習慣性流產遺傳檢測試劑盒及其應用的製作方法

2023-04-27 21:57:06

專利名稱：習慣性流產遺傳檢測試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測個體習慣性流產遺傳易感性的試 劑盒，通過同時檢測與習慣性流產密切相關的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4基因(CTLA4)、腫瘤壞死因 子-a基因(TNF-a)、白細胞介素-6基因(IL-6)、 5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)的單核苷酸 多態性位點基因型來評估個體習慣性流產遺傳易感性。
背景技術：
妊娠不足28周、胎兒體重不足1000g而終止者稱為流產(Abortion)。孕12周前終止者成為早期流 產，孕12周至不足28周終止者成為晚期流產。其中，自然因素導致的流產稱為自然流產(Spontaneous abortion, miscarrage)。自然流產率佔全部妊娠的10% 15%，其中，80%為早期流產。
習慣性流產指連續發生三次或三次以上自然流產。其發生率約佔妊娠總數的1%，佔自然流產數的15 %。習慣性流產的病因極為複雜，染色體異常、解剖因素、內分泌異常、免疫因素、血型不合、感染甚至 精神因素等均可導致習慣性流產的發生。其中，常見原因有胚胎染色體異常、免疫因素異常、甲狀腺功能 低下、子宮畸形或發育不良、宮頸粘連、宮頸內口鬆弛等。
習慣性流產是一種複雜的多基因疾病，從根本上講是遺傳因素和環境因素交互作用的結果，是基因在 環境誘導下的異常表達所致。因此，從遺傳角度尋找和確定與習慣性流產相關的易感基因或致病基因，就 可以從根本上闡明其發病機制，不僅能夠為診療方案的確定提供輔助支持，還能對易感人群進行提示，使 其進行有效預防，降低習慣性流產的發生
目前，涉及習慣性流產的一些基因，已經被很好的進行研究。其作用機制、生化功能、信號通路、調 控、轉錄等等方面都有明確可靠的研究結果；研究手段、方法、儀器設備和試劑等都己經發展到了一個相 當的高度。目前，經證實並且機理研究清楚的與抗氧化能力密切相關的基因有細胞毒性T淋巴細胞相關抗 原4基因(CTLA4)、腫瘤壞死因子-a基因(TNF-a)、白細胞介素-6基因(IL-6)、 5， 10-亞甲基四氫葉酸 還原酶基因(MTHFR)。
CTLA4基因位於人類染色體2q33，編碼特異性受體，並表達於T淋巴細胞表面，是一種T細胞活化的 抑制性調節因子。CTLA4基因對調節母-胎之間的免疫耐受發揮著重要的作用。rs231775 (A49G)是位於 CLTA4基因第1外顯子上的一個A/G單核苷酸多態性位點，此多態性導致CTLA4 mRNA表達顯著下降，使得 CTLA4分子對免疫信號的下調作用降低，從而使免疫信號的調節失去控制。研究發現，攜帶M基因型的習 慣性流產患者同AG和GG基因型的患者比較，能產生高水平的IgE抗體，AA基因型被認為主要介導了 TH2 為主的免疫反應。由此可以推測，習慣性流產患者中高頻率分布的等位基因G和基因型GG,與TH2免疫反 應降低有關，由此打破了母-胎界面TH1/TH2的免疫平衡，從而引起對宮內胎兒有害的免疫反應，是遺傳 風險基因型。
腫瘤壞死因子-a (TNF-a)是一種主要由單核-吞噬細胞產生的單核因子，TNF-a作為具有多種生物學 活性的細胞因子也參與正常妊娠過程中的多種生物學功能的調節，妊娠期適量的TNF-a能促進婦女能量代 謝及胚胎發育，提高孕激素及絨毛膜促性腺激素的合成，並且能刺激細胞滋養層生成尿激酶型血漿素原激 活劑(uPA)，有利於蛻膜細胞外基質降解及胎盤植入，對妊娠維持有重要作用。經研究發現，正常早孕婦 女血清中TNF-a明顯低於正常非孕婦女，而反覆流產組血清中的TNF-a明顯高於正常早孕組，其中難免 流產組明顯高於先兆流產組。因此認為，在妊娠期TNF-a分泌受到抑制，而TNF-a的高水平表達與反覆 流產相關，可作為預測流產的指標。rsl800629和rsl799724均為位於TNF- a基因啟動區G/A單核苷酸多 態性位點，A等位基因會增加TNF-ci的轉錄和分泌，而TNF-a水平的升高將增加習慣性流產的風險，因此 這兩個位點的A等位基因為風險基因型。
白細胞介素-6 (IL-6)是一種多功能細胞因子，在正常妊娠婦女的血清及羊水中均存在著一定量的 IL-6，至妊娠後期及分娩前IL-6水平明顯升高。妊娠後期IL-6的急劇升高與腎移植中的排斥反應相似， 是母體對胎兒的一種排斥反應，在妊娠期間，母體的免疫機制受到抑制，在妊娠末期這種抑制被解除，出 現排斥反應，表現為各種細胞因子的出現。研究發現正常早孕婦女血清中IL-6水平與正常非孕婦女無明顯差異，反覆流產組血清中IL-6明顯高於正常早孕組，其中難免流產組明顯高於先兆流產組。因此認為， 高水平的IL-6與反覆流產相關，可作為預測流產的指標。rs1800796是位於IL-6啟動子區域的一個G-572C 單核苷酸多態性位點，與IL-6的表達相關。研究表明，攜帶風險基因型G時IL-6表達增加，造成免疫應 答的紊亂，增加習慣性流產的風險。
5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝的關鍵酶，現有研究顯示，葉酸與母胎的健康密切 相關。在受精卵發育、細胞分裂生長十分旺盛時，孕婦新陳代謝活躍，蛋白質合成加速，葉酸的需要量陡 然劇增。如果孕婦體內紅細胞葉酸貯存量不足，胎盤發育不良就會自發流產。目前，已發現MTHFR上存在 一系列的多態性位點，這些位點通過改變MTHFR的表達或者活性，進而阻礙葉酸代謝，增加習慣性流產的 風險。rsl801133是位於MTHFR基因第5外顯子上的C677T單核苷酸多態性位點，引起MTHFR基因編碼的 蛋白第222個胺基酸由Ala[A]變為Val[V]。研究表明，攜帶T等位基因時，蛋白的熱敏感性增加，MTHFR 活性降低。rsl801131是位於第一號染色體MTHFR基因第八個外顯子上第1298核苷酸的一個A/C單核苷酸 多態性位點，攜帶C等位基因時，會引起MTHFR基因編碼的蛋白第429個胺基酸由Glu變為Ala。現有研 究顯示，攜帶這2個MTHFR多態性位點的風險基因型時都會降低MTHFR的活性，導致葉酸代謝及同型半胱 氨酸清除過程受阻，促進了血栓形成傾向，增加了習慣性流產的發生風險。

發明內容
基於細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4基因(CTLA4)、腫瘤壞死因子-o基因(TNF- a )、白細胞介素-6 基因(IL-6)、 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上的6個SNPs位點多態性可用來評估個體習慣 性流產遺傳易感性的基礎上，本發明提供一種檢測個體習慣性流產遺傳易感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測CTLA4基因上rs769214號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性螢光探針對； 檢測TNF-a基因上rsl800629號和rsl799724號SNPs多態性基因型的特異性引物對及特異性螢光探 針對；
檢測IL-6基因上rsl800796號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性螢光探針對； 檢測MTHFR基因上rsl801133號和rsl801131號SNPs多態性基因型的特異性引物對及特異性螢光探 針對；
螢光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩衝液、去離子水等)。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對CTLA4基因上rs769214號SNP位點、TNF-a基因上rs1800629 號和rsl799724號SNP位點、IL-6基因上rsl800796號SNP位點、MTHFR基因上rs薩133號和rs藤131 號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這6個SNPs位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領 域技術人員能夠輕易完成的，特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。
本試劑盒中所述的特異性螢光探針對是指針對CTLA4基因上rs769214號SNP位點、TNF-a基因上 rsl800629號和rsl799724號SNP位點、IL-6基因上rsl800796號SNP位點、MTHFR基因上rs薩133號 和rsl801131號SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出這6個SNPs位點基因型的Taqman 探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的，特異性螢光探針對可用常規的探針合成技術進 行合成。
本發明試劑盒的組分和含量包括
6nl 10 X螢光定量PCR反應緩衝液，
0.6nl 25mM dNTP混合液，
3.6^1 25mM MgCV溶液，
0.15^1 (5units/nl) T叫DNA聚合酶，
20nM特異性引物對每條引物各0.225nl，
10nM特異性螢光探針對每條探針各0. 25^1,
去離子水31.95nl。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:螢光定量PCR反應
使用檢測試劑盒，進行6次獨立的螢光定量PCR反應，每次反應的體系為總體積1(^1，包含濃度為 20ng/nl的DNA模板2^1、 lpl 10 X螢光定量PCR反應緩衝液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 6|ui 25mMMgCl2 溶液、t).025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20nM的有義引物和反義引物各0. 225|il、 lO[iM的帶VIC 螢光探針和帶FAM螢光探針各0. 25^1，去離子水5. 325^1。
在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為5(TC、 2分鐘，95'C、 IO分鐘，進行60個循環的95°C、 30秒， 6(TC、 l分鐘。反應結束後在螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量。
步驟3: SNP基因型分析
根據試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。
熟悉螢光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識螢光定暈PCR儀上顯示的最終樣品螢光量，根 據不同序列探針VIC和FAM螢光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
實施例2.應用檢測試劑盒進行個體習慣性流產遺傳易感性檢測的服務 步驟l: DNA提取
由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，釆用矽膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的CTLA4基因上rs769214號SNP位點、TNF-a基 因上rsl800629號和rsl799724號SNP位點、IL-6基因上rsl800796號SNP位點、MTHFR基因上rsl801133 號和rsl801131號SNP位點分別進行螢光定量PCR檢測，確定這6個SNPs位點的基因型。
步驟3:個體習慣性流產遺傳易感性的分析
通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具個體習慣性流產遺傳易感性的分析報告單。報告中詳細說 明了被檢測者習慣性流產遺傳風險的高低，並由醫師向被檢者詳細說明和解讀個體習慣性流產遺傳易感性 分析報告單。
權利要求
1. 一種檢測個體習慣性流產遺傳易感性的試劑盒，其特徵在於包括同時檢測細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4基因基因上rs769214號SNP位點、腫瘤壞死因子-α基因上rs1800629號和rs1799724號SNP位點、白細胞介素-6基因上rs1800796號SNP位點、5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號和rs1801131號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性引物對是指針對細胞毒性T淋巴細胞 相關抗原4基因基因上rs769214號SNP位點、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號和rsl799724號SNP 位點、白細胞介素-6基因上rsl800796號SNP位點、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號和 rsl801131號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這6個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性螢光探針對是指針對細胞毒性T淋巴 細胞相關抗原4基因基因上rs769214號SNP位點、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號和rsl799724號 SNP位點、白細胞介素-6基因上rsl800796號SNP位點、5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133 號和rsl801131號SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出這6個SNPsf點基因型的Taqman 探針對。 '
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括6nl 10 X螢光定量PCR反 應緩衝液、0.6|il 25mM dNTP混合液、3. 6^1 25mM MgCh溶液、0. 15pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM特異性引物對每條引物各0. 225^1、 lOnM特異性螢光探針對每條探針各0. 25pl、去離子水31. 95^1。 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
5. 權利要求l所述的試劑盒在檢測個體習慣性流產遺傳易感性上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測個體習慣性流產遺傳易感性的試劑盒及其應用。該試劑盒包括同時檢測細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4基因(CTLA4)、腫瘤壞死因子-α基因(TNF-α)、白細胞介素-6基因(IL-6)、5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上的6個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及特異性螢光探針對、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒可用於評估個體習慣性流產遺傳易感性。
文檔編號G01N21/00GK101470071SQ20071017284
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月24日 優先權日2007年12月24日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司