人類免疫缺陷病毒抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒的製作方法

2023-04-27 20:21:01

專利名稱：：人類免疫缺陷病毒抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
：本實用新型是涉及生物應用
技術領域：
，本實用新型涉及HIV抗體診斷試劑，特別是涉及一種以納米免疫磁珠技術檢測抗體的免疫層析快速診斷試劑。
背景技術：
：獲得性免疫缺陷綜合症(AcquiredImmunodeficiencysyndrome,AIDS)簡稱愛滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染引起的一種嚴重傳染病。自美國1981年診斷出首例愛滋病患者以來，據最新的WHO數據評估，至2007年底，全球估計共有3300萬愛滋病病毒感染者，中國國內有愛滋病病毒感染者約70萬。愛滋病病毒的傳播途徑主要包括血液傳播、性接觸、毒品注射和母嬰傳播。在人體內的潛伏期平均為710年。HIV感染潛伏期病人沒有明顯的臨床症狀，但具有高度的傳染性。對HIV進行檢測以發現傳染源和切斷傳播途經是防制AIDS最有效的手段。HIV免疫學檢測是最有效和最廣泛使用的方法，HIV抗體篩査是我國法定的的四個血源性篩査項目之一。HIV抗體檢測最常用的試劑為HIV抗體酶聯免疫試劑(ELISA)和膠體金類試劑，採用雙抗原夾心法的第三代HIV抗體診斷試劑盒，靈敏度達到99%以上，特異性大於97%，目前得到廣泛使用。兩類試劑的基本特點如下ELISA試劑需要專用的實驗室和專業人員進行檢驗，操作複雜，但靈敏度更高；膠體金類試劑操作簡便、快速、適於現場檢測，但靈敏度稍低，結果用肉眼直接觀察，會產生誤差，亦不能記錄。納米免疫磁珠是含有鐵元素的超順磁納米顆粒，外面包覆著聚乙烯類高分子物質，並可帶有羧基或氨基，用於和蛋白質分子交聯。免疫磁珠在細胞和大分子分離、純化及診斷上都已得到應用。但在免疫層析診斷試劑上還鮮有運用。美國QuantumDesign公司最新推出了測定層析試紙上微量磁性物質的檢測儀(MICT)，能定量檢測到微量(pg級)的磁性物質，為納米免疫磁珠檢測試劑的研製提供了可能。納米免疫磁珠檢測試劑基本原理如下利用免疫磁珠標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應的配對抗原或抗體，檢測時當樣品中含相應的特異性抗體或抗原時，標記磁珠顆粒和樣品中配體相結合形成複合物，然後在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，聚集在檢測線3納米免疫磁珠檢測試劑基本原理如下利用免疫磁珠標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應的配對抗原或抗體，檢測時當樣品中含相應的特異性抗體或抗原時，標記磁珠顆粒和樣品中配體相結合形成複合物，然後在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，聚集在檢測線上，通過MICT測定檢測線上捕獲磁珠的含量實現結果的判定。和膠體金試類劑相比，免疫磁珠檢測試劑最大的不同在於將標記膠體金改為標記磁珠，檢測結果時用MICT對檢測線上的磁珠含量進行檢測，而不是依靠肉眼去總判定，使結果判定更為精確、靈敏、客觀和便於記錄保存。利用納米免疫磁珠研製HIV抗體檢測快速診斷試劑尚無報導。
發明內容本實用新型是提供一種靈敏度高、特異性強、檢測快速、操作簡便、適合現場檢測和實時記錄保存結果的HIV抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒技術方案如下一種人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒10，其特徵是試紙條(9)由在塑料支撐板(8)—端搭接上樣墊(l)，上樣墊(l)的一端搭接含有標記HIV抗原gp41、gp36的納米免疫磁珠墊(2)，在磁珠墊(2)的一端搭接硝酸纖維素NC膜(3)，NC膜(3)包被有相互分離的gp41檢測線(T1)檢測線(T1)(5)gp36檢測線(T2)(6)和質控線(C)(7)，NC膜(3)另一端搭接吸樣墊(4)組成，將試紙條(9)裝入塑料試劑盒10中構成。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於所述的標記和包被用抗原為重組表達HIV抗原gp41、gp36，亦可再增加或替換為HIV其它特異性抗原gpl60、gpl20、P24及0亞型gp41。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於納米免疫磁珠為含鐵的超順磁乳膠顆粒，直徑為200土50nm，表面富含羧基；塑料支撐板厚度小於0.3mm;NC膜的寬度為35mm;上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於，抗原的包被方法為以0.01MpH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)分別將gp41、gp36抗原配製成lmg/ml、0.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數分別劃線，包被T1、T2線，分別用於檢測gp41、gp36抗體；同時在NC膜上部包被抗HIV抗體作為C線。各包被線之間的距離為5mm,劃線後將NC膜在乾燥間(溫度20-25t:，溼度小於30%)乾燥8-10小時。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於抗原的標記方法為取10mg磁珠，用50mM2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES，pH5.7)配製成1%的磁珠溶液，加入0.5mg水溶性碳二亞胺(EDC)，37°C10min，再加入200ugHIVgp41，gp36融合或混合抗原，37。C孵育2小時，期間不斷搖晃，然後用磁力架吸附磁珠，將緩衝液更換至0.01mPBS(pH7.2)，含O.596牛血清白蛋白(BSA)，0.5%吐溫，完成標記。再用工作液將磁珠配製成0.5mg/ml的溶液，按lml溶液鋪22^112的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置乾燥間(溫度20-25。C，溼度小於30%)乾燥2-4小時，製成納米免疫磁墊。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於，試劑盒的裝配方法為在乾燥室內(溫度20-25°C，溼度小於30%)，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接免疫磁珠墊(搭免疫磁珠墊的1/3)粘貼，在免疫磁珠墊另一側搭接粘貼上樣墊(搭免疫磁珠墊的1/5);在NC膜C線一側搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);最上面貼一層標誌膜，然後用裁剪機將貼好塑料支撐卡切成5mm寬的試紙條，然後將切好的試紙裝入塑料卡，完成試劑盒的組裝。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於，檢測方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試劑盒平放，在上樣墊上加入40ul被檢樣品，然後再加入60-100ul樣品稀釋液(0.01MPBS)，樣品將溶解膠體金並在NC膜上層析，加樣後25—40分鐘內用磁力檢測儀檢(MICT)測試紙條上數據，根據所讀取的數據判定結果。若讀取的數據大於設定的標準值，說明樣品中含有抗HIV抗體，若低於設定的標準值，說明樣品為陰性或含量低於試劑盒的最低檢測限。所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒10是由盒蓋11、盒底20構成，盒蓋ll、盒底20均是採用塑料注塑一體形成的，盒蓋ll、盒底20均是兩個上角為圓弧形狀的長條形狀且其下邊中部設置向上的方形凹陷；盒蓋11的長、寬以試劑條的長、寬配合設置，盒蓋ll為板形，在盒蓋前面左側設置長方形孔為加樣孔13，位於其方形凹陷上方設置多條長、短不同的反應區標示凸起肋12,在盒蓋後面左右兩側各設置一個凸柱15，在凸柱15下方左右兩側縱向各設置兩個凸起板14，在加樣孔13左側縱向設置兩個凸起壓板19，凸起壓板19的高度比凸起板14的高，在方形凹陷兩邊裡側各設置一個凸起壓板18，凸起板18的高與凸起壓板19的高度相同，在左側凸起板14的右側橫向設置一個凸起壓板17，在盒蓋後面的邊緣及凸起板14、凸起壓板17、凸起壓板18、凸起壓板19的邊緣設置多個凸柱16;盒底20的長度要比盒蓋11的長度兩側各要長出盒底翼21，盒底20的寬、高與盒蓋ll的寬、高配合設置，盒底20為板形，盒底20板上設置凸起肋23、凸起斜肋24、帶凹槽凸起肋27、肋28，在凸起肋23、凸起斜肋24、帶凹槽凸起肋27、肋28上設置凸起孔25，在盒底20的左右兩側各設置一個凸起孔22在盒底20的左右兩側帶凹槽凸起肋27和肋28之間縱向各設置兩個凹槽26將切好的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑條4吸樣墊4對應加樣孔13的位置裝入試劑盒10，即得人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒。本實用新型的有益效果如下研製一種HIV抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒。和膠體金類試劑相比，繼承了膠體金類試劑操作簡便、檢測快速和適於現場檢測等優點，但結果用儀器判讀，而不是用肉眼直接觀察，避免了人為誤差，使結果判定更為精確，同時結果可以實時記錄保存。同時用儀器判定結果借鑑了ELISA試劑的特點，使肉眼難以區分的差別能區分出來，同時由於MICT儀器的高靈敏性，使得納米免疫磁珠快速檢測試劑靈敏度提高，達到ELISA試劑的靈敏度。6圖1免疫磁珠試劑條結構示意圖。圖2免疫磁珠檢測試劑塑料盒的盒蓋主視圖。圖3免疫磁珠檢測試劑塑料盒的盒蓋後視圖。圖4免疫磁珠檢測試劑塑料盒的盒底主視圖。附圖符號說明-1:上樣墊2:磁珠墊3:NC膜4:吸樣墊5:gp41檢測線(T1)6:gp36檢測線(T2)7:試紙質控線(C)8:塑料支撐板9:試紙條10:試劑盒；11合生rmntl12:反應區標示凸起肋13加樣孔14:凸起板15:凸柱16:凸柱17:凸起壓板18:凸起壓板19:凸起壓板20:盒底21:盒底翼22:凸起孔23:凸起肋24:凸起斜肋25凸起孔26:凹槽27帶凹槽凸起肋28:肋具體實施方式實施例1:製備人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑條1主要材料1.l重組抗原:HIVgp41、gp36:美國BiotechAtlanticInc(BAI.)產品，用於試劑的包被和標記；納米免疫磁珠法國AdemTech公司產品，直徑200nm，表面為羧基修飾；NC膜:Millipore公司產品;EDC、MES、BSA:Sigma公司產品。其它常用試劑均為分析純試劑。1.2HIV抗體國家參考品(膠體金類)中國藥品生物製品檢定所檢研製。包括20份陽性血清，20份陰性血清，3份靈敏度血清，l份精密度血清。1.3含幹擾物血清包括常見幹擾物高血脂、溶血、黃疸血清各10份,含相關傳染病HAV、HBV、HIV、TP和HP抗體陽性血清各10份，含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿各10份，由本公司在天津地區相關醫院收集驗證並保存，以上血清或血漿經兩種以上ELISA檢測均為HIV抗體陰性血清。1.4臨床血清HIV陰性血清600份，由公司在天津地區相關醫院收集，為門診採集檢驗用血清，經兩種以上ELISA檢測均為HIV抗體陰性血清。HIV陽性血清20份，由公司在相關AIDS專科醫院獲得，確證為HIV抗體陽性血清，已滅活。2方法2.1HIV抗原標記取10mg磁珠，用50mMMES(pH5.7)配製成1%的納米磁珠溶液，加入0.5mg水溶性EDC，37。C10min，再加入200ugHIVgp41，gp36融合或混合抗原，37。C孵育2小時，期間不斷搖晃，然後用磁力架吸附磁珠，將緩衝液更換至0.01mPBS(pH7.2)，含0.5%BSA(牛血清白蛋)，0.5%吐溫20，完成標記。再用工作液(20mM硼酸鹽緩衝液，PH8.5，含1%BSA，0.5%吐溫，5%蔗糖)製成0.5mg/ml的溶液，按lml溶液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置乾燥間(溫度20-25°C，溼度小於30%)乾燥2-4小時，製成納米免疫磁墊，乾燥備用。2.2HIV抗原包被以0.01MpH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)分別將gp41、gp36抗原配製成lmg/ml、0.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數分別劃線，包被T1、T2線，分別用於檢測gp41、gp36抗體。同時在NC膜上部包被抗HIV抗體作為C線。各包被線之間的距離為5mm，劃線後將NC膜在乾燥間(溫度20-25。C，溼度小於30%)乾燥8-10小時，備用。2.3圖1免疫磁珠試劑條結構示意圖，如圖1所示，HIV抗體快速診斷試劑條9的組裝在乾燥室內(溫度20-25°C，溼度小於30%)，取塑料支撐板8，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板8的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接免疫磁珠墊2(搭免疫磁珠墊的1/3)粘貼，在免疫磁珠墊28另一側搭接粘貼上樣墊l(搭免疫磁珠墊的1/5);在NC膜C線一側搭接吸樣墊4(搭吸樣墊的1/10);最上面貼一層標誌膜，膜上標誌gp41檢測線(T1)5、gp36檢測線(T2)6、試紙A質控線(C)7然後用裁剪機將貼好塑料支撐卡切成5mm寬的試劑條，然後將切好的試劑條裝入試劑盒，完成試劑盒的組裝即可。2.4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試劑盒平放，通過加樣孔在上樣墊上加入40ul被檢樣品，然後再加入60-100ul樣品稀釋液(0.01MPBS)，樣品將溶解膠體金並在NC膜上層析，加樣後25—40分鐘內用磁力檢測儀檢(MICT)測試紙條上數據，根據所讀取的數據判定結果。若Tl線讀取的數據大於設定的標準值，說明樣品中含有抗HIV1抗體，若T2線讀取的數據大於設定的標準值，說明樣品中含有抗HIV2抗體，T1或(和)T2大於設定的標準，結果為陽性，若T1和T2都低於設定的標準值，說明樣品為陰性或含量低於試劑盒的最低檢測限。C線作為產品的質控，需大於設定的標準，若小於設定標準，檢測無效，需重新檢測。2.5樣本檢測按檢測方法，用組裝好的試劑對HIV抗體國家參考品(膠體金類)，含幹擾物血清和臨床血清進行檢測。3結果'3.1HIV抗體國家參考品(膠體金類)檢測對國家參考品血清盤進行測試，結果和預期完全一致(表l)，通過國家標準規定。表1本試劑盒對HIV抗體國家參考品(膠體金類)的測試結果tableseeoriginaldocumentpage9傘檢測由MICT儀器測定讀數，設定T1、T2設定值二75.03.2幹擾物血清檢測檢測結果表明本試紙對常見幹擾物高血脂、溶血、黃疸血清檢測均為陰性，對含相關傳染病HAV、HBV、HIV、TP和HP抗體陽性血清檢測均為陰性，對含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿檢測均為陰性。說明對以上物質沒有非特異性反應。3.3臨床樣品試驗對臨床血清的檢測結果見表2:表2:本試劑對臨床血清的檢測結果臨床血清納米免疫磁珠試劑檢測+總數+20020—9591600總數29591620特異性=591/600=98.5%，靈敏度為=20/20=100%;總符合率=611/260=98.實施例2:製備人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒10:圖2免疫磁珠檢測試劑塑料盒的盒蓋主視圖。圖3免疫磁珠檢測試劑塑料盒的盒蓋後視圖。圖4免疫磁珠檢測試劑塑料盒的盒底主視圖。如圖2、圖3、圖4所示，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒10是由盒蓋11、盒底20、人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑條構成，盒蓋ll、盒底20均是採用塑料注塑一體形成的，盒蓋ll、盒底20均是兩個上角為圓弧形狀的長條形狀且其下邊中部設置向上的方形凹陷。盒蓋11的長、寬以試劑條的長、寬配合設置，盒蓋ll為板形，在盒蓋前面左側設置長方形孔為加樣孔13，位於其方形凹陷上方設置多條長、短不同的反應區標示凸起肋12，在盒蓋後面左右兩側各設置一個凸柱15，在凸柱15下方左右兩側縱向各設置兩個凸起板14，在加樣孔13左側縱向設置兩個凸起壓板19，凸起壓板19的高度比凸起板14的高，在方形凹陷兩邊裡側各設置一個凸起壓板18，凸起板18的高與凸起壓板19的高度相同，在左側凸起板14的右側橫向設置一個凸起壓板17,在盒蓋後面的邊緣及凸起板14、凸起壓板17、凸起壓板18、凸起壓板19的邊緣設置多個凸柱16。盒底20的長度要比盒蓋11的長度兩側各要長出盒底翼21，盒底20的寬、高與盒蓋ll的寬、高配合設置，盒底20為板形，盒底20板上設置凸起肋23、凸起斜肋24、帶凹槽凸起肋27、肋28，在凸起肋23、凸起斜肋24、帶凹槽凸起肋27、肋28上設置凸起孔25,在盒底20的左右兩側各設置一個凸起孔22在盒底20的左右兩側帶凹槽凸起肋27和肋28之間縱向各設置兩個凹槽26將切好的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑條9的上樣墊1對應加樣孔13的位置裝入試劑盒10，即得人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒。權利要求1、一種人類免疫缺陷病毒抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒(10)，其特徵是試紙條(9)由在塑料支撐板(8)一端搭接上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端搭接含有標記HIV抗原gp41、gp36的納米免疫磁珠墊(2)，在磁珠墊(2)的一端搭接硝酸纖維素NC膜(3)，NC膜(3)包被有相互分離的gp41檢測線(T1)檢測線(T1)(5)gp36檢測線(T2)(6)和質控線(C)(7)，NC膜(3)另一端搭接吸樣墊(4)組成，將試紙條(9)裝入兩個上角為圓弧形狀的長條形狀的盒蓋(11)、盒底(20)構成的試劑盒(10)中。2、根據權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於所述的標記和包被用抗原為重組表達HIV抗原gp41、gp36，亦可再增加或替換為HIV其它特異性抗原gP160、gpl20、P24及0亞型gp41。3、根據權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於納米免疫磁珠為含鐵的超順磁乳膠顆粒，直徑為200士50nm，表面富含羧基；塑料支撐板厚度小於(X3mm;NC膜的寬度為35咖;上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成。4、根據權利要求i所述的人類免疫缺陷病毒抗體免疫磁珠快速檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒(10)的盒蓋ai)、盒底(20)均是採用塑料注塑一體形成的，盒蓋(11)、盒底(20)均是兩個上角為圓弧形狀的長條形狀且其下邊中部設置向上的方形凹陷；盒蓋(11)的長、寬以試劑條的長、寬配合設置，盒蓋(11)為板形，在盒蓋前面左側設置長方形孔為加樣孔(13)，位於其方形凹陷上方設置多條長、短不同的反應區標示凸起肋(12)，在盒蓋後面左右兩側各設置一個凸柱(15)，在凸柱(15)下方左右兩惻縱向各設置兩個凸起板(14)，在加樣孔(13)左側縱向設置兩個凸起壓板(19)，凸起壓板(19)的高度比凸起板(14)的高，在方形凹陷兩邊裡側各設置—個凸起壓板(18)，凸起板(18)的高與凸起壓板19的高度相同，在左側凸起板(14)的右側橫向設置一個凸起壓板(17)，在盒蓋後面的邊緣及凸起板(14)、凸起壓板(17)、凸起壓板(18)、凸起壓板(19)的邊緣設置多個凸柱(16);盒底(20)的長度要比盒蓋(11)的長度兩側各要長出盒底翼(21)，盒底(20)的寬、高與盒蓋(11)的寬、高配合設置，盒底(20〉為板形，盒底(20板上設置凸起肋(23)、凸起斜肋(24〉、帶凹槽凸起肋(27)、肋(28，在凸起肋(23)、凸起斜肋(24)、帶凹槽凸起肋(27)、肋(28)上設置凸起孔(25)，在盒底(20)的左右兩側各設置一個凸起孔(22)在盒底(20)的左右兩側帶凹槽凸起肋(27)和肋(28〉之間縱向各設置兩個凹槽(26)將切好的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑條(9)的上樣墊(1)對應加樣孔(13)的位置裝入試劑盒(10)，即得人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體納米免疫磁珠快速檢測試劑盒。專利摘要本實用新型是涉及生物應用
技術領域：
，涉及一種運用納米免疫磁珠檢測人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體的快速檢測劑盒。檢測時將被檢樣品從加樣孔加在試紙條上樣墊上，使樣品溶解標記磁珠並在NC膜上層析，然後在規定的時間內用磁力檢測儀檢(MICT)測試紙條上數據，根據所讀取的數據判定結果，本試劑盒用於HIV感染的篩查或臨床診斷，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、操作簡便、適合現場檢測和實時記錄保存結果等優點。文檔編號G01N33/558GK201331526SQ200820074598公開日2009年10月21日申請日期2008年4月30日優先權日2008年4月30日發明者洲李,楊發青申請人:天津中新科炬生物製藥有限公司