凝結檢測的步驟3的典型數據以及根據理論方法1或2確定 的凝結時間。所有這些圖中，相似的參照數字指代相似的元件。發明詳述本發明提供了用於確定諸如血液和血漿的流體的凝結時間的晶片或一次性檢測 條形式的裝置，與本發明的檢測條一起用作便攜凝度計的測量儀器，以及採用本發明的微 流體裝置確定凝結時間的方法。作為Point-of-care裝置的便攜凝度計為沿四條主線改進的技術成本降低、血 液樣品減少、質量控制和增強的便攜性。所有這四個方面對於經濟且可靠地推廣患者自測 都是特別重要的。本發明相對於目前的最新便攜檢測條和凝度計有顯著優點-成本降低該一次性微流體晶片為極其簡單(無源)的元件，其以高容量低成本 生產技術和材料製造。_血液樣品減少在必要的質量控制和準確性情況下，通過該微流體晶片技術可 檢測遠少於5 u L的血液樣品。-質量控制多種不同的板上質量控制可整合到本發明的一次性裝置上並由單一 的檢測器件讀取。另外，該裝置允許將校準的血漿用作外部質量控制。-增強的便攜性該檢測系統極其緊湊、低成本且可被植入薄便攜裝置上。本發明基於這樣的事實，即適當的微流體通道允許諸如血液或血漿的流體樣品的 毛細流動，使得能用簡單器件以無源方式精確監測流體前緣的位置或速度，而無需與樣品 流體接觸。凝結級聯開始後(當樣品與凝結試劑接觸時)樣品流體的流變變化，特別是凝 結終點時的表觀粘度變化，對監測的動力學參數有顯著影響。這些參數可用相同的簡單檢測器件進行監測，並與不合凝結試劑或含不同對照試 劑的對照樣品比較，或可選擇地與預測的理論值比較。不希望被理論所束縛，我們認為本發明的微流體系統以某種方式模擬了血管的微 毛細管結構和流動血液的動力學。由於血液凝結階段(起始、擴大、播散和凝塊形成)的 複雜性和高靈敏性，儘可能地重現體內止血環境是非常有利的。根據來自芝加哥大學的發 表文章[Kastrup, C. J. Runyon, M. K. Shen, F. Ismagilov, R. F. Modular chemicalmechanism predicts spatiotemporal dynamics of initiation in the complexnetwork of hemostasis(模塊化學機制預測止血複雜網絡中起始的時空動力學)，Department of Chemistry and institute for BiophysicalDynamics, University of Chicago, Edited by George M. ffhitesides, Harvard University.]，體外微流體環境能夠模擬人毛細血管中 實際的血液凝結行為，他們證實這對於確定凝結時間是至關重要的。
8
另外，本發明使得能連續監測流動動力學，這樣能夠檢測止血分子變化，提供高準 確性和重複性。具體地，由於微毛細管結構的尺寸，第一不溶性血纖維蛋白的形成對流變性 能有明顯影響。如圖1顯示的，在一個實施方案中，本發明的微流體裝置為兩層組裝件，包括下方 的平面基板和覆蓋層。在下方的基板上，形成了樣品分布系統的圖案，得到一系列的通道或 導管，其通過適當的器件經由一端連接至樣品引入部位。這些通道通過毛細管作用引起流動。技術人員能夠調整下方基板上形成的通道的 大小和形式以獲得能夠準確監測的流動位置或速度。為了產生流體樣品的毛細流動，通道 中需要親水性表面，以便導致了足夠的負壓。這種親水性表面可存在於下方基板上或覆蓋層上。在一個實施方案中，該下方的基板由塑料製成。如果該塑料是疏水的，則必須通過 技術人員已知的手段在通道中形成親水性，例如化學處理、化學塗層或等離子體處理，以獲 得期望的表面能或接觸角。在優選的實施方案中，通過覆蓋層來帶來親水表面，該覆蓋層密封在下層上形成 的微流體通道。在該實施方案中，或者將親水性材料選作覆蓋層，或者使用經上文所述的親 水性處理的材料。可選擇地，在優選的實施方案中，通過用於使形成晶片的兩層結合的粘合劑賦予 上層親水性能。這種情況下，重要的是所選的粘合劑塗料不與流體樣品反應或不幹擾凝結 反應。因此，覆蓋層可以由各種類型的粘合劑聚合物膜組成，例如熱封和壓敏粘合劑。可 採用親水性製劑，在粘合劑中添加表面活性劑。優選硬粘合劑，以防止由於密封步驟期間的 粘合劑流動或由於蠕變導致的通道堵塞。圖2和2A顯示了本發明微流體裝置的不同實施方案的俯視圖，所述裝置包括下述 的組件。用於引入流體介質樣品的器件(1)，主要由入口組成。該入口連接至分配毛細管通 道(2)，接著是通道分叉(3)，其將分配通道(2)分成第一(6a)和第二區域(6b)，它們允許 所述流體介質沿所述區域的長度流動。任選地，該分配通道包含細胞濾器(僅在圖1中繪 出)。在優選的實施方案中，所述第一(6a)和第二(6b)區域具有相同結構。按從分配通道開始的順序，所述區域(6a和6b)的每個包括最先的部位(5a，5b) 和至少一個微流體通道，其在本文中稱為掃描部位(8)。第一部位(5a)包含能夠與所述流 體介質反應的第一試劑，並使得區域(6a)中的微流體通道用作反應通道，而第二部位(5b) 或者是空的，或者含有不同試劑，這樣區域(6b)中的微流體通道用作對照通道。優選地，所 述第一試劑能夠引發所述流體介質的凝結。在另一實施方案中，在晶片中存在兩個以上的 區域。所述區域之一用作以上解釋 的反應通道，其它兩個或多個為對照通道。
對於板上質量控制(on-board quality control)，血液樣品可以沿對照通道被毛 細作用驅動，對照通道中反應室具有提供已知且固定(或小範圍)的凝結時間的特定試劑。 例如，可以引入兩種類型的此類對照，標準化對照和異常對照，為凝結時間提供較低和較高參照。對照通道具有與存在於反應通道中的試劑不同的試劑組成。因此，在一個實施方案中，存在標準化的對照通道，其中存在的試劑能夠是例如至 少一種維生素K依賴的凝結因子。這類凝結因子可來自正常患者血漿的乾燥或凍幹合併池 (pool) ο 在另一實施方案中，存在異常對照通道，其包含凝結因子抑制劑，例如肝素、檸檬 酸鹽、草酸鹽、EDTA等。另外，它能夠包含與標準化對照通道中相同的維生素K依賴的凝結 因子。以下舉例說明優選的實施方案，描述了區域數目和它們的功能■ 2個區域相對於無凝結劑或具有凝結抑制劑的對照通道，一個反應通道用於 血液樣品凝結時間確定。■ 2個區域用於通過理論曲線確定血液樣品凝結時間的一個反應通道，以及提 供標準化凝結時間的一個對照通道。■ 3個區域相對於無凝結劑或具有凝結抑制劑的對照通道，一個反應通道用於 血液樣品凝結時間確定。另外，另一對照通道提供標準化的凝結時間。■ 3個區域一個反應通道用於通過理論曲線比較來確定血液樣品凝結時間。另 夕卜，一個對照通道提供標準化的凝結時間，另一對照通道提供已知的異常長的凝結時間。所有這些實施方案和其它的對技術人員顯而易見的變體都包括在本發明中。在本發明的裝置中，流動僅由毛細作用力驅動，因此該晶片或檢測條為無源裝置， 無需外力。親水性通道表面使得溼彎月面沿通道移向毛細管負壓，而去溼彎月面保持在入 口處。通過產生疏水表面或通過設計適合的通道開口而讓流動在停止閥處停止。在優選的 實施方案中，每一區域(6a，6b)含有用於排出(venting)的器件(7)，最優選排出口，其還用 作停止流動閥。儘管在圖2中繪製在通道的末端，但是排出口(7)可以位於沿微流體通道 的其它位置處。例如，在反應室出口處將排出口(7)與流動停止件連接使得毛細流動達到 該點處的速度最大化，如圖2A中所顯示的。在其它實施方案中，每一通道具有一個以上的 排出口(7)，這些排出口(7)使得能控制並調節流體的速度和流動性能。當流體介質經過第一(6a)、第二(6b)和任選的第三區域的掃描部位(8)時，監測 流體介質的至少一種性能，優選流體前緣的位置或速度。比較所述不同區域內的所述性能 使得能檢測到第一區域(6a)內反應發生的時刻，並確定流體樣品的凝結時間。這些區域優 選為毛細管通道。由於系統尺度縮小，這種裝置的工作原理依賴於微流體學，其控制原理完全不同 於傳統的流動理論。控制原理等截面毛細管的牛頓行為下的動態填充可通過體積流率Q來確定，其依賴於粘度 η，總流阻Rfk以及溼(前)和去溼(後)彎月面之間的壓差ΔΡ:
^ 1 APQ = ~—(1)
tJRfr對於長度「L」和矩形橫截面Α，寬度「a」和深度「b」的通道，流阻Rfk可表示為
其中「V為水力半徑，定義為A =^7^。為了確定L = L(t)，即相對於時間的流動前緣位置，需要將方程式(1)對時間求積
分。因此，L和計算為L對時間的導數的速度表示為 這些是凝結前的控制流動方程，因為粘度被認為是恆定的。當開始凝結時，粘度為 時間的函數，具有指數增長，這樣根據方程式(1)，線性反比於粘度的流動速率將出現突然 下降。基於可變的粘度在數值上確定曲線L(t)和在其它截面中顯示的導數。根據方程式(1)至(3)，可能產生通道長度的初步設計，該長度需要允許恆流直至 最高凝結時間。等截面管道的樣品體積「V」可按下式估計 因此，必須根據通道的幾何參數a、b和L以及所需的樣品體積和最大凝結時間來 設計該裝置並選擇通道大小。通過理論曲線確定凝結時間在本發明的一個實施方案中，利用流動動力學持續監測，可通過將測量的樣品性 能與理論預測值進行比較來確定或控制凝結時間。由於凝結前的動力學行為被很好地預測，所以凝結時間可確定為監測到的凝結曲 線偏離方程式(3)的理論曲線特定閾值的時刻。可應用幾種數學運算，使得這種偏離僅依 賴於定性的流動動力學行為而不是定量的流動動力學行為。兩種不同但類似的方法描述如 下方法1 步驟1 根據計算牛頓行為下毛細管長度的方程式(3)，L(t)為時間的冪函數。從L(t)和 從檢測系統得到的t值開始，可構成以下曲線L(t) = Kt0'5(5)該監測曲線(凝結通道)和理論曲線繪製在圖13中顯示的圖中。步驟2:對上述表達式兩邊取對數，得到0，5斜率的線性曲線(還參見圖14的圖)LogL (t) = logK+0. 51ogt(6)定量項為log K，定性項為0. 5 log t。步驟3:
通過改變變量(u= log t)，可定義新函數Y = Y(U)，並相對u對其求微分(還參 見圖15的圖) 步驟4:進行Y關於u的二階微分(圖16): d2Y 速度(f)或加速度(g)曲線中從恆定值的衰減超過預定閾值確定凝結時間。
dudu
上述運算為允許僅通過一個獨立的凝結通道確定凝結時間的算法的數學基礎。本發明的微流體晶片的設計使得流動的血液在凝結前具有主要牛頓行為。偏離這 種行為僅是由於假塑性效應，其能夠在低流速時出現。如果出現這種情況，仍可應用該方法 並相當有效，因為這種假塑性效應比凝結效應弱得多，在加速度曲線上能夠區分開。方法2:用於確定理論凝結時間的另一種且類似的數學方法簡單描述如下。從相同的原始
數據即步驟1獲得的L(t)和t值開始，可構成以下的曲線 τ} 該曲線與粘度(η)成比例，這可從方程式(3)得到。以下的步驟(2、3和4)如同 上文應用(即取對數，一階導數和二階導數)，這樣可構建速度和加速度曲線。基於實際檢測數據，兩種方法大體上給出相同的凝結時間(PT)。如圖17的圖中 所顯示的，在基本上所有監測曲線中發現的出人意料的結果是最早未預料到的行為，其與 凝結效應相反，參見術語「反演」下兩曲線中突出顯示的部分。這種效應實際上是約1或2 秒期間的瞬時粘度下降，其總是恰在凝結時間前被觀察到。這種行為提供了更簡單的凝結 時間鑑定，因為PT時刻由此成為了清晰的拐點，無論是方法1中的最大值還是方法2中的 最小值。儘管這種出人意料的行為的原因還是未知的，但是一些證據提示這可能是由於與 Fahraeus-Lindqvist效應結合的纖維蛋白不溶性單體的形成，其在纖維蛋白聚合物形成之 前降低表觀粘度。除了凝結時間確定之外，以上描述的理論方法還可用於質量控制，通過將檢測曲 線與理論預測相關聯來進行。在正規操作者(即非患者誤用)和正確的裝置條件下，凝結 前的血樣樣品流動應接近於上述線性行為。任何與這種行為的明顯偏離都可以通過流動監 測系統和處理器進行檢測並處理，提供了測試取消指令。根據優選的實施方案，該流體介質為血液，優選來自患者手指穿刺的毛細血管全 血，並且具有已知凝結時間的已校準的血漿可被用於外部質量控制。能夠與所述流體介質 反應的試劑為凝結試劑，更優選組織因子或促凝血酶原激酶。這種情況下，本發明的裝置和方法特別適合於確定凝血酶原時間，即凝結激活和 開始凝結之間經過的時間。可根據標準INR值設計該裝置；所建議的最高INR範圍約為8，這也意味著PT約100秒。達到這種最大INR所需的尺寸顯示在表1中。如之前所提到的，不同管道設計所需 的尺寸和總體積「Vt」由方程式(3)控制。 表1.不同導管設計達到這種最大INR範圍(lOOsec)所需的長度和總體積「Vt」。該表證實，通過簡單地將流體設計縮小至微尺度，可僅通過血滴就達到標準INR 範圍。本發明通道的形狀和尺寸使得能確定不超過15 μ 1血液樣品的凝結時間，並且當 所有的線路都填充時所分配的總體積少於10μ 1，這允許剩餘的體積在入口內，這為將去溼 彎月面固定在入口處所需。該微流體通道允許連續流動，持續幾秒到超過上百秒，使得能在 大時間範圍進行PT確定。因此，本發明的晶片和方法使得能以少量血液樣品(優選少於 10 μ 1，更優選少於5 μ 1，且最優選以約1μ 1或更少量進行)測量精確凝結時間和進行INR 測定。對於方便患者而言這是非常重要的。毛細管通道(6a，6b)的長度應該足夠大，使得試劑與流體的反應能在流體前緣到 達通道末端之前完成。在優選的實施方案中，該毛細管通道(6a，6b)為彎曲形狀，最優選具 有蛇形路線，以便在保持了通道長度的同時使該裝置的面積最小。由於製造限制，優選的通道橫截面為矩形的，允許純粹2D幾何形狀，這簡化了模 塑製造工藝。具體的尺寸必須仔細計算，因為流動動力學和所採用的總體積對通道尺寸非 常敏感。如本文中所顯示的，遠超過100 μ m的尺寸值需要非常大的通道長度以允許流動持 續時間長至最大凝結時間，並需要更大的血液樣品體積。採用微流體設計，或換言之，採用 約IOOym或更小的通道橫截面尺寸，通道長度能夠降低，並且血液用量少。另外，晶片尺寸 及其成本也大大降低。優選地，反應和對照通道具有a = b的橫截面。這種情況下，a和b優選30至 125 μ m,更優選50至100 μ m,甚至更優選約80 μ m。含有試劑的部位(優選為反應單元)的尺寸也必須適合於允許足夠體積來分配液 體狀態的試劑。另外，該設計還必須如此定義，以使得擴散時間允許達到足夠的試劑濃度， 以便使激活的血液體積最大化。這可通過最大化反應室內的表面積與體積的比率來實現。 優選地，該足印室(footprint chamber)設計應為環形的，以適合於小滴分配形狀，尺寸為 直徑1至4mm，高度40至150 μ m。更優選地，該直徑為約1. 5mm,高度約80 μ m。分配通道的高度尺寸優選150μπι至350μπι，更優選約250 μ m。血液入口優選是分配通道上晶片邊緣處覆蓋層和基礎底層之間留下的間隙，因此可具有所述分配通道的高度。分給分配通道的體積應稍大於分給在隨後的毛細結構中的體 積，這樣一旦分配通道完全填充了流體，它不會變空。該體積規定了最小監測樣品體積要 求。為了滿足結構要求和尺寸限制，可通過改變微流體通道的橫截面，例如通過讓微 流體通道的節段變窄或通過引入逐漸變細的微流體通道，通過引入無源流動控制閥來改變 流動速率Q。微流體裝置的操作本發明要求向入口添加血液或血漿樣品，經該入口血液或血漿進入樣品分配通 道，沿該通道該相同的血液或血漿樣品分流進反應/凝結通道和一個或多個對照通道。在血液凝結前的時間tm時，通道內的流動前緣位置可表示如下，L = L (tm)L， = L， (tm)(11)其中L y L』分別為凝結和對照位置。時間t = 0為流出凝結通道的反應室的時 亥IJ，因為其為組織因子或促凝血酶原激酶溶解並啟動反應機制的時刻。分流具有幾乎相同的運動動力學，直至凝結通道中開始凝結。最早血液凝結髮生 時的這個時刻被鑑定為凝血酶原時間，並導致粘度的突然增加。這時，沿凝結通道的流動動 力學相對於對照通道減速。通過持續監測(8)作為時間函數的流動前緣位置，可計算該位 置對時間的導數，這可認為是流動前緣速度。在圖3中，顯示了如何鑑定兩通道中的流動前緣位置和凝血酶原時間。採用以下 的假設在數值上計算這些曲線，其中變量a、b、η和PT具有前文指出
表2.用於數值計算的假設。在PT之前，通道之間的差異應極小，僅受非均一的環境條件、製造公差和檢測噪 聲的影響。優選對時間的導數曲線，因為其對粘度變化更敏感，其可以被稱為流動前緣速 度。類似地，在PT之前的時間乜時，監測的凝結(V)和對照(V』 )的速度將為V = V(tm)V，=V，(tm)(12)這些曲線顯示在圖4中。可通過定義用於速度差V(tm)_V』(tm)的適當閾值「Δ」來確定PT。在PT之前，粘 度是恆定的，流動前緣位置和速度具有較小差異，如圖5中示意性顯示的。在時間tp時，速度差剛剛超過閾值(見圖6)，該時刻為PT。檢測器件對於連續檢測或監測流動前緣運動，可採用L = L(t)或ν = v(t)差異檢測技術 通過光電二極體檢測 通過諸如電荷耦合器件(CXD)或互補金屬氧化物半導體(CMOS)的光學傳感器檢測。在圖7中對血液吸收係數作圖。可以看出它特別地在400nm處吸收，也在綠色 (530nm)附近吸收。通過光電二極體檢測以LED照明蛇形部分，並以光電二極體檢測透射光。移動的流動前緣線性地增加 吸收，因此檢測到的強度相應地減少。採用信號放大器，監測微小的流動位置增量是可能 的。在下文中，進行了一些計算來評估採用標準低成本元件進行這種監測方案的可行 性。選擇容易從分銷商獲得的LED和光電二極體，二者都是低成本的。該LED具有3mm大小，並在20°角內發射。強度為15000mcd = 0. 0309Watts/str， 這樣當採用完全20°立體角(0. 095str)，總的發射功率達到0. 00294。該LED的發射光譜和光電二極體的響應曲線可顯示在圖8和圖9中，其中該光電 二極體是標準的矽光電二極體，但也能被優化以檢測綠色波長。在這些假設下，以及通過進一步獲得掃描部位(8)、通道尺寸和來自圖3的實際 L(t)曲線，可獲得光電二極體檢測到的強度信號。為了簡明，還假設晶片優選為透明的並且 不發生Fresnel反射。繪製在圖10中的強度信號也包含20picoA的暗電流隨機噪聲模擬， 如製造商所說明的。該曲線對應250Χ250μπι的通道截面。通過計算強度信號對時間的導 數，可獲得與流速成比例的信號，如圖11中所顯示的。通過兩幅顯示的圖(圖10和11)，證實流動前緣監測是可行的，並具有足夠高的靈 敏度，這可從可忽略的影響該曲線的噪聲推斷。另外，光電二極體的時間響應非常高，其允 許高至IOMHz的頻率取樣，而放大器自身限於lOKhz。這些值超出精確監測所需頻率(約 20Hz)幾個數量級。通過光學傳感器檢測採用這種檢測方案時，該系統使用相似的構造，但替換了檢測裝置。這種情況下， 我們使用CCD或CMOS傳感器，這樣通過處理高頻測繪掃描表面後獲得的數據來獲得流動前
緣位置。該LED系統可與前一方案中定義的相似。有趣的是，這種情況下不需要高靈敏度， 因為CCD內的每一單元或像素是用於檢測該位置是否存在流動。如圖12中所顯示的，通過 將標準的CCD有效部位與蛇形部分疊加，測繪的圖像將使得能鑑定流動前緣位置，具有足 夠的解析度和時間響應(> IKHz)。這種技術需要圖像數據處理，以便從模糊圖像能夠鑑定彎月面位置。這增加了監 測系統的複雜性，但是，與光電二極體檢測方案相反，每一單元或像素的靈敏度是較不嚴格 的，在這個意義上其有利於CXD檢測方案。為了改善檢測信號質 量，可整合進諸如透鏡的光學器件。現在可用非常低的成本 得到商品化剛性模塊(rigid blocks)、整合透鏡和傳感器，例如向汽車行業供應的小型照 相機。這些模塊測量僅數毫米，因此使得能非常緊湊且非常薄地整合進便攜系統，例如便攜 凝度計。通過帶有嵌入軟體的微處理器處理檢測的信號。生成動力學流動數據曲線，並且將算法用來確定凝結時間，以及用於各種質量控制。如之前所闡釋的，本發明的晶片(檢測條)和方法具有另一顯著優點，因為該相同 的檢測器件可用於監測相同的流體流動和用於執行各種質量控制任務。當通過人工視覺系統來提供檢測器件時，諸如(XD/CM0S傳感器或顯微照相機，一 般用在用於凝度計的檢測條中的三種主要質量控制可通過這種視覺系統的視野圖像處理 來進行
用於穩定性監測的板上環境條件指示劑諸如溫度和溼度的環境條件能夠通過針 對這些因素的顏色敏感化合物來監測。所選擇的化合物遇到溫度和溼度閾值時經歷不可逆 的顏色變化，發出缺陷晶片的信號。它們也可被直接添加至反應室上、底部基板上或覆蓋層 表面上，處於檢測器的視野下。不同的敏感化合物組合可被用於該目的。這類化合物的實 例為感覺溫度化合物隱色染料類(Leuco dyes)，惡嗪類，結晶紫內酯，酚酞等。金屬鹽作 為感覺溼度化合物氯化鈷、硫酸鈣等。N氧化物或亞硝基化合物既是溫度又是溼度感覺化 合物。這將允許測量裝置(例如便攜凝度計)能使患者獲悉該監測晶片未通過質量控 制，應拋棄。外部質量控制可商購的用於進行INR和PT檢驗校準的具有已知凝結時間的校準 的血漿可被用於外部質量控制，這樣可評估整個便攜凝度計系統。在該實施方案中，調整人 工視覺系統以便能檢測流動血漿。儘管血漿為近乎透明的流體，但幾乎不需要調整照明led 系統和成像處理以有效跟蹤血漿流動，因為流動的血漿被識別為沿明亮通道前進的灰色陰影。列印的庫德巴碼(Codebar)列印的代碼帶有校準數據、可追溯數據和有效期限 以及其它相關信息。用於這種類型檢測條的數毫米大小標準數據矩陣編碼可被列印在晶片 的覆蓋層上或透明標籤上。以上描述的適合的檢測和/或監測器件包括在外部裝置(凝度計)內，該裝置包 括用於接收本發明的微流體裝置的槽並設計為與所述微流體裝置協作。另外，該外部裝置包括用於處理由檢測和/或監測器件輸送的數據的器件，並生 成信號輸出至顯示器件。製造本發明的微流體裝置可容易地用當前的塑料複製技術和組裝技術製造。該組裝件 由兩密封的元件形成在其上形成微流體結構的下方基板，以及上方基板或覆蓋件，如圖1 中所顯示的。同時適用於該裝置的下方基板和覆蓋層的材料有多種聚合物、熱固性和/或熱塑 性材料，它們應具有良好的光學性能和良好的尺寸穩定性。例如，可採用C0C、PMMA、PC、PSU、 SAN、PETG、PS 禾口 PP0大多數的聚合材料是疏水性的。因此，如果選擇了強疏水材料作為形成微流體結 構的基板，則隨後賦予親水性的某種表面的生產步驟是必要的，如之前所闡述的。為此，建 議親水性或至少不疏水(接觸角< 90° )的塑料。對於PMMA、醋酸纖維素、PC、COC和PS 以及其它公知的材料就是如此。特別優選的一種材料是PMMA，這是考慮到其良好的接觸角、 光學性能和尺寸穩定性。
下方基板可用目前可利用的多種技術容易地複製，並且具有極高精確性，允許低 的微特徵公差。用於所述圖案形成步驟的當前最相關技術為顯微注射模製、熱模壓和軟蝕 亥丨抑刷(soft lithographyimprinting) ο密封步驟可採用多種公知的技術進行，例如熱壓粘合、粘結劑粘合、等離子體活化 的粘合、超聲粘合、雷射焊接等。覆蓋件優選親水性膜。其優選透明的，以便能精確監測流體流動。如上文所闡述 的，親水性膜提供了非常有成本效益的方式，其使得能同時密封和讓通道親水化，避免了表 面處理步驟。這種情況下，生產技術由標準的層壓工藝組成，其可要求壓力和溫度控制。其 它的生產技術為壓花或壓制工藝。如上文所描述的，反應室可以分配多種幹_試劑化合物用於多種目的。主要的化 合物為起始凝結級聯的促凝血酶原激酶。由於反應室的小尺寸，可添加高性能的化合物而 不明顯增加生產成本。 由於它們的化學純度，人促凝血酶原激酶重組蛋白在溶解性和靈敏度方面有極其 有用的性能。前一性能傳統上通過使用特異添加劑來增強。在本發明的設計下，可分配幾 分之一微升的人重組因子，在溶解性和靈敏度方面顯示出極好的結果。多種添加劑在乾燥試劑的合理功能方面起作用。它們不僅被用於快速增溶，還用 於控制擴散參數，改善製造步驟和試劑穩定性，或用於解決以下問題a)對攝取液體入乾燥試劑進行調節簡單聚合物如羥丙基纖維素、聚乙烯醇、聚 乙二醇等。b)快速增溶、穩定劑和縮短乾燥過程白蛋白、穀氨酸鹽、糖類(例如葡萄糖、蔗 糖、海藻糖等)等。c)可控的潤溼性Triton、Macol、Tetronic、Silwet、Zonyl、Pluronic 等。d)用於監測穩定性和用於分配對照的顏色指示劑隱色染料作為感覺溫度化合 物(惡嗪類，結晶紫內酯、酚酞等)。金屬鹽作為感覺溼度化合物，如氯化鈷、硫酸鈣等。N 氧化物或亞硝基化合物同時作為溫度和溼度感覺化合物。e)增強環境條件穩定性有機汞化合物如硫汞撒(Thimerosal)等。f)其它用於各種功能的化合物聚凝胺(Polybrene)(抗肝素劑)和緩衝劑。所述乾燥試劑可通過多種公知的技術應用至反應室或應用在覆蓋基質上液滴分 配、凝膠分配、噴射分配、絲網印刷、刮刀塗布、選擇性噴霧和薄膜鑄塑。該分配步驟之後為 乾燥步驟。優選地，乾燥試劑以液體狀態分配在反應室上，形成佔反應室大部分的小滴，乾燥 後成為薄的乾燥試劑層。有利的是，製造方法和由此形成的晶片(檢測條)極其簡單，無需嵌入元件，如電 極或任何形式的多層結構。實際上，本製造技術允許低成本生產，這樣可生產廉價的一次性
直ο本發明通過其微流體設計提供了非常靈敏和精確的凝結時間測定手段。凝結時間 (例如凝血酶原時間)涉及不溶性血纖維蛋白分子開始聚合的時刻，此後產生形成凝塊的 「網」。一般幾微米數量級的血纖維蛋白聚合物的形成導致流動血液的表觀粘度突然增加， 特別是當通道橫截面變得如同當前的微流體設計那樣微小時。就精確性和靈敏度而言，這種裝置相對於之前的用於凝結時間測定的裝置提供了上述優點。另外，本發明晶片與測量裝置的組合提供了組合的優勢。使用單一的光學檢測器 件使得能同時檢測流體流動變化和進行不同的質量控制。這意味著該便攜測量裝置將會是 較不複雜和更緊湊的，採用標準元件。事實上，該測量裝置可具有行動電話的大小。相對於 之前的裝置，特別是那些基於血液流動的裝置，還在精確性和靈敏度方面有顯著改善，因為 使得流動監測以高頻率取樣持續進行。以此方式，可精確地確定凝塊形成對血液流動有最 初減速作用的時刻。本領域技術人員會意識到，本申請中描述的新穎概念可在多種應用中改進和變 化。 因此，授予專利權的主題的範圍不應限於任何所討論的具體示例性教導，而是由 以下的權利要求書所限定。權利要求書中的任何參照標記不應認為是對其範圍進行限制。
權利要求
用於確定諸如血液或血漿的流體介質中凝結時間的微流體裝置，所述裝置包含-用於引入所述流體介質樣品的器件(1)；以及-與用於引入樣品的所述器件(1)連接的第一區域(6a)，其用於允許所述流體介質沿所述第一區域的長度流動；-在所述第一區域開始處的第一部位(5a)，其包含能夠與所述流體介質反應的試劑；所述裝置的特徵在於所述裝置還包含-也與用於引入樣品的所述器件(1)連接的第二區域(6b)，其用於允許所述流體介質沿所述第二區域的長度流動；-其中所述第二區域(6b)不包含能夠與所述流體介質反應的試劑，或-其中在所述第二區域(6b)的開始處存在第二部位(5b)，所述第二部位(5b)包含能夠與所述流體介質反應的試劑，所述試劑不同於所述第一部位(5a)的試劑。
2.如權利要求1所述的微流體裝置，其特徵在於所述區域(6a、6b)的每個由至少一個 微流體通道組成。
3.如權利要求2所述的微流體裝置，其特徵在於所述微流體通道(6a，6b)為毛細管通 道，其中所述通道的表面為親水性的，並且毛細管作為移動所述流體介質的唯一作用力而 起作用。
4.如權利要求1至3中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述區域的每個包含用 於排出的器件(7)。
5.如權利要求4所述的微流體裝置，所述用於排出的器件由用作停止流動閥的排出口 (7)構成。
6.如權利要求1至5中任一項所述的裝置，其特徵在於所述第一區域的所述第一部位 由含有能夠引發所述流體介質凝結的試劑的反應單元(5a)構成。
7.如權利要求1至6中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述第二區域的所述第 二部位由含有能夠抑制所述流體介質凝結的試劑的反應單元(5b)構成。
8.如權利要求1至7中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述裝置還包括也與用 於引入樣品的所述器件(1)連接的第三區域，其用於允許所述流體介質沿所述第三區域的 長度流動，其中在所述第三區域的開始處存在含有能夠與所述流體介質反應的試劑的第三 部位，所述試劑不同於所述第一(5a)或第二(5b)部位的試劑。
9.如權利要求1至8中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述用於引入樣品的器 件由入口(1)組成，所述入口(1)通過後接通道分叉(3)的分配通道(2)與所述第一和第 二區域(6a，6b)以及，如果第三區域存在的話，與第三區域連接，所述通道分叉將(4)分入 所述第一、第二和任選的第三區域。
10.如權利要求1至9中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述第一、第二和任選 的第三區域(6a，6b)為彎曲形狀。
11.如權利要求1至10中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述第一、第二和任選 的第三區域(6a，6b)由具有蛇形軌跡的通道組成。
12.如權利要求1至11中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述通道具有矩形橫 截面。
13.如權利要求1至12中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述通道由不同橫截面的節段的組合組成。
14.如權利要求1至13中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述部位(5a)中的所 述試劑為促凝血酶原激酶，且所述凝結時間表示凝血酶原時間。
15.如權利要求1至14中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述第一區域用作 凝結通道(6a)，且所述第二區域用作對照通道(6b)，並且所述兩個區域的每個具有相同結 構。
16.如權利要求1至14中任一項所述的微流體裝置，其特徵在於所述第一區域用作凝 結通道(6a)，且所述第二和第三區域用作對照通道，以及在於所述三個區域的每個具有相 同結構。
17.如權利要求1至16中任一項所述的微流體裝置，還包含用於質量控制的光學部件。
18.凝度計裝置，包括-用於引入權利要求1至17所述的微流體裝置的槽；-用於連續檢測和/或監測所述區域的每個中所述流體介質的至少一種性能的光學器 件；以及-用於處理由所述檢測和/或監測器件傳輸的數據以及用於確定所述流體介質的凝結 時間的器件，其中所述光學器件還測量或讀取所述微流體裝置上的質量控制部件。
19.如權利要求18所述的凝度計裝置，其特徵在於所述流體介質的所述性能為所述流 體介質在每一所述區域的前緣位置和/或其速度。
20.如權利要求18或19中任一項所述的凝度計裝置，其特徵在於所述處理器件包括用 於比較所述兩個或三個區域的每一個中的一種或多種所述性能的器件。
21.如權利要求18至20中任一項所述的凝度計裝置，其特徵在於所述處理器件包括用 於檢測第一通道(6a)中一種或多種所述性能與第二通道(6b)和/或第三通道中的一種或 多種所述性能之間的差異達到預定閾值的時間點的器件。
22.如權利要求18至21中任一項所述的凝度計裝置，其特徵在於所述檢測和/或監測 器件包括用於照明每一所述區域的器件和用於分析由每一所述區域透射或反射的光的器 件。
23.如權利要求24所述的凝度計裝置，其特徵在於所述照明器件至少包括LED且所述 分析器件至少包括光學傳感器。
24.如權利要求23所述的凝度計裝置，其特徵在於所述分析器件至少包括透鏡。
25.確定諸如血液或血漿的流體介質中凝結時間的方法，包括以下步驟-將所述流體介質的樣品引入權利要求1-17所述的具有第一和第二區域(6a、6b)的微 流體裝置，在所述區域中，允許所述樣品沿長度流動；-在所述第一區域(6a)的開始處提供能夠與所述流體介質反應的第一試劑(5a)；以及-在所述第二區域(6b)中不提供試劑或提供不同於所述第一區域(6a)中所述第一試 劑的第二試劑(5b)，-用光學器件連續監測所述流體介質在所述第一區域(6a)和所述第二區域(6b)中的 至少一種性能，-將所述流體介質在所述第一區域(6a)內的至少一種性能與所述流體介質在所述第二區域(6b)的至少一種相同性能或針對這種性能的理論值進行比較。
26.如權利要求25所述的確定諸如血液或血漿的流體介質中凝結時間的方法，其特徵 在於對所述流體介質在所述第一區域中的至少一種所述性能的比較是針對所述流體介質 在所述第二區域(6b)中的至少一種性能進行的。
27.如權利要求25所述的確定諸如血液或血漿的流體介質中凝結時間的方法，其特徵 在於對所述流體介質在所述第一區域中的至少一種所述性能的比較是針對所述性能的理 論值進行的。
28.如權利要求25或26所述的確定諸如血液或血漿的流體介質中凝結時間的方法，其 特徵在於所述方法包括質量控制步驟，所述質量控制步驟包括使所述監測的性能與理論曲 線相關聯。
29.製造如權利要求1至17中任一項所述的用於確定諸如血液或血漿的流體介質中凝 結時間的微流體裝置的方法，包括以下步驟-提供第一基板；-在所述第一基板中形成對應於權利要求1至17中任一項所述的微流體裝置的顯微結構；提供第二基板；以及將所述第二基板密封在所述形成顯微結構的第一基板的頂部，以使所述第二基板用作覆蓋件。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述第二基板為親水性膜。
全文摘要
本發明描述了低生產成本並由此可為一次性的微流體無源裝置，以及用於確定諸如血液的流體介質的凝結時間的方法。當優化來確定血液凝結時間時，其需要極少量的全血樣品(＜5μL)，並且其特別適合於INR或PT測定，這可由患者自主使用，無需靜脈穿刺。檢測和解釋結果的處理器件包括在外部凝度計裝置中。還提供了製造微流體裝置的生產方法。
文檔編號G01N33/49GK101868723SQ200880117091
公開日2010年10月20日 申請日期2008年9月22日 優先權日2007年9月20日
發明者胡安·安東尼奧·配昂埃奎厄恩, 艾納其·薩達巴查姆皮蒂爾德瑞比斯 申請人:艾萊恩微觀系統有限公司