免疫色譜試驗片及色譜分析方法
2023-04-27 16:52:01 5
專利名稱：免疫色譜試驗片及色譜分析方法
技術區域本發明涉及利用抗原抗體反應定性或定量分析液體試樣的免疫色譜試驗片及色譜分析方法，特別是對血液等有色試樣不進行預處理即可分析的免疫色譜試驗片和色譜分析方法。
背景技術：
以前，作為實施水質檢查、尿檢查等液體試樣的化學試驗或臨床試驗的方法，廣泛採用利用抗原抗體反應的免疫色譜法進行測定。一般，色譜法是指將混合物根據其構成成分進行分離、鑑定的方法。色譜試驗片包括添加液體試樣的部分、保持有隨液體試樣浸透可以移動並具備與流過液體試樣中所含分析對象物特異性結合的物質的標記試劑的部分、標記試劑與分析對象物發生結合反應的部分、吸收流過的試樣的部分。在色譜試驗片上添加液體試樣，放置，一定時間後發生伴有顯色或變色的顯色反應，可以通過目視檢測方式進行定性的判斷。
免疫色譜分析方法是利用抗原抗體反應的特異性，鑑定、檢測抗原或抗體的方法。免疫色譜試驗片相對於上述一般的色譜試驗片，還具備固定有抗體或抗原的部分，該抗體或抗原對於液體試樣中所含的分析對象物和標記試劑形成的複合體可引起抗原抗體反應。如果在免疫色譜試驗片上添加含有分析對象物的液體試樣，標記試劑被液體試樣溶解，沿浸透方向展開，在固定有抗體或抗原的測定區域發生一定的顯色。因此，根據測定區域有無顯色，可以判斷液體試樣中是否含有特定的分析對象物。由於該分析結果是通過顯色反應進行判斷，因此是通過目視檢測方式進行記錄。因而，免疫色譜分析方法非常容易判斷分析的結果，可以用於各種分析對象物的分析。
一般，採用免疫色譜法的分析是定性的分析，但是定量的分析方法也在開發。在特開平8-240591號報告中公開了一種在免疫色譜試驗片上添加試樣，進行反應後，用檢測儀器測定試驗片的顯色部分的吸收或反射等信號，將顯色程度定量化的方法。此外，特開平8-334511號公報公開了一種使用圖象傳感器給顯色的免疫色譜試驗片攝像，對圖象轉換出的色調圖象進行解析處理，定量測定顯色程度的方法。
一般的免疫色譜試驗片由於沒有機械控制液體試樣浸透速度的手段，且不能人為控制浸透速度，上述浸透速度受到試驗片浸透性的左右。使用該試驗片對血液等含有細胞成分的液體試樣進行分析時存在下述問題，液體試樣的粘性或細胞成分的存在會使反應層載體出現阻塞，妨礙液體試樣的浸透，結果導致測定時間大幅度延長，其間出現液體試樣的乾燥等，造成反應的精度或定量性能差。
另外，目視或試樣檢測儀器測定顯色程度的免疫色譜分析方法存在下述問題，有色試樣中含有的色素，例如血液成分具有的血色素(紅色)妨礙讀取通過抗原抗體反應產生的顯色反應，導致定量測定時的靈敏度降低，產生測定誤差。
為了解決上述問題，以前在有色試樣，特別是全血的場合，必須進行離心分離等預處理，預先除去該試樣中含有的色素，即含有血色素的血球成分。但是，進行這種預處理會使免疫色譜法分析方法變得煩雜，另外也會導致成本上升和操作性降低。
鑑於上述問題，本發明的目的在於提供一種免疫色譜試驗片和色譜分析方法，可以防止細胞成分等妨礙液體試樣浸透試驗片，同時不受試樣中含有的有色成分，特別是來源於血色素的背景的影響，定量讀取抗原抗體反應的結果——顯色程度，而且沒有必要對添加的試樣特別是血液進行離心分離等預處理。
發明公開為了達到上述目的，本發明第1項發明涉及的免疫色譜試驗片是對有色試樣中含有的分析對象物進行定性或定量分析時使用的免疫色譜試驗片，標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
另外，本發明第2項發明涉及的免疫色譜試驗片是對有色試樣中含有的分析對象物進行定性或定量分析時使用的免疫色譜試驗片，反應結束後的標記物或標記物產生的反應物具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
另外，本發明第3項發明涉及的免疫色譜試驗片根據第1或2項發明記載的免疫色譜試驗片，上述試樣為血液的場合，在上述試驗片上產生顯色時，特異性吸收波長為580nm以上。
另外，本發明第4項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第1至3項發明中任意一項記載的免疫色譜試驗片，具有保持破壞上述試樣中所含細胞成分的物質的區域。
另外，本發明第5項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第4項發明記載的免疫色譜試驗片，破壞細胞成分的物質包括無機物、表面活性劑或皂甙類。
另外，本發明第6項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第5項發明記載的免疫色譜試驗片，上述無機物包括氯化物。
另外，本發明第7項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第5項發明記載的免疫色譜試驗片，上述表面活性劑包括非極性表面活性劑。
另外，本發明第8項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第1至7項發明中任意一項記載的免疫色譜試驗片，採用分光光度計定性或定量分析顯色程度。
另外，本發明第9項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第1至8項發明中任意一項記載的免疫色譜試驗片，上述標記物包括選自金屬溶膠、氧化金屬粒子、非金屬溶膠、染料溶膠、著色粒子、色素或酶中的至少一種。
另外，本發明第10項發明涉及的免疫色譜試驗片根據上述第1至9項發明中任意一項記載的免疫色譜試驗片，上述分析對象物包括血漿蛋白質、細菌、病毒中至少一種。
另外，本發明第11項發明涉及的色譜分析方法是使用免疫色譜試驗片的色譜分析方法，特徵在於在上述免疫色譜試驗片上添加含有分析對象物的有色試樣，在上述顯色時的特異性吸收波長下測定上述試驗片上的顯色程度，標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，具有與含有分析對象物的有色試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比有色試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
另外，本發明第12項發明涉及的色譜分析方法是使用免疫色譜試驗片的色譜分析方法，特徵在於在上述免疫色譜試驗片上添加含有分析對象物的有色試樣，在上述顯色時的特異性吸收波長下測定上述試驗片上的顯色程度，反應結束後的標記物或標記物產生的反應物具有下述波長區域，具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
另外，本發明第13項發明涉及的色譜分析方法根據第11或12項發明所述的色譜分析方法，上述試樣為血液的場合，通過在580nm以上的任意波長下測定顯色區域中來自標記物的信號，對分析對象物進行定性或定量分析。
另外，本發明第14項發明涉及的色譜分析方法根據第11至13項發明中任意一項記載的色譜分析方法，上述免疫色譜試驗片具有保持破壞試樣中所含細胞成分的物質的區域。
另外，本發明第15項發明涉及的色譜分析方法根據第14項發明記載的色譜分析方法，破壞細胞成分的物質包括無機物、表面活性劑或皂甙類。
另外，本發明第16項發明涉及的色譜分析方法根據上述第15項發明記載的色譜分析方法，上述無機物包括氯化物。
另外，本發明第17項發明涉及的色譜分析方法根據上述第15項發明記載的色譜分析方法，上述表面活性劑包括非極性表面活性劑。
另外，本發明第18項發明涉及的色譜分析方法根據上述第11至17發明中任意一項記載的色譜分析方法，採用分光光度計定性或定量分析顯色程度。
另外，本發明第19項發明涉及的色譜分析方法根據第11至18項發明中任意一項記載的色譜分析方法，上述標記物包括選自金屬溶膠、氧化金屬粒子、非金屬溶膠、染料溶膠、著色粒子、色素或酶中的至少一種。
另外，本發明第20項發明涉及的色譜分析方法根據上述第11至19項發明中任意一項記載的色譜分析方法，上述分析對象物包括血漿蛋白質、細菌、病毒中至少一種。
根據第1至3、9和10項發明的免疫色譜試驗片，對有色試樣中含有的分析對象物進行定性或定量分析時使用的免疫色譜試驗片中，通過使標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數，在分析含有有色成分的試樣時具有下述效果，能夠不受上述有色成分導致的背景的影響定性或定量分析顯色程度，可以實現高靈敏度、高性能的色譜分析。
根據第4至7項發明的免疫色譜試驗片，在第1至3項發明中任意一項記載的免疫色譜試驗片中，通過使之具有保持破壞上述試樣中所含細胞成分的物質的區域，除上述第1至3項發明的效果之外還具有下述效果，在分析含有細胞成分的試樣時，上述細胞成分被破壞，上述試樣向試驗片的浸透變得順利，可以縮短測定時間，更準確地進行定量分析。另外，對於血液等具有細胞成分的試樣，不需要離心分離等預處理，因此還具有降低成本和提高操作性的效果。
根據第8項發明的免疫色譜試驗片，在第1至7項發明中任意一項記載的免疫色譜試驗片中，通過使之採用分光光度計定性或定量分析顯色程度，除上述第1至7項發明的效果之外還具有下述效果，使用反射型分光光度計時，支持反應層的支持體可以使用不透明的材料，而且可以不必注意反應層背面的狀態進行測定，另外使用透過型分光光度計時，也可以測定反應層深部的顯色程度，能夠實現高靈敏度、高性能的定性或定量分析。
根據第11至13、19和20項發明的色譜分析方法，特徵在於在使用免疫色譜試驗片的色譜分析方法中，在上述免疫色譜試驗片上添加含有分析對象物的有色試樣，在上述顯色時的特異性吸收波長下測定上述試驗片上的顯色程度，通過使標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數，在分析含有有色成分的試樣時具有下述效果，能夠不受上述有色成分導致的背景的影響定性或定量分析顯色程度，可以實現高靈敏度、高性能的色譜分析。
根據第14至17項發明的色譜分析方法，在第11至13項發明中任意一項記載的色譜分析方法中，通過使上述免疫色譜試驗片具有保持破壞試樣中所含細胞成分的物質的區域，除上述第11至13項發明的效果之外還具有下述效果，在分析含有細胞成分的試樣時，上述細胞成分被破壞，上述試樣向試驗片的浸透變得順利，可以縮短測定時間，更準確地進行定量分析。另外，對於血液等具有細胞成分的試樣，不需要離心分離等預處理，因此還具有降低成本和提高操作性的效果。
根據第18項發明的色譜分析方法，在第11至17項發明中任意一項記載的色譜分析方法中，通過使之採用分光光度計定性或定量分析顯色程度，除上述第11至17項發明的效果之外還具有下述效果，使用反射型分光光度計時，支持反應層的支持體可以使用不透明的材料，而且可以不必注意反應層背面的狀態進行測定，另外使用透過型分光光度計時，也可以測定反應層深部的顯色程度，能夠實現高靈敏度、高性能的定性或定量分析。
附圖的簡單說明圖1表示本發明實施方式1的免疫色譜試驗片。
圖2表示本發明實施方式2的免疫色譜試驗片。
圖3表示本發明實施例中在520nm的波長下測定顯色區域時(a)與在610nm的波長下測定顯色區域時(b)的定量性能。
發明的最佳實施方式以下，參照
本發明實施方式1的免疫色譜試驗片以及色譜分析方法。
圖1表示本發明實施方式1的免疫色譜試驗片10。
圖1中，免疫色譜試驗片10具備反應層載體支持體1、試樣添加部2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白固定化部5和吸水部6。
反應層載體支持體1由非液體透過性塑料等構成，支持色譜材料。試樣添加部2由吸收性大的無紡布等構成，添加或塗敷液體試樣。標記物保持部位3在無紡布等的上面保持可以溶解的標記試劑。反應層4由硝基纖維素等構成。特異性蛋白固定化部5在反應層4的區域上根據反應形式固定有對抗體或抗原這種分析對象物發生特異性結合反應的特異性蛋白質。吸水部6最終吸收液體試樣。上述的試樣添加部2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白固定化部5和吸水部6均在反應層載體支持體1的上部形成。標記試劑和特異性蛋白質有必要根據所分析的試樣以及分析對象物選擇合適的物質。
另外，標記物產生的物質是指例如標記物在特異性蛋白固定化部5產生的可以發光的物質，反應結束後的標記物是指例如通過顯色反應顯色後的標記物，標記物產生的反應物是指例如標記物為酶的場合，該標記物通過在固定化的特異性蛋白固定化部5上加入基質等顯色後的物質。作為該標記物保持部位3上保持的標記試劑，使用染料溶膠、水溶性色素、金膠體等金屬溶膠、硒或碳等的非金屬溶膠、鐵氧體等氧化金屬粒子、膠乳等著色粒子或酶等，或者它們以及與分析對象物特異性結合的物質形成的複合體。
另外，圖1的免疫色譜試驗片10的結構是一個例子，只要是進行色譜分析的結構即可，可以採用任何一種結構，使用的構件也可以由任意的載體或試劑構成。
另外，作為免疫色譜試驗片10，可以使用硝基纖維素或玻璃纖維濾紙等由任意多孔性載體構成的色譜材料形成的試驗片。
其次，說明本實施方式1的免疫色譜試驗片10以及色譜分析方法。
在圖1中，如果將液體試樣添加到試樣添加部2上，就會浸透試樣添加部2，達到標記物保持部位3。其次，標記物保持部位3的區域上保持的標記試劑隨液體試樣的浸透溶解，與液體試樣一起向反應層4浸透。反應層4的區域上具備固定有特異性蛋白質的特異性蛋白固定化部5。液體試樣中含有分析對象物時，特異性蛋白質與分析對象物和標記試劑的複合體發生抗原抗體反應，在特異性蛋白固定化部5的區域上可以見到某些顯色反應。液體試樣中不含分析對象物時，不會引起抗原抗體反應，也無法見到顯色反應。最終液體試樣被吸水部6吸收，結束反應。
上述反應結束後，使用任意的檢測儀器，測定顯色區域中來自標記物的信號。試樣為全血時，優選在例如580nm以上的任意波長下進行測定。這樣，可以定性或定量地分析顯色的有無和顯色程度。通過上述分析，可以檢測液體試樣中是否含有分析對象物，並且可以在含有的情況下測定其重量。另外，上述「來自標記物的信號」具體是指其自身是著色物的標記物的顏色、通過UV照射或施加電壓等引起的發光、或顯色反應引起的顯色等。
另外，在測定顯色區域中來自標記物的信號時，除在任意一個波長下測定吸光度或吸光度分布的積分值的場合以外，也可以在具有任意幅的波長區域下測定吸光度，這時用特定的波長區域對吸光度進行積分，也能夠定量分析。
如上所述，按照本實施方式1的免疫色譜試驗片以及色譜分析方法，在例如580nm以上的任意波長下測定免疫色譜試驗片10上顯色區域中來自標記物的信號，導致在分析含有有色成分，特別是含有血液中血色素的試樣時，在血液的吸收波長200～580nm以外的波長下測定顯色程度。因此，可以不受液體試樣中含有的有色成分，特別是血色素導致的背景的影響，定性或定量地測定顯色程度，可以降低測定誤差，可以實現採用更高靈敏度、更高性能的免疫色譜法的定性或定量分析。另外，根據使用的標記試劑也可以通過目視對有色試樣進行色譜定性分析。
另外，在本實施方式1中，以標記物複合體與分析對象物的結合反應、以及該反應體與固定化物的結合反應構成的夾心反應為例說明測定形式，但是也可以通過分析對象物和標記物複合體競爭地與固定化物反應的競爭反應進行測定。
另外，本實施方式1中，試樣為全血時，在580nm以上的任意波長下測定來自標記物的信號，但優選在580nm至700nm之間的任意波長下進行測定。
另外，本實施方式1的色譜分析方法中，作為測定免疫色譜試驗片10的顯色程度的檢測儀器，可以使用例如反射型分光光度計，除與本實施方式1同樣的效果之外，由於支持反應層4的反應層載體支持體1可以使用不透明的材料，因此材料選擇的幅度很寬，而且可以不必注意反應層背面的狀態進行測定。
另外，本實施方式1的色譜分析方法中，作為測定免疫色譜試驗片10的顯色程度的檢測儀器，也可以使用例如透過型分光光度計，除與本實施方式1同樣的效果之外，由於也可以測定反應層4深部的顯色程度，能夠實現更高靈敏度、更高性能的定性或定量分析。另外，作為標記試劑，可以使用低濃度的物質。
另外，本實施方式1中，作為含有有色成分的試樣，特別地使用了血液，但這只是一個實例，也可以對血液以外的含有有色成分的試樣進行分析。例如尿、便潛血、食品的粉碎液等。這時，根據分析的試樣以及分析對象物，有必要選擇標記試劑和特異性蛋白質。也就是說，顯色反應中特異的波長下的吸收係數與相同波長下試樣的吸收係數相比必須充分高。另外，採用檢測儀器測定顯色程度時，在特異的波長下對顯色反應進行測定即可。另外，上述「特異的波長」是指除去有色試樣具有的最大波長區域，任意一個波長或具有任意幅度的廣泛的波長區域。另外，上述「充分高」是指顯色反應產生的來自標記物的信號高到一定程度，對於定性或定量分析能夠得到可以信賴的結果。
以下，參照
本發明實施方式2的免疫色譜試驗片以及色譜分析方法。
圖2表示本發明實施方式2的免疫色譜試驗片10。
圖2中，免疫色譜試驗片10具備反應層載體支持體1、試樣添加部2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白固定化部5、吸水部6和細胞成分破壞物質保持部位7。
反應層載體支持體1由非液體透過性塑料等構成，支持色譜材料。試樣添加部2由吸收性大的無紡布等構成，添加或塗敷液體試樣。標記物保持部位3在無紡布等的上面保持可以溶解的標記試劑。反應層4由硝基纖維素等構成。特異性蛋白固定化部5在反應層4的區域上根據反應形式固定有對抗體或抗原這種分析對象物發生特異性結合反應的特異性蛋白質。吸水部6最終吸收液體試樣。細胞成分破壞物質保持部位7保持破壞細胞成分的物質。上述的試樣添加部2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白固定化部5、吸水部6和細胞成分破壞物質保持部位7均在反應層載體支持體1的上部形成。標記試劑、特異性蛋白質和細胞成分破壞物質有必要根據所分析的試樣以及分析對象物選擇合適的物質。
另外，標記物產生的物質是指例如標記物在特異性蛋白固定化部5產生的可以發光的物質，反應結束後的標記物是指例如通過顯色反應顯色後的標記物，標記物產生的反應物是指例如標記物為酶的場合，該標記物通過在固定化的特異性蛋白固定化部5上加入基質等發生顯色後的物質。作為該標記物保持部位3上保持的標記試劑，使用染料溶膠、水溶性色素、金膠體等金屬溶膠、硒或碳等的非金屬溶膠、鐵氧體等氧化金屬粒子、膠乳等著色粒子或酶等，或者它們以及與分析對象物特異性結合的物質形成的複合體。
另外，作為細胞成分破壞物質保持部位7保持的細胞成分破壞物質，使用氯化鈉或氯化鉀等氯化物、Triton類或吐溫類等非極性表面活性劑、極性表面活性劑或皂甙類等。
另外，圖2的免疫色譜試驗片10的結構是一個例子，只要是包括細胞成分破壞物質保持部位7、進行色譜分析的結構即可，可以採用任何一種結構，使用的構件也可以由任意的載體或試劑構成。
另外，作為免疫色譜試驗片10，可以使用硝基纖維素或玻璃纖維濾紙等由任意多孔性載體構成的色譜材料形成的試驗片。
其次，說明本實施方式2的免疫色譜試驗片10以及色譜分析方法。
在圖2中，如果將液體試樣添加到試樣添加部2上，就會浸透試樣添加部2，達到細胞成分破壞物質保持部位7的區域，通過該區域含有的細胞成分破壞物質的作用，破壞液體試樣中的細胞成分。該細胞成分被破壞的液體試樣達到標記物保持部位3。其次，標記物保持部位3的區域上保持的標記試劑隨液體試樣的浸透溶解，與液體試樣一起向反應層4浸透。反應層4的區域上具備固定有特異性蛋白質的特異性蛋白固定化部5。液體試樣中含有分析對象物時，特異性蛋白質與分析對象物和標記試劑的複合體發生抗原抗體反應，在特異性蛋白固定化部5的區域上可以見到某些顯色反應。液體試樣中不含分析對象物時，不會引起抗原抗體反應，也無法見到顯色反應。最終液體試樣被吸水部6吸收，結束反應。
上述反應結束後，使用任意的檢測儀器，測定顯色區域中來自標記物的信號。試樣為全血時，優選在例如580nm以上的任意波長下進行測定。這樣，可以定性或定量地分析顯色的有無和顯色程度。通過上述分析，可以檢測液體試樣中是否含有分析對象物，並且可以在含有的情況下測定其重量。另外，上述「來自標記物的信號」具體是指其自身是著色物的標記物的顏色、通過UV照射或施加電壓等引起的發光、或顯色反應引起的顯色等。
另外，在測定顯色區域中來自標記物的信號時，除在任意一個波長下測定吸光度或吸光度分布的積分值的場合以外，也可以在具有任意幅的波長區域下測定吸光度，這時用特定的波長區域對吸光度進行積分，也能夠定量分析。
如上所述，按照本實施方式2的免疫色譜試驗片以及色譜分析方法，在例如580nm以上的任意波長下測定免疫色譜試驗片10上顯色區域中來自標記物的信號，導致在分析含有有色成分，特別是含有血液中血色素的試樣時，在血液的吸收波長200～580nm以外的波長下測定顯色程度。因此，可以不受液體試樣中含有的有色成分，特別是血色素導致的背景的影響，定性或定量地測定顯色程度，可以降低測定誤差，可以實現採用更高靈敏度、更高性能的免疫色譜法的定性或定量分析。
另外，通過設置保持有破壞細胞成分的物質的部分，分析含有細胞成分的液體試樣時，細胞成分被破壞，反應層4上的浸透變得順利，可以縮短測定時間，更準確地進行定量分析。另外，對於血液等具有細胞成分的試樣，不需要離心分離等預處理，因此還具有降低成本和提高操作性的效果。
另外，根據使用的標記試劑也可以通過目視對有色試樣進行色譜定性分析。
另外，在本實施方式2中，以標記物複合體與分析對象物的結合反應、以及該反應體與固定化物的結合反應構成的夾心反應為例說明測定形式，但是也可以通過分析對象物和標記物複合體競爭地與固定化物反應的競爭反應進行測定。
另外，本實施方式2中，試樣為全血時，在580nm以上的任意波長下測定來自標記物的信號，但優選在580nm至700nm之間的任意波長下進行測定。
另外，本實施方式2的色譜分析方法中，作為測定免疫色譜試驗片10的顯色程度的檢測儀器，可以使用例如反射型分光光度計，除與本實施方式2同樣的效果之外，由於支持反應層4的反應層載體支持體1可以使用不透明的材料，因此材料選擇的幅度很寬，而且可以不必注意反應層背面的狀態進行測定。
另外，本實施方式2的色譜分析方法中，作為測定免疫色譜試驗片10的顯色程度的檢測儀器，也可以使用例如透過型分光光度計，除與本實施方式2同樣的效果之外，由於也可以測定反應層4深部的顯色程度，能夠實現更高靈敏度、更高性能的定性或定量分析。另外，作為標記試劑，可以使用低濃度的物質。
另外，本實施方式2中，作為含有有色成分的試樣，特別地使用了血液，但這只是一個實例，也可以對血液以外的含有有色成分和細胞成分的試樣進行分析。例如體液、含有細菌的液體、食品的粉碎液等。這時，根據分析的試樣以及分析對象物，有必要選擇標記試劑和抗體。也就是說，顯色反應中特異的波長下的吸收係數與相同波長下試樣的吸收係數相比必須充分高。另外，採用檢測儀器測定顯色程度時，在特異的波長下對顯色反應進行測定即可。另外，上述「特異的波長」是指除去有色試樣具有的最大波長區域，任意一個波長或具有任意幅度的廣泛的波長區域。另外，上述「充分高」是指顯色反應產生的來自標記物的信號高到一定程度，對於定性或定量分析能夠得到可以信賴的結果。
通過在0.01％氯化金酸的回流中的100℃溶液中加入1％檸檬酸溶液，製備金膠體。繼續回流30分鐘後，冷卻。用0.2M的碳酸鉀溶液調節為pH9，在上述金膠體溶液中加入抗hCG-α抗體，攪拌數分鐘後，僅以最終達到1％的量加入10％BSA(牛血清白蛋白)溶液pH9，攪拌，配製抗體金膠體複合體(標記抗體)。將上述標記抗體溶液在4℃以20000G離心分離50分鐘，分離標記抗體，將其懸濁在洗滌緩衝液(1％BSA·磷酸緩衝液)中後，進行上述離心分離，洗滌分離標記抗體。將該標記抗體用洗滌緩衝液懸濁，用0.8μm的濾器過濾後，配製成最初金膠體溶液量的10分之1，在4℃下貯藏。
將上述標記抗體溶液裝入溶液排出裝置，塗敷在抗hCG-β抗體固定化乾燥膜上離開抗體固定化位置的位置上後，將膜乾燥。這樣，在固定化膜上得到標記抗體保持部位。
將這樣製備的包括標記抗體保持部位的抗體固定化膜貼付在反應層載體支持體上，浸漬作為溶血劑的表面活性劑後，增添乾燥的無紡布作為試樣添加部，增添玻璃纖維濾紙作為吸水部，切成0.5cm寬的細片，製得試驗片。
將含有0、100、1000、10000U/l的hCG的血液(血細胞比容值為45％)添加到試驗片上進行展開處理。對於各種hCG濃度的血液用反射型分光光度計測定試驗片上抗體固定化部的顯色狀況。測定520nm和610nm的波長下的吸光度，代入預先製成的表示hCG濃度與吸光度的關係的標準曲線。其結果如圖3。例如測定本來含有1000U/l hCG的血液的吸光度，將該吸光度代入標準曲線，hCG濃度應當是1000U/l，但實際上會有一些偏差。根據這種偏差的大小可以得知其測定的準確程度。
圖3表示色譜定量測定中在520nm的波長下測定吸光度時(a)與在610nm的波長下測定吸光度時(b)的定量性能。橫軸表示添加到試驗片上的試樣的hCG濃度。縱軸表示將試驗片上顯色區域中來自標記物的信號代入標準曲線求得的抗原濃度的換算值。
以下，說明色譜定量測定中在580nm以下的波長下進行測定時以及在580nm以上的波長下進行測定時的效果。
在圖3中，表示將液體試樣添加到免疫色譜試驗片上，以5分鐘後顯色程度的測定值為基礎，換算分析對象物的濃度得到的結果。這時使用的標記試劑在(a)、(b)中使用相同的抗體-金膠體複合體。首先，在610nm測定時(圖3(b))，CV值(變動係數)為0～15％，而在520nm測定時(圖3(a))，受血色素的影響，CV值為35～45％，顯示較大的偏差，定量性能差。
在本實施例中，使用金膠體作為標記物對結果進行說明，金膠體優選在580nm以上的波長下具有吸收的粒徑。另外，除此之外的標記物如果是著色粒子或水溶性色素，優選在著色的色素的最大吸收波長下進行測定，例如如果是青色粒子或青色色素，在650nm附近的波長下進行測定，如果是炭黑，在580nm以上的任意波長下進行測定，測定波長根據其反應顯色物具有的吸收波長確定。
工業實用性本發明利用抗原抗體反應為了定性或定量分析液體試樣進行色譜分析時，通過使標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數，可以對血液等有色試樣不進行預處理而直接進行分析。
權利要求
1.對有色試樣中含有的分析對象物進行定性或定量分析時使用的免疫色譜試驗片，其特徵在於標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
2.對有色試樣中含有的分析對象物進行定性或定量分析時使用的免疫色譜試驗片，其特徵在於反應結束後的標記物或標記物產生的反應物具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
3.根據權利要求1或2記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於上述試樣為血液的場合，在上述試驗片上產生顯色時，特異性吸收波長為580nm以上。
4.根據權利要求1至3中任意一項記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於具有保持破壞上述試樣中所含細胞成分的物質的區域。
5.根據權利要求4記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於破壞細胞成分的物質包括無機物、表面活性劑或皂甙類。
6.根據權利要求5記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於上述無機物包括氯化物。
7.根據權利要求5記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於上述表面活性劑包括非極性表面活性劑。
8.根據權利要求1至7中任意一項記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於採用分光光度計定性或定量分析顯色程度。
9.根據權利要求1至8中任意一項記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於上述標記物包括選自金屬溶膠、氧化金屬粒子、非金屬溶膠、染料溶膠、著色粒子、色素或酶中的至少一種。
10.根據權利要求1至9中任意一項記載的免疫色譜試驗片，其特徵在於上述分析對象物包括血漿蛋白質、細菌、病毒中至少一種。
11.使用免疫色譜試驗片的色譜分析方法，其特徵在於在上述免疫色譜試驗片上添加含有分析對象物的有色試樣，在上述顯色時的特異性吸收波長下測定上述試驗片上的顯色程度，標記物自身或標記物產生的物質具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的有色試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比有色試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
12.使用免疫色譜試驗片的色譜分析方法，其特徵在於在上述免疫色譜試驗片上添加含有分析對象物的有色試樣，在上述顯色時的特異性吸收波長下測定上述試驗片上的顯色程度，反應結束後的標記物或標記物產生的反應物具有下述波長區域，即具有與含有分析對象物的試樣的吸收波長不同的吸收波長，或者即使吸收波長相同但是具有比試樣的吸收係數充分高的吸收係數。
13.根據權利要求11或12所述的色譜分析方法，其特徵在於上述試樣為血液的場合，通過在580nm以上的任意波長下測定顯色區域中來自標記物的信號，對分析對象物進行定性或定量分析。
14.根據權利要求11至13中任意一項記載的色譜分析方法，其特徵在於上述免疫色譜試驗片具有保持破壞試樣中所含細胞成分的物質的區域。
15.根據權利要求14記載的色譜分析方法，其特徵在於破壞細胞成分的物質包括無機物、表面活性劑或皂甙類。
16.根據權利要求15記載的色譜分析方法，其特徵在於上述無機物包括氯化物。
17.根據權利要求15記載的色譜分析方法，其特徵在於上述表面活性劑包括非極性表面活性劑。
18.根據權利要求11至17中任意一項記載的色譜分析方法，其特徵在於採用分光光度計定性或定量分析顯色程度。
19.根據權利要求11至18中任意一項記載的色譜分析方法，其特徵在於上述標記物包括選自金屬溶膠、氧化金屬粒子、非金屬溶膠、染料溶膠、著色粒子、色素或酶中的至少一種。
20.根據權利要求11至19中任意一項記載的色譜分析方法，其特徵在於上述分析對象物包括血漿蛋白質、細菌、病毒中至少一種。
全文摘要
目的在於提供一種對於血液等含有有色成分的試樣,不需要預處理,並且能夠準確的進行定性或定量分析的免疫色譜試驗片以及色譜分析方法。免疫色譜試驗片10具有保持細胞成分破壞物質的細胞成分破壞物質保持部位7、保持標記試劑的標記物保持部位3、反應層4的區域中固定有特異性蛋白質的特異性蛋白固定化部5,通過使用上述免疫色譜試驗片10,在580nm以上的波長下測定上述反應層4上的顯色程度,進行定性或定量分析。
文檔編號G01N33/569GK1327538SQ00802373
公開日2001年12月19日 申請日期2000年10月25日 優先權日1999年10月25日
發明者高橋三枝, 灘岡正剛, 田中宏橋, 中山浩, 重藤修行, 北脅文久 申請人:松下電器產業株式會社