移植物抗宿主病的抑制的製作方法
2023-04-27 19:15:16
專利名稱：移植物抗宿主病的抑制的製作方法
發明範圍本發明涉及用於醫學治療的細胞成分，其製備方法及其在醫學治療中的用途。更特別地，本發明涉及在哺乳動物類患者，特別是人類患者中，用於減輕稱作移植物抗宿主病的同種異體(allogeneic)骨髓移植術後併發症的細胞成分，以及製備這種成分物質的方法。
移植物抗宿主病，GVHD，是一種免疫疾病，是限制為治療無法治癒的血液系統惡性疾病的一些類型，如白血病，所使用的同種異體骨髓或幹細胞移植(在此均指allo-BMT)成功和施行的主要因素。GVHD是一個全身性炎症反應，可導致宿主慢性疾病的產生和死亡。目前，同種異體移植總是冒著伴隨GVHD的嚴重危險，即使供體與宿主具有很高的組織相容性。
GVHD由供體T-細胞與全身分布的不相容的宿主抗原相反應所致，引起強烈的炎症。在GVHD中，識別供體與宿主間差異的供體成熟T-細胞全面激活。目前防止和治療GVHD的方法包括給予藥物如環孢菌素-A和皮質激素。這些有嚴重的副作用，必須長時間給藥且對於給藥和監控很昂貴。也曾試圖應用T細胞消耗以防止GVHD，但這需要複雜和昂貴的設備和專業技術。T-細胞過度消耗導致嚴重的問題，骨髓幹細胞灌輸失敗、造血重建失敗、感染或復發。過多限制的T-細胞消耗殘留下的細胞仍能夠啟動GVHD。其結果，目前治療GVHD的方法僅在有限的供體和宿主結合中取得成功，以致不能給許多病人提供有效的挽救生命的治療。
本發明的目的是提供一種減輕接受同種異體-BMT的哺乳動物類患者GVHD併發症形成的方法。
相應的，本發明的一個方面提供了一種哺乳動物類患者減輕骨髓性疾病並減輕因此而發生的移植物抗宿主病(GVHD)的治療方法，它包括給予患者同種異體造血幹細胞和同種異體T-細胞，至少部分上述T-細胞在給予患者前體外接受了氧化應激，以誘導其中細胞因子生成狀態的改變和增殖反應的減小。
本發明的另一個方面提供了一種哺乳類T-細胞群，特別是不含幹細胞，所述的T-細胞在體外接受了氧化應激，在所述細胞內誘導細胞因子生成狀態的改變和增殖反應的減小。
本發明進一步提供了一種製備給予患骨髓性疾病病人的同種異體細胞群的方法，它包括在體外使富含在T-細胞內的供體細胞群接受氧化應激，以在所述T-細胞內誘導細胞因子生成狀態的改變和增殖反應的減小。
圖3是對下面的實例4所得結果的描述。
優選實例的描述本發明的方法涉及最初從供體中採集造血幹細胞和T-細胞。這種細胞的優選來源是動員的供體外周血幹細胞和T-細胞。外周血中的幹細胞數量非常少，根據本發明的一個優選的操作方法是濃集供體外周血的幹細胞群，然後提取供體的外周血作為幹細胞和T細胞的來源，用上述的方法進行治療，然後注入患者體內。在從供體中提取外周血前，給供體注射一個療程的適當生長因子，連續幾天，如5天，可達到濃集的目的。通過一個已知的程序，白細胞分離置換可從血中收集到合適的細胞部分，提取時，血漿和紅細胞在一個密閉的流式系統中回到供體體內。含有幹細胞(大約3％)和T細胞(大約40％)，以及B細胞，中性粒細胞和其他白細胞的白細胞收集液，可被處理以改變其中T細胞細胞因子的產生狀態和減小增殖反應，然後根據本發明，作為細胞(外周血單核細胞)的整體採集注入到宿主體內。然而，供體T-細胞首選地從其它細胞中分離，使得僅有T-細胞接受氧化應激並給予患者，而給患者注入的幹細胞與處理的T細胞分開。但是，在實際應用中，外周血單核細胞收集液對應激物的反應是滿意的，無需進一步分離以游離T-細胞，這是一個困難而昂貴的步驟。特別優選分別給予幹細胞。
如果因某原因需要將整個白細胞收集部分進行氧化應激，以在其中的T-細胞部分內誘導前述的改變，然後將整個部分輸給患者，優選的防止幹細胞受到氧化應激任何損害效應的方法如下所述。
在一個可供選擇，但非優選的方法中，供體的整體骨髓可被用作本發明方法的T-細胞和幹細胞來源。在過去，整體骨髓是同種異體骨髓移植方法通常的細胞來源，也確實可用在本發明方法中。然而，這對供體是一個不方便和不適的方法，需要麻醉和較長的抽提過程。原則上，供體的任何T-細胞和幹細胞來源均可用，但富含幹細胞和T-細胞的外周血在臨床上是最方便的。
在本發明方法中T-細胞內誘導的細胞因子生成狀態的改變優選炎症細胞因子生成的減少，如幹擾素-γ和組織壞死因子-α。
氧化應激可通過將T-細胞置於氧化環境而實施，如添加氣態、液態或固態的化學氧化劑(臭氧、分子氧、臭氧/氧混合氣、高錳酸鹽、高碘酸鹽、過氧化物、通過氧化機製作用於生物系統的藥物，如阿黴素，以及類似物)。根據本發明的一個優選方法，懸液狀態的T-細胞接受氣態氧化劑，如臭氧/氧混合氣泡通過細胞懸液，可選擇與同時對細胞進行適當劑量的紫外照射相結合。
根據本發明的一個方法，對來自供體的同種異體白細胞，包括幹細胞和T-細胞，進行氧化應激。這消除了將T-細胞與白細胞組份中的其它細胞成分分開所需要的複雜和費錢的步驟。但是，這種情況下，特別優選的是要防止組份中的幹細胞受到應激的有害影響。這可通過在接受應激時，在細胞組份中含有一種或多種幹細胞生長因子而實現。氧化應激對幹細胞的有害作用可通過生長因子存在而得到防護，因此，在幹細胞-T-細胞組分接受氧化應激前，一種或多種幹細胞生長因子被加進組分中。用在方法中的幹細胞生長因子是在此應激過程中促進幹細胞(而非T-細胞)生存的細胞因子。它們是與幹細胞上生長受體相作用的細胞因子。它們被確信可激活細胞的MAP-激酶通路，導致erk活化。這種適合的生長因子的實例包括幹細胞特異的生長因子、kit-配體、IL-3、GM-CSF和FLT3配體，它們均是已知的。優選添加精確劑量的提取和純化的生長因子，或特別是市場上可買到的重組生長因子，或兩者結合，適當地溶解或懸浮於適宜的、生物學可接受的液體中。
根據本發明的一個給同種異體T-細胞氧化應激的優選方法包括，將細胞懸液置於醫用級的氧氣和臭氧中，例如含有臭氧作為較小成分的醫用級氧氣流沸泡經過細胞懸液。懸浮介質可以是任何通用的生物學可接受的媒介，它保持細胞處於有活力的狀態。臭氧氣可由本領域內已知的傳統來源提供。氣流中適合的臭氧含量約為1.0-100μg/ml，優選3-70μg/ml，最優選約為5-50μg/ml。給予液體中的氣流速度為每分鐘大約0.01-2升，優選每分鐘0.05-1.0升，最優選每分鐘大約0.06-0.30升(STP)。
另一個給予T-細胞氧化應激使之適合在本發明中使用的方法，是在細胞懸液中加入生物學可接受的劑量的適當的生物學可接受的化學氧化劑。高錳酸鹽、高碘酸鹽和過氧化物在適量使用時是適合的。為實用的原因，過氧化氫在顯示本發明方法的有效性和指導所用氧化劑的合適劑量中是有用的，儘管它不是本發明的首選藥物。因此，適合的氧化劑劑量是濃度從1mmol到2mmol的過氧化氫，與含10-6-10-8細胞/ml的細胞懸液10ml接觸20分鐘，或來自不同氧化劑的相當的氧化應激。最佳的是約1mmol過氧化氫在上述懸液中約20分鐘，或計算給予細胞相應氧化應激程度的相當的另一個氧化劑。
要接受氧化應激的細胞懸液的體積通常從大約0.1ml到大約1000ml，優選大約1-500，含有隨後給予進行同種異體-BMT病人的適合數量的T-細胞。這些數量通常與以前的方法中同種異體-BMT相關的同種異體T-細胞輸入所需的數量相當，為本領域內的工作人員所熟知。
根據本發明的一個特殊方法是，細胞懸液同時接受氧/臭氧氣泡經過和紫外照射。這也對T-細胞特性造成適當改變。必須注意不要採用過高劑量的氧/臭氧或UV，以免造成細胞膜破壞，或對大量細胞造成不可逆的損傷。
T-細胞懸液接受氧化應激的溫度看起來不嚴格，只要它保持懸液處於液相，並且不太高以致使細胞膜破壞。溫度應當不高於大約45℃。
當紫外照射與氧/臭氧氧化應激因素一起使用時，應當在來自合適的UV射線源處理下，通過照射懸液而合理使用，同時液體保持在前述的溫度，並且氧/臭氧混合氣同時通過液體。紫外射線可由本領域內已知的任何傳統來源提供，例如通過一組低壓紫外燈。優選使用標準的紫外照射UV-C源，也就是說UV燈主要在C段波長發射，即短於大約280nm的波長。相對於標準UV-A和UV-B源的紫外照射也可使用。優選應用的是低壓紫外燈，其產生的光譜中至少90％的射線波長為大約254nm。與前述溫度和氧化應激因素一起使用的這種UV射線的適合劑量，是從輸出能量為約5至約25瓦的燈獲得的，優選地大約5-約10瓦，在所選的波長下，置於盛有液體的樣本容器周圍。每個這種燈在1米距離下可提供大約每平方米40-80毫瓦的能量強度。圍繞著樣本容器的數個燈，在最大強度下工作是可方便地使用的，其在254nm處的結合輸出大約為15-40瓦，優選地20-40瓦。在液體的入射表面，3分鐘的照射時間內，UV能量可提供約0.25-4.5j/cm2，優選0.9-1.8j/cm2。這種處理可提供一種根據本發明適當修飾，準備注射給病人的懸液。
液體接受應激因素的時間可從數秒到大約60分鐘。通常在約0.5-60分鐘範圍內。這在一定程度上依賴於選擇的UV照射強度、溫度和應用於液體的氧化劑濃度和速度。一旦其他應激因素水平被設置，對操作人員來講，進行一些試驗以確定最適時間和劑量可能是必要的。在大多數應激因素條件下，優選的時間在大約0.5-10分鐘範圍內，最優選的為2-5分鐘，通常在3分鐘左右。
在實施本發明的一個優選方法時，細胞懸液可用氧/臭氧混合氣處理，也可選擇地用美國專利4,968,483 Mueller中描述的儀器一起進行UV照射。懸液置於一合適的、消毒的、可透射UV-輻射的容器內，然後安裝進儀器中。通過應用合適的熱源，如一個紅外線燈，將液體的溫度調整到預先確定的值，如42.5±1℃，在氣流用於液體以提供氧化應激之前，打開UV燈一段固定的時間以使UV燈的輸出得以穩定。已知組份和控制流速的氧/臭氧混合氣以預先確定的0.5-60分鐘給予液體，如上所述，優選地1-5分鐘，更優選地大約3分鐘。以此方式，懸液根據本發明被適當地修飾足以獲得所期望的減輕或防止GVHD的作用。
從另一個方面，本發明的優選實例可被看作是通過體外應激T-細胞在給予病人之前處理同種異體T-細胞的方法，它包括給予T-細胞諸如臭氧和臭氧/氧暴露的氧化應激。從本發明方法中得到的經處理的同種異體T-細胞對GVHD的形成和發展具有直接的作用。在注入宿主患者之前，根據本發明方法預先處理的供體T-細胞已被修飾，因而不再具有有害的反應。他們產生炎性細胞因子反應的能力被降低了。例如它們分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力，以及對標準分裂素的增殖反應被減小了。因此他們不再對不相容的全身分布的宿主組織相容性抗原產生任何程度的反應而造成炎症。給予病人的同種異體幹細胞可繼續進行灌輸而成功的機會提高。一段時間以後，處理的T-細胞大多恢復其增殖能力和免疫反應功能，但仍對不同的宿主組織相容性抗原相當不反應(耐受)。
為說明起見，本發明在下面的特殊實例中被進一步描述。最佳實例的具體描述哺乳動物的脾提供了一個方便、易得的細胞來源，特別是T-細胞，也包括小量的幹細胞，在為實驗目的的動物模型中是特別有用的。
為獲得應用本發明方法的指徵進行的試驗採用SCID小鼠的急性GVHD模型。來源於C57B1/6J(B6)小鼠的T-細胞被靜脈注射給接受亞致死量照射的CB-17SCID小鼠。後者先天性淋巴細胞減少，且由於其主要組織相容性位點(MHC)完全不一致而為供體細胞提供了強烈的刺激。在此模型中，宿主小鼠的平均生存時間是14天。GVHD表現為抑制宿主從照射中恢復造血；T-細胞膨脹而用Vβ3鏈形成其T-細胞受體複合物(TCR’s)；供體T-細胞自發分泌幹擾素-γ和TNF-α；和供體T-細胞在脾紅質中的異常分布。如果供體骨髓與T-細胞共同注射，則形成慢性GVHD。實例1來自C57B1/6J(B6)小鼠的脾細胞在α-MEM、2ME和10％小牛血清(FCS)中懸浮至密度為107/ml。FCS含有細胞因子和生長因子。細胞懸液在42.5℃接受UV-C燈253.7nm波長的紫外照射，同時14-15mcg/ml臭氧/醫用級氧的混合氣沸泡通過懸液。處理進行3分鐘。
處理後即刻，細胞僅有約10％的活力。實例2除細胞懸浮在100％FCS中以外，基本重複了實例1的試驗。在此情況下，細胞的即刻生存是50-60％，表明FCS中存在的因子對至少部分細胞具有保護作用。實例3懸浮在100％FCS中的B6鼠脾細胞接受了UV-氧化-熱處理。在42.5℃下，細胞懸液接受253.7nm波長的UV-C燈紫外照射，同時14-15mcg/ml臭氧/醫用級氧的混合氣沸泡通過懸液。處理進行3分鐘。不同數量注射入經亞致死量照射的CB-17 SCID小鼠內。它們隨後的表現與接受同樣數量未經處理的B6脾細胞者相比。
圖1是這些實驗結果的圖解說明，其中每一組中動物的生存％繪製為縱坐標，對應注射處理的和未處理的細胞後的天數。與未處理的細胞相對，當使用經處理的細胞時，在所有的劑量水平生存均有顯著的改善，顯示本發明的方法減輕GVHD的可能性。
圖2是同一實驗中，對應於GVHD誘導後天數的每個脾供體細胞數量的繪製圖。它顯示處理的供體T-細胞在宿主小鼠內生存和數量擴大，儘管同對照、未處理的B6 T-細胞相比程度非常有限。實例4通過注射供體細胞(處理的和未處理的)在小鼠啟動GVHD後6天，供體T-細胞經密度梯度離心法從SCID脾細胞中分離出來。細胞內細胞因子染色根據Ferrick,D.A.等在NATURE373225,257,1995中發表的方法進行。在注射B6脾細胞後第8天對脾細胞懸液進行染色。在存在布雷費的菌素-A的情況下，用植物細胞凝集素和伊屋諾黴素體外刺激後4小時，並選擇了CD4+和CD8+後進行細胞因子生成的測定。結果用細胞內流式細胞儀檢測並在附圖3中描述。記錄每個象限內每種細胞的百分數。附圖顯示，如實例1所描述的被應激的T-細胞同未處理的和對照細胞相比，炎症細胞因子幹擾素-γ(INF)和組織壞死因子-α(TNF)水平顯著降低，右象限較低。實例5CD4+對CD8+T-細胞正常比例(通常為大約2∶1)的反轉已知是伴隨於GVHD的。按Ferrick,D.A.等在NATURE 373225,257,1995中發表的方法進行的細胞內細胞因子染色和採用抗CD4和CD8三色抗體，測定CD4/CD8的比例。未處理的供體脾細胞在注入經亞致死量照射的小鼠後，正常比例的反轉得到證實。對未應激的B6和C3H供體T-細胞，在許多動物患了GVHD的第13天，CD4/CD8的最初比例分別從1.3±0.2和2.2±0.3降低到0.33±0.05和0.9±0.1。相反，當供體細胞用如實例1所述的應激因素預先處理時，該比例在所有的時間仍大於1且缺少GVHD的臨床表現。實例6本實例單獨採用氧化應激說明本發明的原理，該氧化應激由一有效的化學氧化劑過氧化氫提供，並代表了許多其它的、可能生物學更適合的化學氧化劑。
人外周血單核細胞PBMCs是含約40％T-細胞的血白細胞集合液，通過與不同濃度的過氧化氫水溶液接觸20分鐘而被應激。測定其即刻的生存和即刻植物血凝素(PHA)反應。然後測定其24小時後的生存，隨後測定其7天後的PHA反應(用PHA進行致有絲分裂刺激後的氚化胸苷攝取)和細胞因子狀態。結果列於下表。
表
這些結果表明單獨接受氧化應激的T-細胞發生增殖反應下降和炎症細胞生成減少，適用於本發明。
權利要求
1．一種製備同種異體細胞群的方法，所述同種異體細胞群用於給予患有通過骨髓移植術而可能治療的骨髓疾病的病人，該方法包括體外給予富含T-細胞的供體細胞群以氧化應激，在所述的T-細胞內，誘導改變的細胞因子生成狀態和減小增殖反應。
2．根據權利要求1的方法，其中通過提供臭氧/氧氣混合氣而給與氧化應激。
3．根據權利要求2的方法，其中的臭氧/氧氣混合氣是以大約每分鐘0.01-2升的速率沸泡所述的含有T-細胞的細胞群的水性懸液。
4．根據權利要求2或3的方法，其中臭氧/氧氣混合氣的臭氧含量大約為1.0-100μg/ml。
5．根據權利要求2的方法，其中臭氧/氧氣混合氣以大約每分鐘0.05-1.0升的速率沸泡所述含有T-細胞的細胞群的水性懸液，混合氣的臭氧含量大約為3-70μg/ml。
6．根據前述的任一項權利要求的方法，其中給予含有T-細胞的細胞群額外的UV照射。
7．根據權利要求6的方法，其中含有T-細胞的細胞群同時接受氧化應激和UV照射。
8．根據權利要求7的方法，其中的UV照射是UV-C。
9．根據權利要求7或8的方法，其中同時接受氧化應激和UV照射的時間是0.5-60分鐘。
10．根據權利要求9的方法，其中所述的時間是2-5分鐘。
11．根據前述的任一項權利要求的方法，其中含有T-細胞的細胞群是通過白細胞分離置換法從人外周血中獲得的人白血細胞成分。
12．根據權利要求11的方法，其中含有T-細胞的細胞群是來自人外周血單核細胞成分。
13．根據權利要求1的方法，其中氧化應激是通過在所述的富含T-細胞的供體細胞群懸液中加入一種化學氧化劑而給予的。
14．根據權利要求13的方法，其中富含T-細胞的供體細胞群是來自人血的外周血單核細胞成分。
15．一種治療哺乳類病人方法，該方法用於減輕通過骨髓移植術而可能治療的骨髓疾病，並減輕必然發生的移植物抗宿主病，包括給予病人同種異體造血幹細胞和同種異體T細胞，在給予病人之前，至少一部分所述的T細胞在體外已接受氧化應激，以誘導其中炎症細胞因子產生的減少和增殖反應的減小。
16．根據權利要求15的方法，其中所述的T細胞與幹細胞是分別給予的。
17．根據權利要求16的方法，其中所述的T-細胞基本上由來自人外周血的外周血單核細胞組成。
18．根據權利要求15、16或17的方法，其中所述的T-細胞已通過在其中應用氧/臭氧混合氣而受到氧化應激。
19．根據權利要求15、16或17的方法，其中所述的T-細胞已通過在其中應用化學氧化劑而受到氧化應激。
20．根據權利要求18或19的方法，其中所述的T-細胞已在接受氧化應激的同時額外地接受了紫外照射。
21．一種基本上不含幹細胞的哺乳類T-細胞群，所述的T細胞已在體外接受了氧化應激以致在所述細胞內誘導炎症細胞因子生成的減少和增殖反應的減小。
全文摘要
哺乳動物類患者為治療骨髓源性疾病而進行的細胞移植治療中產生的移植物抗宿主病,可通過至少將同種異體細胞移植成分中的T－細胞在體外以適當的劑量給予氧化應激而得到預防和減輕,例如用臭氧和氧氣的混合氣泡通過T－細胞懸液。此方法也包括在應用氧化應激的同時用紫外光照射細胞。氧化應激引起T－細胞內炎症因子生成減少和增殖反應減小。
文檔編號A61K35/14GK1314939SQ99810240
公開日2001年9月26日 申請日期1999年7月30日 優先權日1998年7月30日
發明者D·E·斯潘內 申請人:瓦索根愛爾蘭有限公司