一種信號放大技術電化學傳感器檢測dna的方法

2023-04-27 18:48:51

一種信號放大技術電化學傳感器檢測dna的方法【專利摘要】本發明涉及一種信號放大技術電化學傳感器製備方法及應用。首先製備金-鉑納米粒子，並以硫堇為電化學試劑將其固定在金-鉑納米粒子表面，再將探針DNA通過固定在納米粒子表面，製得電化學探針。同時將發卡DNA自組裝在金電極表面得電化學傳感器。在電化學傳感器上加入目標DNA時，目標DNA與組裝在金電極表面表面上的發卡DNA部分互補配對打開發卡結構。然後另外一條發卡DNA鏈通過競爭作用取代目標鏈DNA，從而釋放目標鏈DNA。釋放的目標鏈則繼續打開電極表面的其他的發卡結構DNA，如此的循環作用實現了目標鏈DNA的循環使用，結合製備的電化學探針，實現對目標DNA的測定。本發明的傳感器具有很高的選擇性和檢測靈敏度；金-鉑納米粒子為載體負載硫堇為探針具有電化學穩定的優勢。【專利說明】—種信號放大技術電化學傳感器檢測DNA的方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬於分析化學和電化學【
技術領域：
】，涉及一種信號放大技術電化學傳感器製備方法及應用。另外，本發明還涉及採用所述的電化學傳感器檢測DNA的方法。【
背景技術：
】[0002]檢測特定序列DNA在臨床診斷、基因治療以及其他生物醫學研究上是十分重要的。因此，建立高靈敏度快速檢測特定序列的DNA的方法是十分必要的。[0003]一般情況下，檢測DNA都是基於DNA雜交來實現的。為了讀出雜交反應，通常的方法是對目標DNA的部分互補序列進行標記。一般採用螢光、電化學發光、化學發光物質等標記目標DNA的部分互補序列製得DNA探針，根據雜交反應後DNA探針的信號強度測定目標DNA的濃度。然而，由於生物體系中目標DNA的濃度極低，必須採用適當的檢測方法提高傳感器的靈敏度。因此，一些基於信號放大的DNA檢測方法得到T發展:酶切循環信號放大技術[HunX.,LiuF.,MeiZ.H.,et.al.,Signalamplifiedstrategybasedontarget-1nducedstrandreleasecouplingcleavageofnickingendonucleasefortheultrasensitivedetectionofochratoxinA,BiosensorsandBioelectronics,2013，39，145-151]，滾環放大技術[WenY.Q.，XuΥ.，MaoX.Η.，et.al.,DNAzyme-BasedRolling-CircleAmplificationDNAMachineforUltrasensitiveAnalysisofMicroRNAinDrosophilaLarva,Anal.Chem.2012,84,7664-7669]，聚合酶鏈反應[HartmanM.R.,YangD.Y.,TranT.N.N.,et.al.,ThermostablebranchedDNAnanostructuresasmodularprimersforpolymerasechainreaction,AngewandteChemieInternationalEdition,2013,52,8699-8702]，環介導等溫擴增[DhamaΚ.,KarthikK.,ChakrabortyS.,et.al.,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA(LAMP):Anewdiagnostictoollightstheworldofdiagnosisofanimalandhumanpathogens:Areview,PakistanJournalofBiologicalSciences,2014,17,151-166]等。這些方法各有其優點，能不同程度的滿足對DNA的檢測要求，但靈敏度不高。所以必須發展一種靈敏度高，簡單，穩定的檢測方法。【
發明內容】[0004]鑑於現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種信號放大技術電化學傳感器製備方法及應用。以及提供一種採用所述的電化學傳感器檢測DNA的方法。[0005]本發明的目的是這樣實現的:[0006]本發明是通過以下措施來實現的:一種信號放大技術電化學傳感器製備方法，其特徵是包括以下步驟:[0007](I)金-鉬納米粒子的製備；[0008](2)電化學探針的製備；[0009](3)電化學傳感器的製備；[0010]本發明所述的金-鉬納米粒子的製備包括以下步驟:把製備和儲備金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水泡30min，然後用二次水衝洗烘乾備用；在1000mL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰，然後快速加入5mL38.8mM的檸檬酸鈉(NaC6H5O7)，溶液變為酒紅色時，向溶液中依次加入5mL4.0XIO^moir1的HPtCl6,lSmLlOgL—1的PVP，攪拌加熱至沸騰後繼續加熱2h。溶液由酒紅色變為棕褐色，製得AuOPtNPs(金-鉬納米粒子)，轉移至棕色瓶，4°C儲存備用。[0011]本發明所述的電化學探針的製備包括以下步驟:首先，取2mL的離心管，加入10μLDNAl和10μLρΗ8.2，50mM的Tris-HCl緩衝溶液，10μLTCEP反應lh，用以活化巰基；然後，另取2mL離心管依次加入ImL金-鉬納米粒子和1000μL硫堇溶液反應0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上；將吸附了硫堇的金-鉬納米粒子加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應16h。使巰基DNAl與金-鉬納米粒子連接起來；最後在15000轉速下,離心30min,得到紅色沉澱，並用IOmM,pH8.0的磷酸緩衝溶液洗漆三次,分散在IOmM,PH8.0的磷酸緩衝溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針，4°C避光保存。[0012]本發明所述的電化學傳感器的製備包括以下步驟:[0013]1.金電極的預處理[0014]金電極經0.05μπι的α-Α1203拋光粉拋光後，用二次蒸餾水衝洗乾淨，並在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹乾；採用三電極系統檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3[Fe(CN)6]溶液中，設置電壓為O~0.8V，對金電極進行循環伏安(CV)掃描；若氧化還原電流峰在O~1000mV內，則已說明電極表面已被處理好。否則重新處理，直至符合要求為止；測完後，用二次水衝洗電極，吹乾電極表面，備用。[0015]2.金納米粒子修飾金電極製備[0016]首先取10μLAuNPs(直徑15nm)滴塗在金電極表面,得金納米粒子修飾金電極(AuNPs/GE)，置於避光處自然晾乾。[0017]3.發卡DNA的預處理[0018]取一定量的KT6M的巰基DNA4(或DNA3)於2mL離心管中，置於95°C恆溫水浴槽中加熱5min，取出後立即置於冰水中冷卻Imin即得到發卡DNA。[0019]4.電化學傳感器的製備[0020]取10μL上述發卡DNA3滴塗在AuNPs/GE表面，4°C自組裝24h;接著取10μLKT4M的巰基乙醇滴於電極表面，反應30min，然後用IOmM的磷酸緩衝溶液衝洗兩次，即得電化學傳感器。[0021]一種利用上述方法製備的電化學傳感器檢測DNA含量的方法，包括如下步驟:[0022](I)再取10μL目標DNA2滴加到電化學傳感器的電極表面，37°C下孵育2h後，再取10μL發卡DNA4滴加到電極表面。37°C下孵育4h，然後用10mM，pH8.0的磷酸緩衝溶液衝洗兩次。最後，取10μL製備的電化學探針滴加到電極表面，繼續孵育lh。[0023](2)將電極體系插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩衝溶液中，以上述所得金電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極測電信號(Ip/A)，進行DNA的測定[0024]發明考察了電極表面滴加發卡DNA4後，反應時間(Time/h)對電流強度的影響。如圖2所示，氧化峰電流首先隨著反應時間的增加而增加，當時間達到4h時，峰電流不再增加，而呈現出保持不變的趨勢。選擇的最優反應時間是4h。[0025]也考察了電化學探針在電極上吸附時間對電流強度的影響，如圖3所示，在10到60min內，峰電流隨著吸附時間的增加而增加。當吸附時間繼續增加時，峰電流基本不再變化。因此，以60min為最優的吸附時間。本發明的顯著效果[0026]本發明研究了不同濃度DNA2與電化學信號強度之間的關係，得到了檢測DNA2的標準曲線，線性範圍及線性方程。[0027]在最優的條件下，目標DNA2的濃度在3.0X10-14~2.0XKT12M範圍內與電流強度呈一定的線性關係，其線性回歸方程是Ip=6.6X105C+1.0X10_8(IP是電化學信號強度；C是DNA2的濃度，η=9)(圖4)，線性相關係數R=0.9991，檢測限是0.9X10-15Μ(3σ)。[0028]用同5根電極對濃度為2.0X10_13Μ目標物DNA2分別進行17次測定誤差分別為2.9%,2.6%,2.7%,2.9%,2.5%,在測定過程中電極表面均無脫落現象。以金納米粒子為載體負載硫堇為探針對2.0X10_13Μ目標物DNA2分別進行17次測定誤差分別為9.3%、7.9%,7.7%,3.2%,5.7%的，在測定過程中4根電極表面有脫落現象。表明以金-鉬納米粒子為載體負載硫堇為探針具有穩定性高的特點。【專利附圖】【附圖說明】[0029]圖1.信號放大技術測定目標物原理圖。[0030]圖2.電極表面滴加發卡DNA4後，反應時間對電流強度的影響。[0031]圖3.電化學探針在電極上吸附時間對電流強度的影響。[0032]圖4.電流強度與目標物濃度關係圖。【具體實施方式】[0033]下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。[0034]實例:信號放大技術電化學傳感器檢測DNA的方法[0035]1.實驗部分[0036]1.1儀器與試劑[0037]CHI660B電化學工作站(上海辰華儀器公司)；Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(上海市安亭科學儀器廠)；PHS-3D型酸度計(上海雷磁儀器廠)；採用三電極系統:金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。[0038]Na2HPO4.12H20,天津市紅巖化學試劑廠；三(2_羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride),氯金酸(HAuCl4),梓樣酸三鈉(Na3C6H5O7)均購於天津市博迪化工有限公司；鐵氰化鉀:K3[Fe(CN)6]，天津市博迪化工有限公司；亞鐵氰化鉀:K4[Fe(CN)6].3H20，天津市廣成化學試劑有限公司；氧化鋁粉末:C1-Al2O3，硫堇(Th)購自上海阿拉丁試劑公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)天津市廣成化學試劑有限公司。[0039]所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下。[0040]優選的DNAl部分序列為:5'-TTTTTTATTCGATCCGGTGCTCTTATGCCC-HS-3'[0041]優選的DNA2部分序列為:5』-CAATAACTACCGGGCATTACTGGCCTT-3』[0042]優選的DNA3部分序列為:5』-SH-C6-AAAGCCAGTAATGCCCGGTAGTTATTCCATCGTGTACAATAACTACCGGGCATAAGAGCACCCTTGTAC-3』[0043]優選的DNA4部分序列為:5』_TAGTTATTGTACACGATGGMTAACTACCGGGCATCCATCGTGTAC-3，。[0044]1.2實驗步驟[0045]1.2.1金-鉬納米粒子的製備[0046]把製備和儲備金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水泡30min，然後用二次水衝洗烘乾備用。在1000mL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4，攪拌加熱至沸騰，然後快速加入5mL38.8mM的檸檬酸鈉(NaC6H5O7),溶液變為酒紅色時，向溶液中依次加入5mL4.0XIO-3Iii0IL-1的HPtCl6,lSmLlOgL—1的PVP，攪拌加熱至沸騰後繼續加熱2h。溶液由酒紅色變為棕褐色，製得AuOPtNPs，轉移至棕色瓶，4°C儲存備用。[0047]1.2.2電化學探針的製備[0048]首先，取2mL的離心管，加入10μLKT5M的DNAl和10μLρΗ8.2，50mM的Tris-HCl緩衝溶液，?ομLlOmM的TCEP反應lh，用以活化巰基。然後，另取2mL離心管依次加入ImLAuiPtNPs和1000μLlO-4M的硫堇，溶液反應0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上。將吸附了硫堇的Au@PtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應16h。使巰基DNAl與AuOPtNPs連接起來。最後在15000轉速下，離心30min，得到紅色沉澱，並用10mM，pH8.0的磷酸緩衝溶液洗滌三次，分散在lOmM，pH8.0的磷酸緩衝溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針，4°C避光保存。[0049]1.2.3電化學傳感器的製備[0050]金電極的預處理[0051]金電極經0.05μm的a-Al2O3拋光粉拋光後，用二次蒸餾水衝洗乾淨，並在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹乾。採用三電極系統檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3[Fe(CN)6]溶液中，設置電壓為O~0.8V，對金電極進行循環伏安(CV)掃描。若氧化還原電流峰在O~1000mV內，則已說明電極表面已被處理好。否則重新處理，直至符合要求為止。測完後，用二次水衝洗電極，吹乾電極表面，備用。首先取10μL製備的AuNPs滴塗在金電極表面，得金納米粒子修飾金電極(AuNPs/GE)，置於避光處自然晾乾。[0052]發卡DNA的預處理[0053]取一定量的10-6Μ的巰基DNA4(或DNA3)於2mL離心管中，置於95°C恆溫水浴槽中加熱5min，取出後立即置於冰水中冷卻Imin即得到發卡DNA。[0054]電化學傳感器的製備[0055]取10μL上述發卡DNA3滴塗在AuNPs/GE表面，4°C自組裝24h，接著取10μLKT4M的巰基乙醇封閉，待電極幹後用IOmM的磷酸緩衝溶液衝洗兩次，得電化學傳感器。[0056]電化學測定目標DNA[0057]設計一組濃度梯度的目標DNA2，分別滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h後，取10μL發卡DNA4滴加到電極表面，37°C下孵育4h，然後用10mM，pH8.0的磷酸緩衝溶液衝洗兩次。最後，取IOyL製備的電化學探針滴加到電極表面，繼續孵育lh。然後利用循環伏安法或DPV測得電流強度，根據目標DNA2濃度與電流強度關係作圖得標準曲線，並根據標準曲線計算線性回歸方程。[0058]將含目標DNA2的樣品滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h後，取10μL發卡DNA4滴加到電極表面，37°C下孵育4h，然後用lOmM，pH8.0的磷酸緩衝溶液衝洗兩次。最後，取1yL製備的電化學探針滴加到電極表面，繼續孵育lh。然後利用循環伏安法或DPV測得電流強度，根據電流強度，再利用線性回歸方程計算樣品中目標DNA2含量。[0059]並採用標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為97.0-106.0%，測定結果見表1，本發明的方法在目標DNA檢測中具有精密度高的特點。[0060]本發明是基於目標DNA的循環利用機制研製了一種高靈敏檢測DNA的新型電化學傳感器。研製的傳感器具有如下優勢:金-鉬納米粒子為載體負載硫堇為探針克服了探針易脫落和電化學信號不穩定的缺陷；目標DNA的循環使信號得到放大，設計的電化學傳感器具有高穩定性、高靈敏度特點。因此，所設計的電化學傳感器在構建檢測DNA的研究方法中體現出良好的發展前景。表1.含目標DNA2樣品分析測定結果【權利要求】1.一種信號放大技術電化學傳感器檢測DNA的方法，包括以下步驟:(1)電化學探針製備方法其特徵在於:(a)取2mL的離心管，加入2~30μLDNAl和2~30μLρΗ8.2的50mM的Tris-HCl緩衝溶液和10μLTCEP反應lh，用以活化巰基；然後，另取2mL離心管依次加入ImL金-鉬納米粒子和100~2000μL硫堇溶液反應0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上；(b)將吸附了硫堇的金-鉬納米粒子加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應16h,使巰基DNAl與金-鉬納米粒子連接起來；最後在15000轉速下，離心30min，得到紅色沉澱，並用lOmM，pH8.0的磷酸緩衝溶液洗滌三次，分散在ImLlOmM的pH8.0的磷酸緩衝溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針；(2)金電極的預處理:金電極經0.24!11，0.034111，0.054111的a-Al2O3拋光粉拋光後，用二次蒸餾水衝洗乾淨，並在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹乾備用；(3)金納米粒子修飾金電極製備:首先取2~30μLAuNPs溶液滴塗在金電極表面，得金納米粒子修飾金電極(AuNPs/GE)，置於避光處自然晾乾；(4)發卡DNA的預處理:取一定量的1.0XKT4M~1.0X10-7Μ的巰基DNA4(或DNA3)於2mL離心管中，置於95°C恆溫水浴槽中加熱5min，取出後立即置於冰水中冷卻Imin即得到發卡DNA；(5)電化學傳感器的製備:取2~30μL上述預處理後的發卡DNA3滴塗在AuNPs/GE表面，4°C自組裝24h;接著取IOyLlO-4M的巰基乙醇滴於電極表面，反應30min，然後用IOmM的磷酸緩衝溶液衝洗兩次，即得電化學傳感器；(6)標準曲線的繪製:取一組濃度梯度的目標DNA2，分別滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h後，取101^發卡0嫩4滴加到電極表面，371:下孵育411，然後用10mM，pH8.0的磷酸緩衝溶液衝洗兩次；最後，取10μL製備的電化學探針滴加到電極表面，繼續孵育Ih；然後利用循環伏安法或DPV測得電流強度，根據目標物濃度與電流強度的關係作圖得標準曲線，並根據標準曲線計算線性回歸方程；(7)樣品測定:將含目標DNA2的樣品滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h後，取10μL發卡DNA4滴加到電極表面，37°C下孵育4h，然後用10mM，pH8.0的磷酸緩衝溶液衝洗兩次；最後，取10μL製備的電化學探針滴加到電極表面，繼續孵育Ih;然後利用循環伏安法或DPV測得電流強度，根據電流強度，再利用線性回歸方程計算樣品中目標DNA2含量。2.根據權利要求1的測定目標DNA的方法，其特徵在於所述的DNA序列如下:所述的DNAl的部分序列為:5'-TTTTTTATTCGATCCGGTGCTCTTATGCCC-HS-3'；所述的DNA2的部分序列為:5』-CAATAACTACCGGGCATTACTGGCCTT-3』；所述的DNA3的部分序列為:5』-SH-C6-AAAGCCAGTAATGCCCGGTAGTTATTCCATCGTGTACAATAACTACCGGGCATAAGAGCACCCTTGTAC-3』；所述的DNA4的部分序列為:5』-TAGTTATTGTACACGATGGAATAACTACCGGGCATCCATCGTGTAC-3，；3.根據權利要求1所述的電化學傳感器在檢測DNA含量中的應用。【文檔編號】G01N27/26GK104020198SQ201410272431【公開日】2014年9月3日申請日期:2014年6月18日優先權日:2014年6月18日【發明者】混旭,柏莉,劉芳,徐長旺申請人:青島科技大學