用於靜脈施用的替比法尼製劑的製作方法

2023-04-27 04:58:51 1

相關申請的交叉引用

本申請要求於2005年10月14日提交的美國臨時專利申請系列號60/726,911的權益，其全部內容以及全部目的通過引用併入本文。

發明領域

本發明涉及替比法尼(tipifarnib)的新型製劑，其適合於靜脈(IV)施用。本發明還涉及該製劑的用途、製備該製劑的方法以及通過向所述患者施用所述製劑治療患者的方法。

發明背景

替比法尼被描述於WO 97/21701。替比法尼的化學名稱是(R)-(+)-6-[氨基-(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)喹啉酮。替比法尼的商品名是該化合物的絕對立體化學構型未在上述專利說明書描述的實施例中確證，但是該化合物由詞頭「(B)」標識以說明它是從柱色譜法分離的第二化合物。發現由此獲得的該化合物具有(R)-(+)-構型。還由其發表的代碼編號R115777提及的此化合物具有以下結構：

替比法尼是一種在酸性pH下具有非常好的水溶性的鹼。其水解為R110127，其中胺官能度被羥基官能度取代。水解降解的速率在酸性條件下最低，但仍然非常快。R110127具有以下結構：

替比法尼是一種在體外和體內對人法呢基轉移酶(FTase)有效的和選擇性的非肽模擬競爭性抑制劑。此化合物在體外納摩爾濃度下具有抗增殖作用，並且在數個體外和體內模型中以及在臨床中作為單一療法具有抗腫瘤作用。替比法尼的主要的抗腫瘤作用包括抑制血管發生、抑制細胞凋亡、以及直接抗增殖。

法尼基化靶標，例如(但不限於)Ras、RhoB和磷脂醯基肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶AKT(它們與細胞內穩態和增殖有關)通常在AML中突變或失調。法尼基化的抑制阻止了體外骨髓白血病細胞生長和祖先集落形成。與正常骨髓細胞相比，從癌症患者獲得的白血病細胞對替比法尼的生長抑制作用明顯更敏感。特異性下遊效應器(通過該效應器，法尼基化的抑制作用產生抗白血病活性)的鑑別是正在進行的研究的主題。替比法尼在血液惡性腫瘤患者和實體瘤患者中顯示出臨床活性的徵兆；所述血液惡性腫瘤包括但不限於急性骨髓內源性白血病、髓增生異常症候群和多發性骨髓瘤；所述實體瘤包括但不限於惡性膠質瘤和乳腺癌。

迄今為止，一些研究者已測定了替比法尼口服施用之後的藥代動力學。替比法尼的劑量遞增試驗是在28名晚期癌症患者中進行的。在50-至500-mg b.i.d.劑量範圍內，在口服施用之後2至5小時達到68-1458ng/mL的峰濃度範圍。觀察到替比法尼的血漿濃度呈線性增加。在此研究中觀察到的替比法尼谷和峰血漿濃度是在抗白血病的活性範圍內。

口服施用之後替比法尼被廣泛地代謝。由人肝細胞的體外研究的數據顯示，替比法尼經歷了直接的葡萄糖醛酸化。診斷抑制劑和異源性表達系統的試驗也表明，與其它CYP450酶如CYP2C19、CYP2A6、CYP2D6和CYP2C8/9/10相比，CYP3A4是替比法尼的主要代謝通路。在若干臨床前試驗中，如同法尼基轉移酶和抗增殖劑，替比法尼的代謝產物是無活性的。然而，其個別代謝物的藥代動力學未在人體中研究。在[14C]替比法尼口服施用於健康男性受試者的血漿樣品中發現替比法尼的若干代謝物。這些代謝物包括替比法尼葡萄糖醛酸(glucuronide)結合物以及通過氧化脫甲基、脫氨基和失甲基-咪唑部分而形成的代謝產物。母體化合物的葡萄糖醛酸化(glucuronidation)是生物轉化的主要途徑。然而，未研究將替比法尼施用於癌症受試者之後替比法尼的代謝。此外，替比法尼代謝產物配置情況(其可發生在不同途徑施用之後)潛在的差異未作系統性的試驗。

此外，由於腫瘤性阻塞、手術處理、並發的口腔感染、明顯的味覺反常或食慾減退、或者噁心和嘔吐，癌症患者經常口服攝入受損。因此，仍然希望有用於另一種施用途徑例如靜脈施用的製劑。

發明概述

本發明的目的是提供給口服施用成問題的患者施用替比法尼的另選施用(即胃腸外)途徑。本發明的目的是提供施用替比法尼的靜脈途徑，作為連續輸注或短期輸注(短於1小時至數小時；每天一次或多次)，其可提供對替比法尼的充分暴露，使得產生與目前每天兩次口服施用替比法尼相似的臨床結果。特別地，本發明的目的是提供施用替比法尼的靜脈途徑，作為連續輸注或每天兩次2小時輸注，其可提供與目前每天兩次口服施用替比法尼相似的暴露。本發明進一步的目的是提供治療全身和血液惡性腫瘤以及特別是實體癌的方法。

附圖簡述

圖1：「表1」：參與本項研究的患者的人口統計學數據。

圖2：「表2」：2-小時靜脈輸注b.i.d.施用之後平均(±SD)替比法尼血漿Cmax和AUC0-10h值。

圖3：「表3」：連續靜脈輸注施用之後平均(±SD)替比法尼血漿Cmax和AUC0-10h值。

圖4：「表4」：替比法尼全身暴露量：2小時靜脈輸注對口服給藥。

圖5：「表5」：替比法尼全身暴露量：連續靜脈輸注對口服給藥。

圖6：「表6」：口服施用、2-小時靜脈輸注和連續靜脈輸注之後，替比法尼-葡萄糖醛酸的平均(±SD)血漿藥代動力學參數。

圖7：「表7」：口服施用、2-小時靜脈輸注和連續靜脈輸注之後，R130525的平均(±SD)血漿藥代動力學參數。

圖8：3個4-天治療方案的連續施用之後替比法尼的平均(±SD)血漿濃度-時間圖。

圖9：替比法尼的游離分數和總血漿濃度間的關係。

圖10：3個4-天治療方案的連續施用之後替比法尼和衍生的代謝產物的平均(±SD)血漿濃度-時間圖。

發明說明

本發明提供了給口服施用成問題的患者施用替比法尼的另選施用(即胃腸外)途徑。本發明的目的是提供施用替比法尼的靜脈途徑，作為連續輸注或短期輸注(短於1小時至數小時；每天一次或多次)，其可提供對替比法尼的充分暴露，使得產生與目前每天兩次口服施用替比法尼相似的臨床結果。特別地，本發明的目的是提供施用替比法尼的靜脈途徑，作為連續輸注或每天兩次2小時輸注，其可提供與目前每天兩次口服施用替比法尼相似的暴露。

本發明進一步的目的是提供替比法尼的乾燥製劑，其可用溶液增溶而得到可以靜脈施用的替比法尼的製劑。本領域技術人員知道適合靜脈施用製劑的限制條件。下文將討論多種限制條件。靜脈施用的所述製劑應當具有一定的pH。進入靜脈的溶液不得太呈鹼性也不得太呈酸性。該製劑不應含有進入血液中時會產生副反應的賦形劑。此外，該製劑一旦進入血液中時應當使所述活性成分保持可溶。列舉的這些限制條件不是窮盡的。

本發明的製劑包含適宜量的替比法尼。這些量將取決於所得IV製劑將是否用於單劑量施用或者其將是否用於連續IV施用。

該製劑優選包含其它的一些環糊精或其衍生物。也可使用其它增溶劑。優選的環糊精是羥丙基β-環糊精。也可使用其它環糊精類。

任選的，也可使用甘露醇或另一糖，例如特裡阿糖(trealose)或蔗糖。甘露醇或其它糖確保凍乾物質的快速溶解。當不存在甘露醇時，會觀察到一些僅緩慢溶解的膠狀聚集物。在甘露醇存在下，這些聚集物不會出現或者出現較小的量。此外，甘露醇確保改善凍乾物質的外觀形狀。沒有甘露醇時，凍乾物質可出現破裂，使得凍乾物質從外觀上看少有吸引人的外觀。本發明進一步的目的是提供治療全身性(in general)和血液惡性腫瘤以及特別是實體癌的方法。

本發明提供了抑制細胞(包括轉化細胞)異常生長的方法，其通過施用本發明的藥物製劑。細胞異常生長是指細胞生長不依賴於正常調節機制(例如接觸抑制的喪失)。其包括以下的異常生長：(1)腫瘤細胞(腫瘤)表達活化的ras癌基因；(2)腫瘤細胞，其中ras蛋白由於另一基因的致癌突變而被活化；(3)其它增殖性疾病的良性和惡性細胞，其中發生ras活化。此外，文獻中認為，ras癌基因不但通過直接影響腫瘤細胞生長，而且間接地即促進腫瘤誘發血管生成，而有助於體內腫瘤的生長。因此，藥理學靶向突變體ras癌基因可認為是抑制了體內實體瘤生長，其部分地通過抑制腫瘤誘發血管生成實現。

本發明還提供了抑制腫瘤生長的方法，其通過將本發明的本藥物製劑施用於需要該治療的受試者，例如哺乳動物(更特別地是人)。特別是，本發明提供了抑制表達活化ras癌基因的腫瘤生長的方法，其通過施用本發明的藥物製劑。可以被抑制的腫瘤的不限制的實例是，肺癌(例如腺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌如外分泌腺的胰腺癌)、結腸癌(例如結腸直腸癌如結腸腺癌和結腸腺瘤)、淋巴系的造血腫瘤(例如急性淋巴細胞性白血病、B-細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)、髓細胞性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))、甲狀腺(例如小囊)癌、骨髓增生異常症候群(MDS)、間質源腫瘤(例如纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神經細胞瘤、神經膠質瘤、皮膚良性腫瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、膀胱癌、表皮癌。

本發明還提供了抑制良性和惡性增殖性疾病的方法，其中ras蛋白由於基因中的致癌突變而被異常地活化，即ras基因自身未通過突變至致癌突變而活化成致癌型，所述的抑制是通過將本文所述的藥物製劑施用於需要該治療的受試者而完成的。例如，良性增殖障礙神經纖維瘤病，或者其中ras因酪氨酸激酶癌基因的突變或過表達而被活化的腫瘤，它們可通過本發明的藥物製劑而被抑制。

因此，本發明公開了用作藥物的本發明的藥物製劑，以及式(I)的這些化合物在製備用於治療一種或多種上述病況的藥物中的用途。

術語和定義

為提供更簡要的說明，本文給出的一些數量表述未用術語「約」限定。應理解為，不論此術語「約」是否明確使用，本文給出的每一個數量表示實際給出的值，並且它還表示接近此給出值，這是根據本領域技術人員可合理推知的，包括由於此給出值的試驗和/或測定條件的近似值。

本文使用的術語「受試者」是指動物，優選哺乳動物，更優選人，其為治療、觀察或試驗的對象。

本文使用的術語「治療有效量」表示活性化合物或藥物的量，其在組織系統、動物或人中誘發由研究者、獸醫、醫生或其它臨床醫師探求的生物學或醫學應答，此應答包括所治疾病或障礙的至少一種症狀減輕，和/或所治疾病或障礙的至少一種症狀的發生率和/或嚴重度減少。

術語「立體異構體」是指具有相同分子式和相同共價鍵合原子順序但空間取向不同的異構體。

術語「光學異構體」表示相同結構的異構體，其僅在其基團的空間排布上不同。光學異構體在不同方向上旋轉偏振光的平面。術語「旋光度」表示光學異構體旋轉偏振光平面的程度。

術語「外消旋物」或「外消旋混合物」表示兩個對映體物種的等摩爾混合物，其中每一分離的種類以相反方向旋轉偏振光平面以致該混合物沒有旋光度。

術語「對映體」表示一種立體異構體，它與其鏡像不是不可疊合的。術語「非對映體」表示不是對映體的立體異構體。

術語「手性分子」表示具有至少一個對映體對的分子。這是與非手性分子相反的，該非手性分子可以與其鏡像疊合。

手性分子的兩個不同鏡像體也稱為左旋的(左手的，縮寫L)或右旋的(右手的，縮寫D)，這取決於它們以何種方式旋轉偏振光。符號「R」和「S」表示在立體源(stereogenic)碳原子周圍的基團的構像。

由外消旋混合物分離到的對映體富集形式的實例包括右旋對映體，其中該混合物基本上沒有左旋異構體。在本上下文中，基本上沒有表示左旋異構體根據以下公式，可以(在一個範圍內)佔少於該混合物的25％、少於10％、少於5％、少於2％或少於1％：

類似地，由外消旋混合物分離到的對映體富集形式的實例包括左旋對映體，其中該混合物基本上沒有右旋異構體。在本上下文中，基本上沒有表示右旋異構體根據以下公式，可以(在一個範圍內)佔少於該混合物的25％、少於10％、少於5％、少於2％或少於1％：

術語「幾何異構體」表示取代基原子因碳-碳雙鍵、環烷基環或橋接雙環系統關係而取向不同的異構體。在碳-碳雙鍵兩側的取代基原子(氫除外)可以是E或Z構型。在「E」構型中，所述的取代基在碳-碳雙鍵關係中的對側。在「Z」構型中，所述的取代基定位在碳-碳雙鍵關係中的同側。

與環系統連接的取代基原子(氫除外)可以是順式或反式構型。在「順式」構型中，所述取代基在環平面關係的同側；在「反式」構型中，所述取代基在環平面關係的對側。具有「順式」和「反式」種類的混合體的化合物命名為「順/反」。

異構表示符號(「R」、「S」、「E」和「Z」)表示原子構型，並且將如文獻中所定義的使用。

本發明化合物可以通過異構體特異性合成或從異構體混合物拆分製備成單一異構體。常規的拆分技術包括：將異構體對的每一異構體的游離鹼(或游離酸)使用旋光酸(或鹼)結合形成旋光鹽(接著分步結晶和游離鹼再生)，通過與適宜的手性助劑反應形成異構體對的每一異構體的酯或醯胺(接著分步結晶或色譜分離並除去手性助劑)，或者使用各種公知的色譜法分離中間體或終產物的異構體混合物。

此外，本發明化合物可具有一種或多種多晶形或者無定形結晶形式，並且它們也將包括在本發明的範圍內。此外，一些化合物可以與水形成溶劑合物(即水合物)或與普通有機溶劑(例如有機酯如乙醇化物等)形成溶劑合物，並且它們也將包括在本發明的範圍內。

描述以下實施例以有助於理解本發明，並且不希望也不解釋為以任何方式限制本發明所附權利要求中所述的內容。

實驗部分

製劑

用於凍幹的替比法尼10mg/ml可注射溶液(製劑1)

用於重構(reconsititute)替比法尼可注射凍乾粉的溶液(製劑2)

構櫞酸一水合物 1.97mg

無水磷酸氫二鈉 4.44mg

注射用水qs ad 1000μl

使pH＝6.0±0.5

製劑的製備

製劑1

將10ml的製劑1填充到20ml管形瓶中，再冷凍乾燥(每瓶100mg替比法尼)。使用之前，將凍乾粉溶解於8.6ml的製劑2中，獲得10ml的替比法尼10mg/ml可注射溶液(pH～4-5)。然後將這一替比法尼10mg/ml溶液用0.9％NaCl溶液稀釋成需要濃度(0.5至2mg/ml)。

製劑1的pH值是非常酸的，以便(1)為了增溶替比法尼，(2)製備期間具有最小量的R110127形成(優選地冷溫度10℃下進行製備)。

當用製劑2重構時，將羥丙基-β-環糊精加至製劑1中以增溶替比法尼。重構溶液的pH值為4.5。如果不存在羥丙基-β-環糊精，在此pH值下，替比法尼會沉澱。在此pH值下，向外周靜脈(手臂)輸注期間局部刺激的風險是可接受的水平。

在人體試驗中，當施用較長時間(例如24小時)時，在輸注位置發現有一些血栓性靜脈炎。這可能是由於羥丙基-β-環糊精本身而非載體引起的。因此決定不通過外周靜脈而通過中央靜脈施用。中央靜脈具有更高的血貯量(debit)，從而輸液的混合和稀釋更快、更高。由於當通過中央靜脈輸注時，輸液的pH值較不關鍵，確定用WFI(注射用水)重構而不用製劑2重構。通過將製劑1的冷凍乾燥粉末用WFI重構獲得的溶液的pH值為～3。該重構溶液可通過中央靜脈施用。

製備方法

(a)製劑1的製備(10L批量)

(1)向適宜的容器中加入2kg的羥丙基-β-環糊精。

(2)向(1)中加入500g甘露醇。

(3)向(2)中加入8kg注射用水，攪拌直至溶解。

(4)向(3)中加入164.0g HCl 10％，攪拌至均勻。

(5)向(4)中加入100g R115777，混合成溶液。

(6)經無菌0.22μm濾膜過濾。

(7)將10ml的(6)填充到20ml管形瓶中。

(b)製劑1的冷凍乾燥

(8)塞住管形瓶，轉移到凍幹盤(lyo trays)。

(9)將(8)轉移到冷凍乾燥機。

(10)冷凍乾燥：-冷凍：-40℃，環境壓力

-首次乾燥：10℃，0.1mbar

-第二次乾燥：30℃，0.01mbar

(11)壓瓶。

臨床試驗

方法和材料

此隨機、標籤公開(open-label)、對照試驗是根據良好臨床操作規範(good clinical practice)進行的。在該試驗之前獲得倫理委員會批准，並且患者在參與的知情同意書上簽字。

替比法尼是以100-mg口服片劑或含有100mg替比法尼和2.0g羥丙基-β-環糊精(HPβCD)的瓶裝凍乾粉劑提供的。靜脈輸注前立即用製劑2重構該凍乾粉。將此等分部分稀釋於0.9％NaCl，再通過注射器以適宜的輸注管線施用藥物。

研究受試者

病理學確認為癌症的18歲或更大的男性和女性，對治癒性治療不順從，他們是本項研究的入選者。要求患者具有ECOG(東方協作腫瘤集團，Eastern Cooperative Oncology Group)體質狀態≤2。其它要求包括在入組研究之前至少4周內無放射治療和/或化學治療(對於亞硝基脲和絲裂黴素C為6周)，充分的口服攝食以維持合理的營養狀態。

如果有明顯異常的血液狀態，即由以下判斷的：中性白細胞計數＜1,500/mm3、血小板計數＜100,000/mm3、血清膽紅素＞2.0mg/dL、轉氨酶＞5倍的規定正常值上限、或者肌酸酐＞1.5mg/dL，則排除這樣的患者。在口服施用替比法尼期間，不允許同時施用質子泵抑制劑(例如奧美拉唑、蘭索拉唑、泮託拉唑)(僅在循環1中，當進行PK評價時，以避免任何可能的幹擾)。進行過胃腸(GI)道手術而容易因受損胃酸或脫離上部GI道而幹擾藥物吸收的患者未入選。根據研究者的意見，任何併發症的存在均將成為參與本項研究的風險，並且特定級別≥2的外周神經病當作不合格患者。

研究計劃

本研究第一(劑量確定)期的目標是檢驗充分耐受的靜脈劑量方案。期望此方案相當於50％-60％的臨床相關口服劑量(200mg)，其基於在健康男性志願者中預先試驗確定的絕對生物利用度。第一組3名受試者接受接下來不間斷的4天連續的替比法尼治療：30mg作2-小時靜脈輸注b.i.d.，於第1-4天；接著200mg作口服施用b.i.d.，於第5-8天；接著每天60mg作連續輸注，於第9-12天。類似地，第二組3名受試者接受類似的4天替比法尼治療：60mg作2-小時靜脈輸注b.i.d.，接著200mg作口服施用b.i.d.，接著每天120mg作連續靜脈輸注。在每一個所述的4-天口服或i.v.治療之間沒有清洗(washout)期。

在所述組中第二和第三名受試者僅在第一受試者完成第一靜脈和口服治療(即8-天期間)而無劑量限制毒性(DLT)時才開始。如果在第一或第二組中DLT發生於3名受試者中的1名，則將3名追加的受試者加到那組中。如果超過1名以上受試者經歷DLT(在首先的3名受試者中或在延長組的6名受試者中)，將劑量遞增終止，在那組中的其它受試者以同一劑量完成他們的治療。

本研究第一(i.v.-口服跨接)期是在不同的患者組中完成的。將全身暴露於替比法尼，接著所選的2-小時和連續靜脈方案(從前面的劑量確定期)與200-mg b.i.d.口服方案之後暴露比較。當劑量確定期的第二組的至少2名受試者直至第21天尚未觀察到DLT，則開始所述跨接期。為了，補償潛在的順序作用，在所選靜脈方案中，將總計24名受試者隨機以1∶1比率分配到兩個治療程序中的一個中。

順序1∶100mg b.i.d.作2-小時靜脈輸注施用，於第1-4天；接著200mg口服片劑b.i.d.，於第5-8天；然後200mg/天作連續4-天靜脈輸注施用，於第9-12天。

順序2∶200mg/天作連續4-天靜脈輸注施用，於第1-4天；接著200mg口服片劑b.i.d.，於第5-8天；然後100mg b.i.d.作2-小時靜脈輸注施用，於第9-12天。

口服劑量的替比法尼是在攝食後立即給予。替比法尼的輸注是通過前臂外周靜脈或較高劑量時通過中央脈管線施用的。

血漿取樣和分析

在劑量確定期和跨接期，藥物動力學取樣是在每一治療的第4天從早晨給藥開始的10-小時期間進行的。全血樣品是在口服施用之前即刻以及口服施用之後0.5、1、2、3、4、6、8和10小時取樣。對於2-小時靜脈輸注，血液樣品是在給藥之前即刻以及給藥之後1、2(即正好在輸液結束之前)、2.25、3、4、6、8和10小時取樣。血液樣品是在連續靜脈輸注開始之前即刻以及連續靜脈輸注開始之後2、4、6、8和10小時取樣。

每一PK樣品收集的血液最少7mL。將全血樣品立即置於冰中，並在採集之後2小時內離心(10min，1000xg)。將分離的血漿立即於≤-18℃下冷凍直至分析。

將血漿樣品在室溫下解凍，再使用以前公開的方法對各個樣品分析替比法尼。向1-ml份的人血漿中加入200ng的內標(R121550，一種結構類似物)。加入1ml的NaOH(0.1M)之後，將樣品用4ml的含有10％異戊醇的庚烷萃取兩次。將合併的有機相用2ml的HCl(2M)反萃取。用濃氨鹼化之後，水相用5ml的含有5％異戊醇的庚烷萃取一次。在氮氣和65℃下將此萃取物蒸發，再將殘餘物溶解於100微升的注入溶劑(乙酸銨0.01M/乙腈/甲醇；50/25/25)。將15μl萃取物注入配有240nm波長UV檢測器的HPLC(Agilent)中。在填充3μm C18BDS-Hypersil(Alltech)的10em x 4.6mm色譜柱中進行分離。在0.8ml/min的流速下，以0.01M乙酸銨/乙腈(52/48)的等度開始洗脫，直到感興趣的化合物洗脫，接著梯度至90％乙腈。總的運行時間為14min。此分析在2.00至5000ng/ml的範圍內有效。

替比法尼的代謝物，尤其是R130525、R107252和R104209，是使用LC-MS/MS測定的。這些代謝產物的化學結構表示於圖11。為了測定葡萄糖醛酸化代謝物的存在，還在用大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶(Boehringer Ingelheim GmbH，Ingelheim，德國)脫結合(deconjugation)之後分析血漿樣品。以如下說明製備樣品：每份0.2mL人血漿或每份1.0mL的稀釋的、脫結合的血漿樣品中加入3種內標以每種5ng的混合物：穩定的同位素標記的化合物R198838用於替比法尼和R130525；兩種結構類似物R107252和R121704分別用於R101763和R104209。加入1mL的0.1M NaOH之後，將樣品用3mL的含有10％異戊醇的庚烷萃取兩次。將合併的有機級分在氮氣下蒸發，再將該殘餘物重構於100μL的甲醇和100μL的0.002M乙酸銨的混合物中。在C18BDS-Hypersil 3μm(3.2mm I.D.×50mm)柱上進行色譜分離。注射體積為25μL。等度流動相是由0.002M甲酸銨(甲酸調至pH4)/乙腈(44/56)組成，泵速為0.5mL/分鐘。通過串聯質譜法用Turboionspray電離(正離子模式)檢測。以下質量躍遷用於監測不同的化合物和內標物：替比法尼：489.1→407.1；R198838：492.1→407.1；R130525：475.1→393.1；R101763：394.0→139.0；R104209+R107252：408.0→139.0；以及R121704：422.1→139.0。脫結合之後對於每一代謝物在0.50-1250ng/ml的範圍內以及對於替比法尼在10.0-25000ng/ml的範圍內，該分析是有效的。

替比法尼蛋白結合分析

將替比法尼用[14C]在不對稱碳原子上特異性地標記。在第4天連續靜脈輸注替比法尼開始之後4小時，從24名患者取7-mL血樣。血漿用[14C]-替比法尼以500ng/ml加強。在配備相同的大-1(macro-1)特富龍(Teflon)池和Diachema 10.17透析膜(MW截止值為10,000)的Dianorm系統中，將該加強的血漿樣品經用pH 7.17的0.067M磷酸鹽緩衝液在下37℃經平衡透析4小時。以一式兩份的100-μl份的加強的血漿在平衡透析之前和之後測定放射性水平；並在透析之後、在Packard Tri-Carb 1900TR液體閃爍譜儀上，以與甲醇混合的透析池的緩衝液隔室中的內容物1000-μl的一式兩份測定放射性水平。用比色雙縮脲(biureet)法(試劑盒為Roche Diagnostics 1929917)測定總蛋白濃度。用比色溴甲酚綠法試劑盒Roche Diagnostics 1970909測定白蛋白濃度。用免疫-比濁法(試劑盒為Roche Diagnostics 1557602)測定α1-酸糖蛋白濃度。所有這些測定是在Roche Hitachi Modular分析儀上進行的。

如通過放射性測定透析池的緩衝液(Cu)隔室和血漿(C)隔室所測定的，非結合替比法尼的分數(fu)是以非結合濃度(Cu)與總濃度(C)的比值計算的：fu＝Cu/C。結合分數fb＝1-fu。

非隔室藥代動力學分析

通過非隔室方法使用WinNonlin第3.1版程序(Pharsight Corporation，Cary，NC)，分析了從每一施用期的第4天早晨給藥開始的10-小時替比法尼的各個血漿濃度-時間數據。從0至10小時時間的濃度對時間曲線下面積(AUC0-10h)是使用線性梯形法計算的。最大血漿濃度(Cmax)、穩態血漿濃度(Css，僅對於連續靜脈輸注)、以及達到血漿濃度峰值時間(tmax)為觀測值。替比法尼口服施用後的生物利用度是基於AUC0-10h值根據[AUCpo×DOSEiv/(AUCiv×DOSEpo)]×100％計算的。

統計分析

人口統計信息概括為中值、最小值和最大值。替比法尼及其代謝物的藥代動力學數據也使用描述統計學進行概括。替比法尼口服和靜脈施用之後，來自可得到全部3個治療的藥代動力學樣品的受試者的全身暴露量(血漿Cmax和AUC0-10h)是使用ANOVA來評價的。對於替比法尼的Cmax和AUC0-10h，計算了在靜脈輸注(試驗)對口服施用(參照)的最小二乘法平均比值附近的估計點和對應90％置信區間。使用SAS第6.12版統計軟體程序(SAS Institute，Cary，NC)，用對數-變換的藥代動力學參數進行該分析。

臨床評價

取得完整的病歷，在基線和治療期間進行體格檢查(包括生命體徵)、血液學檢測和臨床化學檢測。為評價心血管安全性，在篩查、第一周期和治療結束時記錄12-極線(lead)E.C.G.。雖然目標的腫瘤應答不是本研究的主要目標，仍嘗試獲得適合的測量結果以評價應答。根據一般毒性標準(Common Toxicity Criteria，CTC，第2.0版)，對所有不良事件和臨床相關的實驗室異常進行分級。

結果

受試者配置情況

總計入組32名受試者(10名男性和22名女性)；6名受試者參與劑量確定期，26名受試者參與跨接期。在此項研究中31名受試者被診斷為晚期實體瘤。1名受試者有高危骨髓增生異常症候群。在跨接期，12名受試者隨機分配為接受治療順序1(2-小時靜脈輸注b.i.d./口服施用b.i.d./連續靜脈輸注)，14名受試者接受治療順序2(連續靜脈輸注/口服施用b.i.d./2-小時靜脈輸注b.i.d.)。隨機分配到治療順序1的1名受試者在第4天從本項研究中退出，原因是違反協議規定；治療順序2的1名受試者在第8天退出，原因是由於疾病進展的肝衰竭。

招募到本研究的32名受試者的人口數據概述於表I(圖1)。患者年齡範圍為35至70歲，體重範圍為48至92kg，身高範圍為149至176cm。第3組(跨接期)的兩個隨機分組之間沒有明顯差異。

替比法尼靜脈劑量的測定

第一組由3名受試者組成，他們接受4-天替比法尼方案：30mg每天兩次作2-小時靜脈輸注，接著200mg每天兩次作口服施用，再每天60mg作連續輸注。平均地，與在這些個體接受200mg口服劑量之後的暴露量相比較，基於AUC0-10h用30mg b.i.d.作2-小時靜脈輸注和每天60mg作連續靜脈輸注的替比法尼全身暴露量分別低約64％和59％(表II至IV)(圖2至4)。靜脈施用之後未觀察到劑量限制毒性。因此，靜脈施用劑量被升高到下一劑量水平。

在第二組中，3名另外的受試者接受4-天方案：60mg替比法尼每天兩次作2-小時靜脈輸注，接著每天120mg作連續輸注。與200mg口服劑量之後的暴露量相比較，在這些靜脈方案之後替比法尼全身暴露量分別低約47％和46％(表II至IV)(圖2至4)。此外，在這組中未觀察到DLT。根據這些結果，每天兩次100mg作2-小時輸注施用的方案和200-mg/天連續輸注被選定為靜脈至口服跨接研究。

替比法尼的血漿藥代動力學

正如所期望的，替比法尼血漿濃度-時間圖的形狀依賴於施用途徑和給藥方案(圖1)。口服施用和2-小時靜脈輸注之後替比法尼的血漿峰濃度明顯。相比之下，藥物施用期間連續靜脈輸注產生相對恆定的血漿濃度而無明顯峰。

最大血漿濃度是在口服施用200mg b.i.d.的替比法尼達4個連續日之後約2小時觀察到的(表IV)(圖4)。在29名受試者中tmax的範圍為0.5至3小時；1名受試者最大濃度在8小時。4天b.i.d.口服給藥之後，Cmax和AUC0-10h算術平均值(±SD，n＝24)分別為994±487ng/mL和3990±1671ng·h/mL。

當100mg劑量作2-小時靜脈輸注給予時，與200mg口服劑量相比，觀察到更高的替比法尼血漿濃度(表IV)(圖4)。平均地，當替比法尼作2-小時靜脈輸注施用時(100mg b.i.d.)，比當口服施用時(200mg b.i.d.)，Cmax和AUC0-10h值分別高出48.0％和19.3％(表IV)(圖4)。90％置信區間落的上限在80％至125％的生物等效性範圍之外。與口服施用之後相比，2-小時靜脈輸注之後觀察到的更高暴露量不被認為是臨床顯著的。

口服施用(200mg b.i.d.)和連續靜脈輸注(每天200mg)之後第4天的平均AUC0-10h值相似(表V)(圖5)。90％置信區間的下限落在80％至125％的範圍內；然而，擴大的上限稍微超出了這一範圍(表V)(圖5)。根據由AUC0-10h測定的總全身暴露量，連續輸注給藥的效果與口服途徑給藥相似。然而，圖形的形狀是不同的，連續輸注之後未出現替比法尼峰濃度。

劑量標準化之後，口服片劑製劑的平均絕對生物利用度(口服對2小時i.v.)為46.3％。類似地，口服片劑製劑的平均絕對生物利用度(口服對連續靜脈輸注)為40.9％。

作連續靜脈輸注(200mg/天)或者作2-小時靜脈輸注(100mg b.i.d.)施用之後，替比法尼全身暴露是可比的。此外，儘管血漿濃度-時間圖的形狀不同，平均AUC0-10h值是相似的。90％置信區間的上限和下限(81.1％至100.3％)落在80％至125％的範圍內。

總之，當該化合物作口服片劑(200mg b.i.d.)、經2-小時靜脈輸注(100mg b.i.d.)、或經連續靜脈輸注(200mg/天)施用時，由給藥之後在10-小時間隔期間血漿AUC0-10h所測定的替比法尼全身暴露量是可比的。通過3次治療觀察到平均AUC0-10h值的狹窄範圍(3990至4487ng·h/mL)。當考慮圖形的形狀時，2-小時靜脈輸注更加相似於口服施用。

血漿中替比法尼的蛋白結合

在全部分析的樣品中，替比法尼廣泛地與血漿蛋白結合(圖2)。在連續靜脈輸注開始之後4小時抽取的血漿樣品中，平均游離(未結合)分數為0.62％(範圍為0.45至0.88％)。替比法尼的未結合分數不依賴於211ng/mL至812ng/mL範圍內的總藥物血漿濃度。從某些受試者在口服施用之後或2-小時靜脈輸注之後取得的樣品，其蛋白結合沒有可用的數據。然而，在200mg b.i.d.口服施用達4天之後在10小時給藥間隔期間，中值血漿濃度在159ng/mL至788ng/mL的範圍內。

血清白蛋白、α1-酸糖蛋白和總蛋白的平均濃度(範圍)分別為4.1g/100mL(3.1至4.7g/mL)、131mg/100mL(90至218mg/100mL)和6.8g/100mL(4.7至7.9g/mL)。

血漿中替比法尼的代謝產物

替比法尼代謝產物的血漿藥代動力學是在口服片劑(200mg b.i.d.)、2-小時靜脈輸注(60和100mg b.i.d.)、或連續靜脈輸注(120和200mg/天)施用4天之後於第4、8和12天進行分析的。分析的代謝產物包括R130525、R101763、R104209、替比法尼-葡萄糖醛酸、R130525-葡萄糖醛酸、R104209-葡萄糖醛酸。這些代謝產物的化學結構已由Garner RC et al確證。在全身循環中觀察到的主要代謝產物為R130525和替比法尼-葡萄糖醛酸(圖3)。靜脈途徑測定的替比法尼的主要和次要代謝產物與口服施用的那些相同。

一般地，替比法尼-葡萄糖醛酸代謝產物的全身暴露量(Cmax和AUC0-10h)隨靜脈施用的替比法尼劑量的增加而增加(表VI)(圖6)。平行比較在第12天替比法尼-葡萄糖醛酸代謝產物暴露量沒有從前面11天施用累積(數據未顯示)。替比法尼-葡萄糖醛酸相對於替比法尼的AUC0-10h值的平均比值為：口服施用為18.6，100mg 2-小時靜脈輸注為7.5，200mg連續靜脈輸注為8.6。總體上，與靜脈施用相比，口服給予替比法尼之後在血漿中葡萄糖醛酸對母體化合物的濃度比更高。這可能是由於通過肝臟的首過效應(即，母體化合物在全身吸收之前即損失)，此首過效應與經口服途徑給藥有關。

R130525代謝產物的全身暴露量(Cmax和AUC0-10h)隨靜脈施用的替比法尼劑量的增加而增加(表VII)(圖7)。R130525相對於替比法尼的AUC0-10h值的平均比值為：口服施用為五分之一，2-小時靜脈輸注和連續靜脈輸注約為十分之一。

口服施用200mg替比法尼之後，替比法尼的其它代謝產物也在血漿中測定，包括：R101763(Cmax：14.8ng/mL，AUC0-10h：101ng·h/mL)、R104209(Cmax：69.7ng/mL，AUC0-10h：447ng·h/mL)、R130525-葡萄糖醛酸(Cmax：53.0ng/mL，AUC0-10h：320ng·h/mL)、R10176-葡萄糖醛酸(Cmax：12.0ng/mL，AUC0-10h：63.9ng·h/mL)、R104209-葡萄糖醛酸(Cmax：64.0ng/mL，AUC0-10h：434ng·h/mL)。這些代謝物的濃度比R130525和替比法尼-葡萄糖醛酸的濃度更低。靜脈施用之後這些代謝物的暴露量低於口服施用之後的暴露量。

臨床評價

對全部受試者進行了毒性評價。一名受試者在3天之後發現她不符合本項研究資格而退出；沒有不良事件的報導。一名受試者有骨髓增生異常症候群。此受試者有3-4級嗜中性白血球減少症的時期，通過劑量減少和推遲處理。血小板計數保持正常。未觀察到明顯的非血液學毒性。

在9/30名患者(30％)中觀察到3或4級藥物相關性血液學毒性嗜中性白血球減少症。在1名患者(3％)中觀察到發熱性嗜中性白血球減少症。主要的藥物相關性非血液學毒性(主要是1級)為疲勞(60％)、噁心(40％)、食慾減退(20％)、嘔吐(17％)和腹瀉(13％)。在3名患者中觀察到靜脈炎，全部是通過外周小靜脈途徑IV推注給藥；當使用中央靜脈IV推注給藥時未觀察到靜脈炎。

對31名受試者進行了有效性評價：MDS的受試者有8個月的血液學改善(血紅蛋白持續增加，其根據International Working Group標準對MDS的應答)。未觀察到客觀的腫瘤應答，並且14名受試者疾病穩定達至少6個月。

討論

「劑量確定″期的目的是確定替比法尼的靜脈劑量方案，此方案將產生與200mg口服施用一天兩次相比相似的暴露量。更一般地說，此目的是確定靜脈劑量和時間表，此靜脈劑量和時間表將提供如目前口服施用所產生的相似作用的充分暴露量。在低劑量靜脈方案的第一組和第二組中，替比法尼的全身暴露量比200mg口服施用的全身暴露量低得多。在本項研究的「跨接」期，考慮到在這些低劑量方案之後沒有劑量限制毒性，最後的靜脈施用劑量被升高到100mg b.i.d.作2-小時輸注和200mg/天作連續輸注。

平均地，當替比法尼作口服片劑(200mg b.i.d.)、2-小時靜脈輸注(100mg b.i.d.)或連續靜脈輸注(200mg/天)施用時，替比法尼的暴露量(AUC0-10h)是可比的並且在一狹窄的範圍內(3990至4487ng·h/mL)。當考慮2個靜脈方案的圖形形狀時，2小時輸注更加接近於模仿的口服施用。

口服施用200mg替比法尼b.i.d.劑量之後，平均Cmax和AUC0-10h值分別為994ng/mL和3990ng·h/mL。這與前面口服施用150-和300-mg的替比法尼每天兩次的研究非常符合(平均Cmax分別為443和974；平均AUC0-12h值分別為2495和4674ng·h/mL)。

在進食條件下施用替比法尼片劑的平均口服生物利用度為46.3％(就2-小時靜脈輸注b.i.d.而言)和40.9％(就連續靜脈輸注而言)。這些結果代表了近似絕對口服生物利用度，因為在最後藥物施用之後血漿樣品僅採集了10小時。然而，清楚的是，當與食物施用時替比法尼具有相對良好的生物利用度。

以前人體研究表明，替比法尼經過廣泛代謝，並且未變化的母體化合物在血漿中佔相對較小的組成。口服施用之後，未變化的替比法尼的濃度比未沉澱樣品中的總放射性濃度低，平均為四十二分之一，並且比脫蛋白樣品低，約為八分之一。在尿中沒有未變化的藥物排洩，並且在糞便(faces)中替比法尼回收低於7％的口服施用劑量。在本項研究中獲得一致的結果。替比法尼-葡萄糖醛酸的血漿AUC0-10h值比替比法尼高，是3-至30-倍。由於替比法尼在其結構中具有氨基和酮基，直接結合是可期待的。重要的是，用NIH 3T3H-ras細胞系和法呢基蛋白轉移酶作體外研究表明，替比法尼的葡萄糖醛酸-代謝產物不是法呢基轉移酶的抑制劑。在本項研究和以前的研究中，在患者血漿中測定了通過氧化生物轉化形成的替比法尼的其它代謝產物，包括R130525和R104209及其各自的葡萄糖醛酸化結合物，以及R101763。

替比法尼的兩種優勢代謝產物即葡萄糖醛酸結合物和N-脫烷基化物R130525的暴露量隨所施用的替比法尼靜脈劑量的增加而增加。在所研究的劑量範圍內這些途徑顯然未飽和。每一途徑施用之後R130525的相對暴露量是可以比較的。相反，葡萄糖醛酸化代謝產物的血漿濃度在口服給藥之後比靜脈施用之後高，大約是2倍。口服施用之後在肝臟中的首過代謝期間更廣泛的葡萄糖醛酸化最有可能解釋替比法尼-葡萄糖醛酸相對濃度的這種途徑-依賴性差異。此外，本項研究確證的代謝產物與施用途徑無關。該結果還說明了首過代謝對每一代謝產物暴露量的代謝產物-特異性影響。

在此試驗中，癌症患者離體測量的替比法尼的血漿蛋白結合值非常接近於用5名健康男子血漿樣品體外試驗獲得的值(99.22％結合)。在此體外研究中，將來自這些健康受試者的空白血漿樣品1000ng/mL的14C-替比法尼加強，並且測定方法與當前的試驗中所使用的相同。替比法尼的體外血漿蛋白結合還與100至5000ng/mL範圍內的總替比法尼濃度無關。

總之，2-小時靜脈方案的血漿濃度-時間圖形與口服施用之後的圖形非常相似。替比法尼的全身暴露量當每天兩次給予100mg作2-小時靜脈輸注或者經口服途徑給予200mg時的給藥之後最初10小時是可比的。沒有與靜脈替比法尼相關的罕見的不良事件。