一種提取分離高純度杯莧甾酮的製備工藝的製作方法

2023-04-27 23:53:21

專利名稱：一種提取分離高純度杯莧甾酮的製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種採用大孔樹脂和高速逆流色譜法分離製備高純度杯莧留酮的工藝。
背景技術：
川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)為覓科杯覓屬多年生草本植物，別名甜膝，主要分布於四川、雲南和貴州，野生或栽培，生長於海拔1500米以上的地區，為著名的川產地道中藥材，是極常用且是重要的出口品種。川牛膝的主要成分為生物鹼、川牛膝主要和含留類化合物、皂苷、多糖和少量異黃酮類以及多種微量元素等化學成分，其中留類化合物包括杯莧留酮、異杯莧留酮、5-表杯莧留酮、羥基杯莧留酮、蛻皮留酮、莧菜留酮A及B、頭花杯莧甾酮、前杯莧甾酮、後甾酮等。黎萬壽等的藥理研究表明，杯莧甾酮對去勢小鼠的體 重和子宮係數有增加趨勢，子宮溼重有顯著增長，提示其為川牛膝的雌激素樣活性的有效成分；杯莧留酮能增加去勢大鼠提肛肌重量，提示其有蛋白質同化作用；實驗結果表明，杯莧甾酮的藥理活性與川牛膝強筋健骨「其滋補之功如牛之多力也」相符，與中醫臨床用藥功能主治基本吻合，可以作川牛膝的對照品。現常採用醇提、氧化鋁柱層析分離等對杯莧留酮進行提取分離，由於生產周期長、製備量小、純度低，難以滿足需要，本發明克服了現有技術的不足，提供了一種提取分離高純度杯覓留酮的製備工藝。高速逆流色譜(HighSpeed Countercurrent Chromatography,簡稱 HSCCC)是國際上於上世紀80年代以來在液-液分配色譜基礎上發展起來的新型分離技術，其分離原理是利用螺旋柱在高速行星運動時產生的巨大離心力，使螺旋柱中互不相容的兩相不斷混合，達到穩定的流體動力學平衡態，此時在螺旋柱中任何一部分，兩相溶劑都反覆進行著混合和靜置的分配過程，這一過程頻率極高，當柱心以SOOrpm旋轉時，頻率超過每秒13次。流動相不斷地穿過固定相，同時保留其中的一相(固定相)，利用橫流泵連續輸入另一相(流動相)，流動相載著溶質(樣品)進入螺旋柱並不斷反覆穿過固定相，使樣品再兩相之間也不斷反覆地進行分批額，由於樣品中各組分再兩相中分配係數不同，導致在螺旋柱中的移動速度不同，因而能使樣品各組分按分配係數的次序，依次得到分離。高速逆流色譜作為一種新型的分配技術，有許多優點是傳統液-固色譜無法比擬的，因而有很廣闊的應用前景。首先，它的流動相、固定相均為液體，不需要固體載體，避免了液-固色譜常會造成的固體載體對樣品的不可逆吸附，可以保證樣品再不損失任何一種組分的情況下得到分離，理論上樣品回收率相當高；其次，它的分離效率高，可以達到幾千個理論塔板數，尤其在天然產物組分分離提取中有較高的分離度，有的樣品經過一次分離就可以得到一個甚至多個單體，並且分離時間也短，一般是幾個小時即可完成一次分離；此夕卜，它使用常規試劑，有廣泛的液-液分配體系可供選擇，體系更換方便、快捷；它的進樣量大，可以從毫克到克量級，進樣體積可達20ml以上，這對於樣品的純化製備顯示出驚人的優勢。

發明內容
本發明的目的是提供一種提取分離高純度杯莧留酮的製備工藝，所得產品杯莧甾酮含量達98%以上。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種提取分離高純度杯莧留酮的製備工藝，其特徵在於將牛膝藥材粉碎過20-50目篩，加入5-10倍量提取溶劑，加熱至60-80°C，提取2_3次，每次1_3小時，合併提取液，減壓回收乙醇，所得提取物用大孔樹脂吸附，先用水洗至色淡，再用60-80%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總留酮浸膏；將總留酮浸膏採用高速逆流色譜分離製備 高純度杯莧留酮，所得產品杯莧留酮含量為98%以上。所述提取溶劑為50-95%的乙醇水溶液。所述大孔樹脂柱分離採用溼法裝柱，洗脫液減壓回收至相對密度I. 15-1. 20 (600C測)。所述高速逆流色譜分配系統為庚烷-甲醇-二氯甲烷或正己烷-乙腈-丙酮，三種組分的體積比為(5-12) (9-12) (1-5)。所述高速逆流色譜恆溫循環器溫度為25_28°C。所述高速逆流色譜流動相的流速為2_5ml/min。所述高速逆流色譜達到動態平衡後，將樣品溶液泵入色譜系統中，同時在出液端接紫外檢測器，在246nm波長處對流出液連續檢測，與杯莧留酮的標準圖譜對應，收集液蒸除溶劑，乾燥即得產品。本發明採用大孔樹脂吸附，處理量大；通過採用合理的溶劑體系、控制主機轉速和流動相流速，可得到高純度的杯莧留酮，整個工藝條件溫和、損失少。
具體實施例方式實施例I :將川牛膝藥材粉碎過50目篩，取Ikg加入8L的70%乙醇加熱提取2次，每次2小時，濾過，合併濾液，減壓濃縮至相對密度I. 19(60°C測)，將濃縮液置於DlOl型大孔吸附樹脂柱中，採用溼法裝柱，用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然後採用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將庚烷-甲醇-二氯甲烷(5 : 11 : 4)系統置於分液漏鬥中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以900r/min轉動，同時將流動相以2. 2ml/min的流速泵入，待流動相從出液端流出且兩相在色譜中達到平衡後，將樣品溶液注入色譜系統中。在246nm波長處對流出液進行連續檢測，與杯莧甾酮的標準圖譜對應，收集杯莧甾酮流出液，用旋轉蒸發儀除去溶劑，乾燥，得到O. 55g杯莧留酮，經HPLC法測定其含量為98.6%。實施例2:將川牛膝藥材粉碎過50目篩，取Ikg加入5L的80%乙醇加熱提取3次，每次3小時，濾過，合併濾液，減壓濃縮至相對密度117 (60°C測)，將濃縮液置於AB-8型大孔吸附樹脂柱中，採用溼法裝柱，用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然後採用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將正己烷-乙腈-丙酮(7 10 5)系統置於分液漏鬥中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以800r/min轉動，同時將流動相以3. Oml/min的流速泵入，待流動相從出液端流出且兩相在色譜中達到平衡後，將樣品溶液注入色譜系統中。在246nm波長處對流出液進行連續檢測，與杯莧留酮的標準圖譜對應，收集杯莧留酮流出液，用旋轉蒸發儀除去溶劑，乾燥，得到O. 58g杯莧留酮，經HPLC法測定其含量為98. 5%。實施例3 將川牛膝藥材粉碎過50目篩，取Ikg加入7L的50%乙醇加熱提取2次，每次I小時，濾過，合併濾液，減壓濃縮至相對密度I. 18(60°C測)，將濃縮液置於DlOl型大孔吸附樹脂柱中，採用溼法裝柱，用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然後採用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將庚烷-甲醇-二氯甲烷(8 : 12 : 3)系統置於分液漏鬥中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以850r/min轉動，同時將流動相以5. Oml/min的流速泵 入，待流動相從出液端流出且兩相在色譜中達到平衡後，將樣品溶液注入色譜系統中。在246nm波長處對流出液進行連續檢測，與杯莧甾酮的標準圖譜對應，收集杯莧甾酮流出液，用旋轉蒸發儀除去溶劑，乾燥，得到O. 63g杯莧留酮，經HPLC法測定其含量為98.7%。實施例4 將川牛膝藥材粉碎過50目篩，取Ikg加入IOL的65%乙醇加熱提取3次，每次I小時，濾過，合併濾液，減壓濃縮至相對密度I. 15 (60°C測)，將濃縮液置於DlOl型大孔吸附樹脂柱中，採用溼法裝柱，用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然後採用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將正己烷-乙腈-丙酮(12 8 I)系統置於分液漏鬥中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以900r/min轉動，同時將流動相以3. 5ml/min的流速泵入，待流動相從出液端流出且兩相在色譜中達到平衡後，將樣品溶液注入色譜系統中。在246nm波長處對流出液進行連續檢測，與杯莧留酮的標準圖譜對應，收集杯莧留酮流出液，用旋轉蒸發儀除去溶劑，乾燥，得到O. 62g杯莧留酮，經HPLC法測定其含量為98. 4%。實施例5 將川牛膝藥材粉碎過50目篩，取Ikg加入6L的75%乙醇加熱提取2次，每次2小時，濾過，合併濾液，減壓濃縮至相對密度I. 20(60°C測)，將濃縮液置於AB-8型大孔吸附樹脂柱中，採用溼法裝柱，用72%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然後採用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將庚烷-甲醇-二氯甲烷(10 : 9 : 2)系統置於分液漏鬥中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以880r/min轉動，同時將流動相以2. 5ml/min的流速泵入，待流動相從出液端流出且兩相在色譜中達到平衡後，將樣品溶液注入色譜系統中。在246nm波長處對流出液進行連續檢測，與杯莧甾酮的標準圖譜對應，收集杯莧甾酮流出液，用旋轉蒸發儀除去溶劑，乾燥，得到O. 54g杯莧留酮，經HPLC法測定其含量為98.9%。實施例6 將川牛膝藥材粉碎過50目篩，取Ikg加入8L的95%乙醇加熱提取2次，每次I. 5小時，濾過，合併濾液，減壓濃縮至相對密度I. 18(60°C測)，將濃縮液置於AB-8型大孔吸附樹脂柱中，採用溼法裝柱，用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然後採用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將正己烷-乙腈-丙酮(9 10 3)系統置於分液漏鬥中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以1000r/min轉動，同時將流動相以4. 4ml/min的流速泵入，待流動相從出液端流出且兩相在色譜中達到平衡後，將樣品溶液注入色譜系統中。在246nm波長處對流出液進行連續檢測，與杯莧甾酮的標準圖譜對應，收集杯莧甾酮流出液， 用旋轉蒸發儀除去溶劑，乾燥，得到O. 60g杯莧留酮，經HPLC法測定其含量為98. 2%。
權利要求
1.一種提取分離高純度杯莧留酮的製備工藝，其特徵在於將牛膝藥材粉碎過20-50目篩，加入5-10倍量提取溶劑，加熱至60-80°C，提取2-3次，每次1_3小時，合併提取液，減壓回收乙醇，所得提取物用大孔樹脂吸附，先用水洗至色淡，再用60-80%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總留酮浸膏；將總留酮浸膏採用高速逆流色譜分離製備高純度杯莧甾酮，所得產品杯莧留酮含量為98 %以上。
2.根據權利要求I所述的製備工藝，其特徵在於所述提取溶劑為50-95%的乙醇水溶液。
3.根據權利要求I所述的製備工藝，其特徵在於所述大孔樹脂柱分離採用溼法裝柱，洗脫液減壓回收至相對密度I. 15-1. 20(60°C測)。
4.根據權利要求I所述的製備工藝，其特徵在於所述高速逆流色譜分配系統為庚烷-甲醇-二氯甲烷或正己烷-乙腈-丙酮，三種組分的體積比為(5-12) (9-12) (1-5)。
5.根據權利要求I所述的製備工藝，其特徵在於所述高速逆流色譜恆溫循環器溫度為 25-28 0C o
6.根據權利要求I所述的製備工藝，其特徵在於所述高速逆流色譜流動相的流速為.2-5ml/min。
7.根據權利要求I所述的製備工藝，其特徵在於所述高速逆流色譜達到動態平衡後，將樣品溶液泵入色譜系統中，同時在出液端接紫外檢測器，在246nm波長處對流出液連續檢測，與杯莧留酮的標準圖譜對應，收集液蒸除溶劑，乾燥即得產品。
全文摘要
本發明涉及一種提取分離高純度杯莧甾酮的製備工藝，其特徵在於將川牛膝藥材粉碎，加入適量溶劑提取，濾過，濃縮，濃縮液先後採用大孔吸附樹脂柱層析及高速逆流色譜技術進行分離製備高純度的杯莧甾酮。本發明分離效果好、樣品損失少、無汙染、高效快速，工藝穩定，可大製備量分離杯莧甾酮，獲得的杯莧甾酮純度可達98％以上。
文檔編號C07J17/00GK102649803SQ20111004528
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月25日 優先權日2011年2月25日
發明者劉東鋒, 李法慶 申請人:蘇州寶澤堂醫藥科技有限公司